銅藻巖藻聚糖硫酸酯的結(jié)構(gòu)組成及降血脂作用

劉雯，車心怡，馬志超，劉舒，任丹丹，汪秋寬，何云海*，王俊峰

(1.大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，國家海藻加工技術(shù)研發(fā)分中心，遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點實驗室，遼寧 大連 116023；2.海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心(大連工業(yè)大學(xué))，遼寧 大連 116034)

銅藻(Sargassumhorneri)隸屬于褐藻門(Phaeophyta)墨角藻目(Fucales)馬尾藻科(Sargassaceae)馬尾藻屬(Sargassum)，是中國暖溫帶海域淺海區(qū)海藻場中的大型褐藻[1]，主要分布在中國遼東半島、福建、浙江和廣東等近海海域。銅藻藻株高大、枝葉繁茂，藻體為黃褐色，呈樹狀，最高可達(dá)5 m[2]，其不僅是優(yōu)質(zhì)的藻膠工業(yè)原料，而且在醫(yī)藥、食品領(lǐng)域及有機(jī)肥料等行業(yè)也有應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，銅藻是修復(fù)海底藻場和海洋生態(tài)環(huán)境的重要物種之一[3-4]，其市場前景十分廣闊[5]。

銅藻不僅富含褐藻膠、膳食纖維和礦物質(zhì)等成分，還含有較高的巖藻聚糖硫酸酯(fucoidan)、巖藻黃素(fucoxanthin)和褐藻多酚(phlorotannins)等功能活性物質(zhì)[6-9]，而且具有消炎止痰、清熱健脾等藥用功能，因此，其具有較高的研究價值[10-11]。目前，巖藻聚糖硫酸酯已成為褐藻活性物質(zhì)的研究熱點。從銅藻中提取的巖藻聚糖硫酸酯具有抗氧化、抗炎和抗衰老等多種生物活性[12-14]。魏雙艷等[15]研究表明，從銅藻中分離的多糖對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用。Wen等[16]研究發(fā)現(xiàn)，從銅藻中分離的多糖對脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7巨噬細(xì)胞具有體外抗炎作用。

近年來，中老年人高脂血癥等疾病的發(fā)病率明顯上升，如冠心病和動脈硬化等，而市場上有效的降血脂藥物服用后大多會產(chǎn)生副作用，損傷肝組織，且需要定期檢查肝功能，因此，迫切需要開發(fā)低毒無害的降血脂藥物。有研究表明，從褐藻中提取的巖藻聚糖硫酸酯具有較好的降脂效果[17]，但目前對銅藻巖藻聚糖硫酸酯降血脂活性的研究鮮見報道。本研究中，以銅藻為原料，使用復(fù)合酶解法提取巖藻聚糖硫酸酯，并對其單糖組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，通過灌胃小鼠建立其高脂模型，探究了銅藻巖藻聚糖硫酸酯的體內(nèi)降血脂作用，以期為低毒無害的降血脂藥物的開發(fā)提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：銅藻采自遼寧省大連市黑石礁海域，去除附生植物和沙粒，在海水中蕩洗干凈，自然干燥后密封包裝，于-18 ℃冷柜中保存。

試驗動物：試驗用SPF級昆明種(KM)雄性小鼠，購自大連醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心(動物生產(chǎn)許可證號：SYXK-2013-0006)。

藥品與試劑：蛋白酶(北京索萊寶科技有限公司)；纖維素酶、果膠酶(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司)；高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和總超氧化物歧化酶(T-SOD)等測定試劑盒(南京建成生物工程公司)；脂必妥片(成都地奧九鴻制藥廠)；其他試劑均為分析純。

儀器設(shè)備：LDS-2A型離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)；SC210A-230型低溫真空濃縮機(jī)(美國TheretoSavant公司)；安捷倫 1260 型高效液相色譜儀(美國 Agilent 公司)；Nicolet-470 型紅外光譜儀(美國 Nicolet 公司)；Jim-XerII型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 銅藻巖藻聚糖硫酸酯的制備 采用復(fù)合酶解法[18]提取巖藻聚糖硫酸酯(以下簡稱“SF”)。稱取解凍后的銅藻樣品，加入15倍的水，使用攪碎機(jī)搗碎，加入纖維素酶、果膠酶和蛋白酶，50 ℃下水浴復(fù)合酶解50 min，在98 ℃水浴中抽提3 h，冷卻至室溫，離心(5 000 r/min，15 min)；棄上清液后，向沉淀中加入95%(體積分?jǐn)?shù)，下同)的食用乙醇，使溶液中的乙醇含量為20%，醇沉過夜，離心(5 000 r/min，15 min)；再棄上清液，加入95%食用乙醇使溶液中乙醇含量為60%，醇沉過夜，此時會產(chǎn)生白色沉淀，離心(5 000 r/min，15 min)，棄上清液，將沉淀冷凍干燥，得到巖藻聚糖硫酸酯粗品。

1.2.2 總糖含量的測定 使用苯酚-硫酸法測定總糖含量[19]。按照L-巖藻糖與D-半乳糖質(zhì)量比為3∶1制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品質(zhì)量濃度為10 mg/mL，測定吸光度值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總糖含量。

1.2.3 硫酸基團(tuán)含量的測定 用鹽酸水解-硫酸鋇比濁法測定硫酸基團(tuán)含量[20]。先繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品酸解后測定吸光度值，然后按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中硫酸基團(tuán)的含量。

1.2.4 傅里葉紅外光譜分析 準(zhǔn)確稱取SF粗提物2 mg，干燥條件下加入100 mg溴化鉀研磨，壓制成透明均勻的薄片，用Nicolet-470型紅外光譜儀測定，在4 000～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.2.5 單糖組成的測定

樣品水解：準(zhǔn)確稱取干燥恒重的SF粗品20 mg置于消化管中，溶脹過夜，加入1.5 mL濃度為8 mol/L的TFA溶液，混勻，水解6 h，冷卻至室溫，4 ℃下過夜，用濃度為4 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH至6～7，離心取上清液備用。

樣品衍生化：吸取上清液200 μL置于1.5 mL 離心管中，加入200 μL濃度為3 mol/L NaOH 溶液，漩渦振蕩，再加入200 μL濃度為0.5 mol/L的PMP甲醇溶液，混勻，70 ℃下水浴90 min，冷卻至室溫；加入200 μL濃度為0.3 mol/L的醋酸溶液和200 μL濃度為0.1 mol/L的 KH2PO4溶液，混勻后加入1 mL氯仿，漩渦振蕩，反復(fù)萃取3次，利用孔徑為0.45 μm 的水系膜過濾，使用高效液相色譜儀進(jìn)行分析。

色譜條件：Agilent ZORBAX Eclipse XDB C-18 色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；柱溫為30 ℃；流速為1 mL/min；檢測波長為250 nm；進(jìn)樣體積為20 μL。流動相A：15%乙腈(體積分?jǐn)?shù))+50 mmol/L KH2PO4(pH 6.0)。流動相 B：40%乙腈(體積分?jǐn)?shù))+50 mmol/L K2HPO4(pH 6.0)。進(jìn)樣程序參數(shù)：0 min 100% A→10 min 85% A→55 min 50% A →65 min 100% A。

1.2.6 動物試驗

1)高脂飼料的制作。使用10%的豬油、2%的膽固醇、0.5%的膽鹽和87.5%的基礎(chǔ)飼料制作高脂飼料。將基礎(chǔ)飼料粉碎后與膽固醇、膽鹽逐步混合均勻后，放入斬拌機(jī)中一邊攪拌一邊加水，緩慢倒入加熱融化后的豬油，攪拌均勻后擠壓制作成型，烘干，常溫下密封保存待用。

2)試驗設(shè)計及日常管理。將60只健康SPF級KM小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，隨機(jī)分成6個組，每組10只，分為空白組、模型組、陽性對照組，以及SF低、中和高劑量組(記為SFL、SFM、SFH)，具體分組和灌胃情況如表1所示。試驗開始后每天記錄小鼠體質(zhì)量，每天按表1中的劑量進(jìn)行灌胃，連續(xù)灌胃28 d。飼養(yǎng)期間，溫度為(25±5)℃，相對濕度為(65%±5%)，光照周期為12 L∶12 D。

表1 KM小鼠試驗分組與飼養(yǎng)灌胃劑量Tab.1 Grouping of test KM mice with feeding gavage dose

末次灌胃小鼠后禁食12 h，摘眼球取血，犧牲小鼠后立即進(jìn)行解剖，取其肝臟和脾臟在生理鹽水中充分漂洗，用濾紙吸干水分后稱量其質(zhì)量，并于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于后續(xù)指標(biāo)測定。

1.2.7 生化指標(biāo)的測定與計算

1)臟器指數(shù)。計算公式為

脾臟(肝臟)指數(shù)=脾臟質(zhì)量(肝臟質(zhì)量)/

小鼠質(zhì)量×100%。

(1)

2)血清血脂指標(biāo)。常溫下將抽取的血液靜置15 min，以3 000 r/min離心15 min，分離的血清在 4 ℃下保存。使用相應(yīng)試劑盒測定小鼠血清中HDL-C、TC、TG和LDL-C含量。

3)肝臟酶活指標(biāo)。取小鼠肝臟組織，按質(zhì)量(g)與體積(mL)比為1∶9加入生理鹽水，使用組織勻漿機(jī)進(jìn)行冰水浴勻漿，離心后取上清液，使用相應(yīng)試劑盒測定小鼠肝臟中MDA、GSH-Px、T-SOD和NO的含量。

4)動脈粥樣硬化指數(shù)AI(IA)和極低密度脂蛋白VLDL-C。計算公式為

IA=cTC/cHDL-C，

(2)

cVLDL-C=cTG×0.2。

(3)

其中：cTC、cHDL-C分別為TG和HDL-C的濃度(mmol/L)；cVLDL-C、cTG分別為VLDL-C和TG的濃度(mmol/L)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，并采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan法進(jìn)行組間多重比較。顯著性水平設(shè)為0.05，極顯著性水平設(shè)為0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅藻巖藻聚糖硫酸酯的理化性質(zhì)

使用復(fù)合酶解法提取SF的提取率為3.68%±0.33%，總糖含量為42.63%±0.96%，硫酸基團(tuán)含量為13.35%±0.35%，純度為55.98%(總糖含量與硫酸基團(tuán)含量之和)。

2.2 銅藻巖藻聚糖硫酸酯的紅外光譜分析

圖1 銅藻巖藻聚糖硫酸酯的紅外光譜分析Fig.1 Structural analysis of Sargassum horneri fucoidan by IR

2.3 銅藻巖藻聚糖硫酸酯的單糖組成

使用PMP柱前衍生高效液相色譜法進(jìn)行分析，以甘露糖、巖藻糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，通過對照樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間，根據(jù)峰面積計算樣品的摩爾比。從表2可見，SF主要由巖藻糖、半乳糖和木糖構(gòu)成，含量分別為39.83%、28.37%和14.62%，半乳糖醛酸(GalUA)未檢出。

表2 銅藻巖藻聚糖硫酸酯的單糖組成Tab.2 Monosaccharide composition of Sargassum horneri fucoidan %

2.4 SF對小鼠體質(zhì)量的影響

從表3可見：喂養(yǎng)初期的小鼠體質(zhì)量(SFL組除外)無顯著性差異(P>0.05)；灌胃4周后，與空白組相比，模型組小鼠的體質(zhì)量極顯著升高(P<0.01)，證明高脂模型造模成功；與模型組相比，各SF劑量組體質(zhì)量均極顯著降低(P<0.01)。這表明，各劑量的SF多糖具有調(diào)節(jié)小鼠體質(zhì)量的作用，且降低小鼠體質(zhì)量的效果要高于藥物，其中SFH組效果最好。

表3 銅藻巖藻聚糖硫酸酯對小鼠體質(zhì)量的影響Tab.3 Effects of Sargassum horneri fucoidan on body weight in mice

2.5 SF對小鼠臟器指數(shù)的影響

從表4可見：與空白組相比，模型組的肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，各SF劑量組和藥物組肝臟指數(shù)均顯著降低(P<0.05)，SFM和SFH組脾臟指數(shù)顯著降低(P<0.05)，其中，SFH抑制肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)升高的效果優(yōu)于藥物，這與小鼠體質(zhì)量的結(jié)果一致。

表4 銅藻巖藻聚糖硫酸酯對小鼠臟器指數(shù)的影響Tab.4 Effects of Sargassum horneri fucoidan on organ index in mice %

2.6 SF對小鼠血脂指標(biāo)的影響

從表5可見：與空白組相比，模型組的小鼠血清中TC、TG和LDL-C水平極顯著升高(P<0.01)，HDL-C水平極顯著降低(P<0.01)，說明喂食高脂飼料可以極顯著影響小鼠血清的血脂指標(biāo)，證明模型造模成功；與模型組相比，藥物組血清中僅LDL-C水平顯著降低(P<0.05)；各SF劑量組血清中TC、TG和LDL-C水平均顯著降低(P<0.05)，HDL-C水平均顯著升高(P<0.05)。這表明，灌胃一定劑量的SF能夠較好地調(diào)節(jié)高脂小鼠的血清血脂指標(biāo)，對高脂血癥的改善有重要作用，且改善效果比藥物要好。

表5 銅藻巖藻聚糖硫酸酯對小鼠血清生化指標(biāo)的影響Tab.5 Effects of Sargassum horneri fucoidan on serum biochemical indices of mice mmol/L

2.7 SF對小鼠肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

從表6可見：與空白組相比，模型組MDA含量極顯著升高(P<0.01)，GSH-Px、SOD活力極顯著降低(P<0.01)，證明高脂模型造模成功，表明高熱量飲食會增加機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)；與模型組相比，藥物調(diào)節(jié)肝臟MDA含量和SOD活力的能力并不顯著(P>0.05)，但可以顯著升高GSH-Px活力(P<0.05)；SF干預(yù)后能調(diào)節(jié)各項抗氧化指標(biāo)，與模型組相比，SFL調(diào)節(jié)作用不明顯，而SFM能顯著降低MDA含量和提高GSH-Px活力(P<0.05)，SFH能顯著降低MDA含量和提高GSH-Px、SOD活力(P<0.05)；各SF劑量組NO水平均顯著提高(P<0.05)。這表明，SF可以通過增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)抗氧化物質(zhì)的活性，并呈劑量依賴性影響高脂造成的機(jī)體抗氧化能力紊亂，提高小鼠的抗氧化能力，預(yù)防進(jìn)一步的肝臟脂肪病變。

表6 銅藻巖藻聚糖硫酸酯對小鼠肝臟氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響Tab.6 Effects of Sargassum horneri fucoidan on markers of oxidative stress in mouse liver

2.8 SF對小鼠AI和VLDL-C的影響

從表7可見：相比于空白組，模型組AI指數(shù)顯著升高(P<0.05)，超過正常值(AI<4)，與模型組相比，藥物組AI指數(shù)顯著降低到正常值范圍內(nèi)(P<0.05)，而灌胃SF的各劑量組AI指數(shù)均顯著下降(P<0.05)，且SF降低AI指數(shù)的效果均優(yōu)于藥物；與空白組相比，模型組肝臟VLDL-C濃度極顯著升高(P<0.01)，與模型組相比，藥物組VLDL-C濃度略有下降(P>0.05)，而灌胃SF的各劑量組VLDL-C濃度均顯著降低(P<0.05)。這表明，灌胃一定劑量的SF可以有效抑制肝臟中脂肪蓄積，且抑制效果優(yōu)于藥物。

表7 銅藻巖藻聚糖硫酸酯對小鼠AI、VLDL-C的影響Tab.7 Effects of Sargassum horneri fucoidan on AI and VLDL in mice

3 討論

3.1 銅藻巖藻聚糖硫酸酯的結(jié)構(gòu)組成特征

從不同種類的褐藻中提取的巖藻聚糖硫酸酯結(jié)構(gòu)有所差異。本研究表明，銅藻巖藻聚糖硫酸酯是一種含有β-吡喃糖環(huán)的硫酸多糖，硫酸基團(tuán)在C—4的位置取代，主要由巖藻糖、半乳糖和木糖等單糖構(gòu)成。武蘇鳳[21]從海帶中提取的巖藻聚糖硫酸酯，主要由巖藻糖、半乳糖和甘露糖等單糖構(gòu)成，紅外光譜分析表明，其是硫酸基取代位置在C—4位上的高度硫酸化的半乳巖藻聚糖；鄭桂青[22]使用水提醇沉法從裙帶菜中提取的多糖，主要由葡萄糖和木糖等單糖構(gòu)成，紅外光譜掃描發(fā)現(xiàn)，裙帶菜多糖含有一定的硫酸基團(tuán)和羧基，且含有β-吡喃型糖苷。本研究結(jié)果與劉佳[23]、李偉[24]研究的銅藻多糖結(jié)構(gòu)結(jié)果較為一致，單糖組成表明，銅藻多糖以巖藻糖為主，這與其他褐藻多糖有差異，而多糖的結(jié)構(gòu)對生物活性有較大的影響，因此，可能表現(xiàn)出特異性的生物活性和藥理作用。

3.2 銅藻巖藻聚糖硫酸酯的降血脂作用

小鼠長期攝食高脂飼料可導(dǎo)致其臟器脂質(zhì)積累及病變，臟器指數(shù)可以直觀反映小鼠肝臟、脾臟的健康程度[25]。本研究表明，銅藻巖藻聚糖硫酸酯具有較好的降血脂作用，小鼠試驗發(fā)現(xiàn)，灌胃銅藻巖藻聚糖硫酸酯能有效地調(diào)節(jié)機(jī)體質(zhì)量、臟器質(zhì)量，減少脂肪沉積。本研究中，通過分析高脂小鼠血清指標(biāo)的變化，證明一定劑量的SF干預(yù)能顯著改善機(jī)體的脂質(zhì)代謝紊亂、脂肪蓄積或脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)代謝途徑異常。喂食小鼠高脂飲食在形成高脂血癥的同時，由于脂質(zhì)在體內(nèi)的過度蓄積，會導(dǎo)致小鼠的抗氧化體系失調(diào)[26]，機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的紊亂則會導(dǎo)致高脂血癥進(jìn)一步發(fā)展，對肝臟產(chǎn)生影響，從而造成脂肪肝，或者肝臟等器官進(jìn)一步的脂肪病變[27]。本研究中，通過SF的干預(yù)能顯著降低高脂小鼠肝臟中脂質(zhì)過氧化物MDA含量，升高SOD和GSH-Px活力以清除氧自由基和OH-自由基，有效地減少細(xì)胞膜脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)及氧化應(yīng)激帶來的損傷，同時灌胃SF還能提高機(jī)體NO水平，通過抑制炎癥因子來降低自由基濃度，從而減少高脂血癥并發(fā)炎癥的產(chǎn)生。AI被稱為動脈粥樣硬化指數(shù)，VLDL-C是極低密度脂蛋白，主要由肝細(xì)胞合成，是內(nèi)源性甘油三酯。本研究中，灌胃SF可以調(diào)節(jié)AI值到正常范圍內(nèi)，并可以顯著降低VLDL-C濃度，達(dá)到預(yù)防高脂血癥誘發(fā)心血管疾病的作用。

Jinhe等[28]研究表明，從墨角藻中提取的褐藻多糖能夠顯著降低高脂血癥小鼠血清中TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平，可以較好地調(diào)節(jié)血脂水平，改善動脈粥樣硬化。倪華等[29]研究表明，用一定劑量的海帶多糖灌胃高脂大鼠，能夠降低血清TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平和NO濃度，改善動脈粥樣硬化。唐茹萌等[30]研究表明，從裙帶菜中提取的多糖能夠抑制因高脂飲食導(dǎo)致的血清中TC、TG和LDL-C水平增加，升高HDL-C水平，提高小鼠肝臟抗氧化體系相關(guān)物質(zhì)的水平，降低肝臟MAD水平。本研究中，銅藻巖藻聚糖硫酸酯降血脂的結(jié)果與上述研究結(jié)果均一致。大量的研究表明，褐藻中的多糖及富含多糖的化合物均具有較好的降血脂作用，本研究中銅藻巖藻聚糖硫酸酯的結(jié)構(gòu)與其他褐藻多糖結(jié)構(gòu)有一定差異，包括單糖組成、硫酸基團(tuán)的含量、取代位置及官能團(tuán)構(gòu)成等，這都可能影響多糖的生物活性，因此，進(jìn)一步解析褐藻多糖結(jié)構(gòu)對探究其降血脂作用的機(jī)制具有重要意義。

本研究中，通過建立小鼠高脂模型，證實銅藻中巖藻聚糖硫酸酯能夠降低膽固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白含量，明顯改善高脂造成的血脂異常；降低體內(nèi)過氧化程度，提高NO水平。這表明，銅藻巖藻聚糖硫酸酯能有效地預(yù)防心血管疾病，具有很好的降血脂作用，但其降血脂作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

1)從銅藻中提取的巖藻聚糖硫酸酯提取率為3.68%，總糖含量為42.63%，硫酸基含量為13.35%，主要由巖藻糖、半乳糖和木糖構(gòu)成，是一種含有β-吡喃糖環(huán)的硫酸多糖，硫酸基團(tuán)在C—4的位置被取代。

2)銅藻巖藻聚糖硫酸酯能改善高脂小鼠體質(zhì)量和臟器指數(shù)，降低血清中TC、TG和LDL-C水平，升高HDL-C水平；降低小鼠肝臟中MDA含量，升高SOD、GSH-Px酶活力，提高NO水平，說明其能有效改善小鼠動脈粥樣硬化指數(shù)，具有良好的降血脂作用。