低魚粉飼料中添加植酸酶對凡納濱對蝦生長性能、腸道形態(tài)和免疫反應(yīng)的影響

龔舜蓮，馮森兒，張昕晨，謝詩瑋

(廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料實驗室，廣東 湛江 524088)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)又名南美白對蝦，具有生長迅速、營養(yǎng)價值高、抗病力強、易粗養(yǎng)、易運輸和加工出肉率高等優(yōu)點，其產(chǎn)量和養(yǎng)殖面積均居中國養(yǎng)殖對蝦的首位[1]。

魚粉蛋白含量高，富含水產(chǎn)養(yǎng)殖動物所需的必需氨基酸、高不飽和脂肪酸、礦物質(zhì)和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，是水產(chǎn)動物飼料中最重要的蛋白源之一。近年來，隨著中國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，作為對蝦飼料主要蛋白質(zhì)來源的魚粉價格正逐年攀升。尋求可代替魚粉的新型蛋白源迫在眉睫，植物蛋白源如豆粕、大豆?jié)饪s蛋白、棉籽濃縮蛋白等在凡納濱對蝦飼料中均呈現(xiàn)出較為理想的魚粉替代效果，但由于其中的抗?fàn)I養(yǎng)因子如植酸、大豆抗胰蛋白酶和硫葡萄糖苷含量高，以及氨基酸失衡等因素的影響，其過量添加會導(dǎo)致水產(chǎn)動物生產(chǎn)性能下降、免疫功能受損及腸道消化與吸收能力下降[2-4]。

植酸幾乎存在于所有的植物原料中，在一定條件下易與植物原料中的二價磷離子螯合形成植酸磷，很難被消化吸收，也可以與蛋白質(zhì)、維生素等結(jié)合形成不溶物，降低其利用和吸收效率[5]。近年來，隨著畜禽動物飼料中植酸酶應(yīng)用的不斷拓展，水產(chǎn)動物飼料中添加植酸酶的研究也不斷深入。研究表明，植酸能影響許多水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟動物如對蝦、羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)和虹鱒(Oncorhynchusmykiss)等的生長和消化吸收能力[6-8]，飼料中植酸酶的添加不僅能增加飼養(yǎng)動物的日增重和日采食量，降低餌料系數(shù)和死亡率，還能提高磷的利用率，減少飼料中無機磷的含量，從而減輕磷對養(yǎng)殖水體的污染[9]。凡納濱對蝦作為中國主要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，其飼料開發(fā)與應(yīng)用備受關(guān)注，但有關(guān)飼料中添加植酸酶對其生長性能及飼料利用影響的研究卻鮮見報道。本試驗中，研究了低魚粉飼料中添加植酸酶，對凡納濱對蝦生長性能、腸道形態(tài)、抗氧化能力及非特異性免疫的影響，以期為對蝦低魚粉飼料的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗在廣東省湛江東海島恒興南方海洋科技公司863基地進(jìn)行，試驗蝦由基地提供，為當(dāng)年同一批孵化的蝦苗。魚粉和魚油均從秘魯進(jìn)口，大豆?jié)饪s蛋白由益海嘉里集團(tuán)(北京)提供，血粉由愛不停蛋白質(zhì)飼料有限公司(北京)提供，其他原料均由廣州星星飼料有限公司提供。植酸酶(5 000 U/g)由廣東珠海溢多利有限公司提供，晶體氨基酸除蛋氨酸(德固賽，北京)外，均購于阿拉丁試劑公司(上海)。

1.2 方法

1.2.1 試驗飼料的配制 試驗前檢測主要原料的營養(yǎng)成分(表1)。試驗共配制3種飼料，其中高魚粉飼料含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的魚粉(HF)，另外兩種飼料均含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的魚粉(以大豆?jié)饪s蛋白、蝦粉、血粉、雞肉粉替代15%魚粉)，分別為低魚粉飼料(LF)和添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%的植酸酶(5 000 U/g)低魚粉飼料(LFP)，飼料配方如表2所示。

表1 主要試驗原料營養(yǎng)組成(干物質(zhì))Tab.1 Nutrition composition of the main experimental ingredients (dry matter) w/%

表2 試驗飼料配方Tab.2 Ingredients of the diets used in the experiment w/%

晶體氨基酸用10 g/kg(飼料)的羧甲基纖維素包被，溶入60 ℃水中攪拌均勻，直至無可見白色顆粒。全部飼料原料粉碎后過孔徑為245 μm的篩網(wǎng)，按照配方準(zhǔn)確稱重，在攪拌機中混合均勻，加入豆油、魚油和大豆卵磷脂混合，再加入40%的水混合均勻。然后用雙螺桿擠條機壓制成直徑為1.2 mm的條狀飼料，再用造粒機制成顆粒狀飼料，飼料成型之后在烘箱(70 ℃)中烘60 min后，將飼料風(fēng)干至水分含量低于10%，裝入塑料密封袋中，存放于-20 ℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 飼料營養(yǎng)成分的測定 按照GB/T 6435—2006、GB/T 6432—1994、GB/T 6433—2006和GB/T 6438—2007中的方法分別測定水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量(表3)。

表3 試驗飼料成分分析(干物質(zhì))Tab.3 Composition analysis of experimental diets(dry matter) w/%

1.2.3 試驗設(shè)計及養(yǎng)殖管理 試驗開始前，將試驗蝦暫養(yǎng)于1 000 L水族箱中，馴養(yǎng)前兩周投喂商品蝦苗飼料，第三周投喂高魚粉飼料。養(yǎng)殖系統(tǒng)為靜水水族箱養(yǎng)殖，試驗用水為沙濾海水。

馴養(yǎng)結(jié)束后，挑選規(guī)格一致、健康活潑、體質(zhì)量為0.43 g的蝦苗360尾進(jìn)行試驗，試驗設(shè)高魚粉飼料組(HF，對照)、低魚粉飼料組(LF)和添加植酸酶的低魚粉飼料組(LFP)，分別投喂3種試驗飼料，每個處理組設(shè)置4個重復(fù)，每個水族箱放30尾蝦苗。每天飽食投喂4次(7：00、12：00、17：00和21：00)，養(yǎng)殖周期為8周。前4周每4 d換水一次，每次換水量為30%，后4周每3 d換水一次，每次換水量為50%。整個試驗期間，水溫為26～30 ℃，鹽度為27～30，溶解氧>6.5 mg/L，氨氮<0.05 mg/L，pH為7.7～8.0，自然光照。

試驗期間每天記錄水溫，定時觀察對蝦攝食情況和剩料情況，及時用虹吸法吸取剩余飼料并調(diào)整投喂量，記錄每日的飼料投喂量和對蝦死亡情況。在飼養(yǎng)試驗的最后兩周收集糞便進(jìn)行分析；喂食1 h后，在每天的13：00和18：00收集兩次糞便，并于-20 ℃下保存。

1.2.4 生長指標(biāo)的測定與計算 試驗開始之前，隨機選取100尾左右蝦苗存放于-20 ℃冰柜中，用以分析初始常規(guī)營養(yǎng)組成。8周養(yǎng)殖試驗結(jié)束時，停止投喂24 h后，稱量每個養(yǎng)殖箱的對蝦總質(zhì)量，并記錄每箱的對蝦尾數(shù)。生長指標(biāo)計算公式為

GBW=(Wt-W0)/W0×100%,

(1)

RS=nt/n0×100%,

(2)

RSG=(lnWt-lnW0)/t×100%,

(3)

EF=(Wt-W0)/F,

(4)

IF=F/nt。

(5)

其中：GBW為增重率(%)；RS為存活率(%)；RSG為特定生長率(%·d-1)；EF為飼料效率；IF飼料攝入量(g/ind.)；W0、Wt分別為試驗蝦的初始體質(zhì)量(g)和終末體質(zhì)量(g)；t為 試 驗 時 間(d)；F為飼料總攝入量(g)；nt、n0分別為試驗結(jié)束和試驗開始時的對蝦數(shù)量(ind.)。

采用Y2O3指示劑法測定消化率，蛋白質(zhì)消化率(D)和干物質(zhì)消化率(D′)計算公式為

D=[1-(A′/A)×(B/B′)] ×100%,

(6)

D′=[1-(B/B′)] ×100%。

(7)

其中：A、A′分別為飼料和糞便中的蛋白質(zhì)含量(%)；B、B′分別為飼料和糞便中的Y2O3含量(%)。

1.2.5 樣品的采集與處理 試驗結(jié)束時，從每個水族箱中隨機選取15尾蝦，用丁香酚麻醉后，5尾全蝦樣品用于分析常規(guī)營養(yǎng)組成，3尾解剖取其肝胰腺用于測定肝體比，7尾用1 mL注射器從試驗蝦的頭胸甲后緣與第一腹節(jié)的連接處抽取血液。將血液樣品在4 ℃冰箱中過夜后，于4 ℃下以8 000 r/min離心10 min，取上清液置于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于酶活分析。將抽血后的試驗蝦解剖，取其肝胰腺置于-80 ℃下保存，用于酶活分析和RNA提取，取其中腸置于體積分?jǐn)?shù)為4%的甲醛溶液中浸泡，用于腸道形態(tài)學(xué)分析。

1.2.6 中腸形態(tài)學(xué)分析 將保存的中腸樣品轉(zhuǎn)移至波恩氏液中固定24 h，然后轉(zhuǎn)移到體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇中。將腸道樣品在一系列分級乙醇中脫水，用石蠟包埋、蘇木精-伊紅染色，在顯微鏡(Nikon Ni-U，日本)下觀察并拍照。用Image J軟件測量腸道皺襞的高度和肌肉層的厚度，通過這兩項指標(biāo)來評價腸道組織形態(tài)。

1.2.7 肝胰腺基因表達(dá)檢測 檢測肝胰腺中胰蛋白酶(Trypsin)、糜蛋白酶(Chymotrypsin)等消化酶基因，以及SOD酶、CAT酶、酚氧化酶(PO)和β-1，3-葡聚糖結(jié)合蛋白(Lgbp)等免疫蛋白基因的表達(dá)。使用Trizol Reagent(Invitrogen，上海)提取肝胰腺總RNA，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，使用超微量分光光度計Nano 2000(Thermo Scientific，美國)檢測RNA濃度(A260 nm/A280 nm)。然后用Fermentas DNase Ⅰ 試劑盒去除基因組DNA污染，再使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit(TaKaRa，大連)合成cDNA。Real-time PCR所用引物信息如表4所示，所有引物均由Invitrogen(上海)合成，使用前均驗證其擴增效率為90%～110%。

表4 Real-time PCR引物信息Tab.4 Primer information of the Real-time PCR

在羅氏LightCycler 480(巴塞爾，瑞士)儀器上進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，所用試劑為SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ (TaKaRa，大連)，每個反應(yīng)設(shè)置3個復(fù)孔。反應(yīng)條件：95 ℃下預(yù)變性2 min；95 ℃下變性15 s，60 ℃下退火45 s，共進(jìn)行40個循環(huán)。之后進(jìn)行溶解曲線分析，結(jié)束后導(dǎo)出Ct值，使用2-ΔΔCt方法分析定量數(shù)據(jù)。

1.2.8 生理酶活的測定 使用南京建成生物工程研究所試劑盒，檢測血清和肝胰腺中過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性及谷胱甘肽(GSH)含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±S.E.)表示，使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。首先對數(shù)據(jù)進(jìn)行齊次性檢驗，如果方差齊次，則使用單因素方差分析，用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05；如果方差不齊次，則使用非參數(shù)檢驗(Kruskal-Wallis test)進(jìn)行組間差異比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同飼料組凡納濱對蝦的生長性能

從表5可見，在8周養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，攝食低魚粉飼料的LF組對蝦各項生長指標(biāo)最差，低魚粉飼料中添加植酸酶后，LFP組對蝦的增重率、特定生長率、蛋白質(zhì)消化率和飼料效率顯著提高(P<0.05)，存活率和干物質(zhì)消化率也有所提升。

表5 不同飼料對凡納濱對蝦生長性能和飼料利用的影響Tab.5 Effects of different diets on growth performance and feed utilization of Litopenaeus vannamei

2.2 凡納濱對蝦腸道形態(tài)學(xué)分析

凡納濱對蝦中腸形態(tài)的蘇木精-伊紅染色切片見圖1。LF組對蝦腸道的皺襞高度和肌層厚度顯著低于高魚粉組(P<0.05)，低魚粉飼料中添加植酸酶后，LFP組這兩個腸道形態(tài)指標(biāo)明顯提升，并達(dá)到或接近高魚粉組HF水平(P>0.05)(表6)。

M—黏膜皺襞；a—黏膜皺襞的高度；b—肌層的厚度。M—mucosal folds；a—height of mucosal folds；b—width of mucosal folds.圖1 中腸形態(tài)(蘇木精-伊紅染色)Fig.1 Mid-intestinal morphology (HE staining)

表6 腸道形態(tài)指標(biāo)的變化Tab.6 Changes in intestinal morphological index

2.3 肝胰腺中免疫基因和消化酶基因的表達(dá)變化

從圖2可見：LF組對蝦肝胰腺中免疫基因chymotrypsin、sod、po、lgbpmRNA表達(dá)量顯著低于高魚粉組(P<0.05)，低魚粉飼料中添加植酸酶后，LFP組lgbpmRNA水平顯著提高(P<0.05)，chymotrypsinmRNA表達(dá)量有所提高，并接近高魚粉水平(P>0.05)；各組間cat、trypsinmRNA表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05)。

同一基因中標(biāo)有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)。The means with different letters within the same gene are significantly different in the different groups at the 0.05 probability level，and the means with the same letter are not significant differences.圖2 不同飼料對凡納濱對蝦肝胰腺中基因表達(dá)的影響Fig.2 Effects of different diets on gene expressions in hepatopancreas of Litopenaeus vannamei

2.4 血清和肝胰腺中酶活力的變化

從表7可見：在血清中，LF組對蝦的SOD活力顯著高于高魚粉組(P<0.05)，GSH含量顯著低于高魚粉組(P<0.05)，低魚粉飼料中添加植酸酶后，LFP組的SOD活力有所降低，并接近高魚粉組水平(P>0.05)；在肝胰腺中，LF組對蝦的CAT活力和GSH含量顯著低于高魚粉組(P<0.05)，添加植酸酶后，LFP組CAT活力和GSH含量有所提升，并接近高魚粉組水平(P>0.05)。

表7 不同飼料對凡納濱對蝦血清和肝胰腺酶活力的影響Tab.7 Effects of different diets on enzyme activities in serum and hepatopancreas of Litopenaeus vannamei

3 討論

3.1 植酸酶對凡納濱對蝦生長性能的影響

在對蝦和其他水產(chǎn)動物飼料中添加植酸酶的研究結(jié)果是有爭議的。本試驗中，降低飼料魚粉的添加量后，在含19%豆粕的兩個低魚粉飼料組中，對蝦的生長性能顯著低于高魚粉對照組，但在添加5 000 U/g植酸酶(0.02%)的低魚粉組，對蝦的增重率和飼料效率均顯著提高。這與孟祥科等[15]以豆粕替代30%魚粉后，添加1～1.5 U/g植酸酶可以促進(jìn)紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)幼魚生長并改善消化能力的結(jié)果一致。但也有研究表明，在含30%豆粕的基礎(chǔ)飼料中添加2 U/g植酸酶后，對羅非魚的生長和飼料利用無影響[16]；在含37.8%豆粕的飼料中添加1 U/g植酸酶后，對斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)的成活率也無影響[17]。研究結(jié)果出現(xiàn)差異的原因，可能與物種差異相關(guān)，也可能是植酸酶添加量低或豆粕替代魚粉比例過高所致。

飼料系數(shù)、蛋白質(zhì)效率是衡量水產(chǎn)動物飼料利用效率的重要指標(biāo)。楊璐等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在添加合理劑量的植酸酶后，中華絨螯蟹(Eriocheirsinensi)的飼料系數(shù)顯著降低，蛋白質(zhì)效率顯著提高。本研究中，低魚粉組對蝦的飼料效率顯著低于高魚粉組，添加植酸酶后的低魚粉組飼料效率顯著提高，并接近高魚粉組水平，說明植酸酶同樣提高了凡納濱對蝦的飼料利用率。在水產(chǎn)動物中，魚粉的消化率通常高于其他原料，而本研究中選用的大豆?jié)饪s蛋白、蝦粉、雞肉粉和血粉等都是凡納濱對蝦消化率較高的原料。本研究中，低魚粉組對蝦的營養(yǎng)物質(zhì)消化率顯著低于高魚粉組，添加植酸酶后的低魚粉組營養(yǎng)物質(zhì)消化率顯著提高，說明植酸酶能夠減弱或者消除植物蛋白源對凡納濱對蝦消化能力的不利影響；同時，低魚粉組的糜蛋白酶基因chymotrypsinmRNA水平也顯著低于高魚粉組，說明植物蛋白源降低了飼料的消化率和對蝦的消化能力，但添加植酸酶后的低魚粉組chymotrypsinmRNA水平有所提高，并接近高魚粉組水平。這與用添加植酸酶的低魚粉飼料投喂草魚(Ctenopharyngodonidella)能夠提高草魚營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率和腸道消化酶活性的結(jié)果相似[19]。

3.2 植酸酶對凡納濱對蝦中腸形態(tài)的影響

動物的腸道屏障具有保護(hù)機體的功能，如果腸道組織的完整性被破壞，有害病原體和外界毒素便能穿透腸上皮細(xì)胞，降低機體的免疫力[20]。同時，腸道也是吸收營養(yǎng)物質(zhì)的重要器官，腸道的形態(tài)結(jié)構(gòu)對蝦類的生長和免疫起著重要作用。一般來說，腸道皺襞高度和肌層厚度是反映腸道健康的兩個基本指標(biāo)[21]。張鑫等[22]研究表明，用豆粕替代飼料中高比例的魚粉會對烏鱧(Channaargus)的生長性能產(chǎn)生不利影響，影響腸道褶皺形態(tài)并導(dǎo)致部分褶皺受到破壞。本研究結(jié)果與此類似，低魚粉飼料(10%魚粉蛋白)投喂組凡納濱對蝦腸道皺襞高度和肌層厚度最低，當(dāng)?shù)汪~粉飼料中添加一定量的植酸酶后，對蝦的腸道皺襞高度和肌層厚度均有明顯提高，說明添加植酸酶可以緩解低魚粉飼料誘發(fā)的對蝦腸道損傷。這與王國霞等[23]研究得到的飼料中添加植酸酶(1 U/g)能夠提高黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)前腸腸壁厚度和腸絨毛高度的結(jié)果一致。由此可見，在以植物蛋白源為主的低魚粉飼料中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%的植酸酶(5 000 U/g)，可在一定程度上緩解低魚粉誘發(fā)的蝦腸道損傷。

3.3 植酸酶對凡納濱對蝦非特異性免疫力的影響

甲殼類免疫防御的重要一環(huán)是酚氧化酶原系統(tǒng)(proPO)介導(dǎo)的黑化作用，proPO上調(diào)會導(dǎo)致PO活性的提高[24]，而β-1，3-葡聚糖結(jié)合蛋白(Lgbp)是proPO系統(tǒng)中的一個重要的模式識別蛋白，能夠與真菌細(xì)胞壁的脂多糖和β-1，3-葡聚糖結(jié)合，從而達(dá)到保護(hù)機體的作用[25]。本試驗中，與高魚粉組相比，低魚粉中po和lgbpmRNA水平顯著降低，而在低魚粉飼料中添加植酸酶后，lgbpmRNA水平顯著提高，說明在低魚粉飼料中添加植酸酶可以提高對蝦的免疫力。與本試驗結(jié)果類似，在全植物蛋白飼料中添加植酸酶(1 000 U/g)后，能促進(jìn)斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)的生長和魚體蛋白沉積，并能預(yù)防脊椎畸形和提高魚體非特異性免疫相關(guān)酶活力[26]。由此可見，以植物蛋白源為主的低魚粉飼料中添加0.02%的植酸酶(5 000 U/g)在一定程度上能提高對蝦免疫力，減少病原侵害。

3.4 植酸酶對凡納濱對蝦抗氧化能力的影響

使用豆粕、菜籽粕等植物蛋白替代魚粉的飼料投喂水產(chǎn)動物，植物蛋白中的抗胰蛋白酶、植酸和游離棉酚等抗?fàn)I養(yǎng)因子經(jīng)過水產(chǎn)動物消化道的消化吸收進(jìn)入動物體內(nèi)各個組織，從而導(dǎo)致機體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[27-28]。本試驗中，肝胰腺和血清中的一些抗氧化相關(guān)酶活性受到飼料魚粉水平的顯著影響，同時體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)GSH含量也低于高魚粉組，說明低魚粉飼料降低了對蝦的抗氧化能力。除了GSH外，其他抗氧化指標(biāo)在高魚粉組和添加植酸酶的低魚粉組間無顯著性差異，說明低魚粉飼料中添加植酸酶后能夠部分緩解低魚粉誘發(fā)的氧化損傷，提高對蝦抗氧化能力。Xie等[29]研究發(fā)現(xiàn)，隨著飼料中魚粉替代水平的增加，凡納濱對蝦CAT活力下降，這表明魚粉的替代會導(dǎo)致其抗氧化能力下降。王國霞等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在以魚粉、豆粕、棉籽粕和雙低菜籽粕為蛋白源的實用飼料中添加1 000 U/g植酸酶，能在一定程度上提高黃顙魚血清SOD、GSH-Px、T-AOC活性，降低MDA含量，改善魚體抗氧化力。這些結(jié)果與本試驗結(jié)果相似，說明在以植物蛋白源為主的低魚粉飼料中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%的植酸酶(5 000 U/g)，在一定程度上能改善凡納濱對蝦的抗氧化能力。

4 結(jié)論

1)本試驗條件下，利用以植物蛋白源為主的復(fù)合蛋白源替代魚粉后，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%的植酸酶(5 000 U/g)，能夠顯著增強凡納濱對蝦對營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用率，進(jìn)而提高其生長性能。

2)在低魚粉飼料中添加植酸酶可增強凡納濱對蝦抗氧化能力和免疫力，并在一定程度上緩解低魚粉飼料誘發(fā)的腸道損傷。