長江刀鱭腦轉錄組多態(tài)性EST-SSRs的規(guī)?；_發(fā)與利用

于愛清，施永海，徐嘉波

(上海市水產(chǎn)研究所 上海市水產(chǎn)技術推廣站，上海 200433)

刀鱭(Coilianasus)隸屬于鯡形目(Clupeiformes)鳀科(Engraulidae)鱭屬(Coilia)，在中國的渤海、黃海、東海海域及其通海的江河中均能發(fā)現(xiàn)其蹤跡，其中以長江下游的捕獲量最高。長江刀鱭魚體豐腴肥滿，肉鮮味美，曾與鰣、河豚并稱為“長江三鮮”[1]。近年來，由于棲息地生存環(huán)境受到污染、惡化，以及酷漁濫捕、沿岸工程建設等人類活動的影響，野生長江刀鱭數(shù)量急劇下降，甚至不能形成優(yōu)勢種群[1-4]，亟須對其自然種質資源進行有效保護、開發(fā)和利用。自2019年2月1日開始，中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部就已停止發(fā)放長江刀鱭專項捕撈許可證，禁止對其自然資源進行生產(chǎn)性捕撈，次年又開始實施長江“十年禁漁”政策。同期長江刀鱭全人工繁育技術和苗種規(guī)?；a(chǎn)技術亦獲得了突破性進展，這些舉措不僅促進了長江刀鱭產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖的發(fā)展，而且有效地緩解了長江刀鱭野生種質資源銳減的狀況。

分子標記不僅可以探究整個動物基因組的遺傳變異，且遺傳相對穩(wěn)定，常用于水產(chǎn)經(jīng)濟動物的群體遺傳分析和分子育種研究，其中，微衛(wèi)星標記(microsatellite)的應用最為廣泛[5]。微衛(wèi)星標記，亦稱短鏈重復序列(short tandem repeats，STRs)或簡單重復序列(simple sequence repeat，SSR)，是在真核生物基因組中均勻分布的、由1～6個核苷酸串聯(lián)重復片段構成的序列，這些序列的重復次數(shù)和重復單位在不同個體間呈現(xiàn)高度變異性和多態(tài)性，被廣泛應用于水產(chǎn)經(jīng)濟動物的群體遺傳分析、種質鑒定、分子標記輔助良種選育及構建遺傳圖譜等方面[5-7]。近年來，研究人員利用線粒體基因D-loop[8]、RAPD[9]和AFLP[10]等不同類型的分子標記，開展了長江刀鱭不同群體的遺傳變異研究，這些類型的標記試驗成本較高、操作復雜且數(shù)量相對較少，而微衛(wèi)星標記則操作相對簡單，成本較低且數(shù)量多，但對長江刀鱭SSR開發(fā)利用的報道較少。Ma等[11]基于FIASO法，從微衛(wèi)星富集文庫開發(fā)鑒定到12對多態(tài)性SSR標記，用于長江刀鱭和鳳鱭的遺傳分析。Chen等[12]基于磁珠富集法，從微衛(wèi)星富集文庫開發(fā)鑒定到34對多態(tài)性SSR標記，用于長江刀鱭及其近緣物種的通用性研究。Rong等[13]基于FIASO法，從微衛(wèi)星富集文庫開發(fā)鑒定到20對多態(tài)性微衛(wèi)星標記，用于長江刀鱭的群體遺傳研究?；诖胖楦患虵IASO等方法，雖然從水產(chǎn)動物基因組規(guī)模化開發(fā)的SSR標記多態(tài)性較高，但成本相對較高且費時、低效，已不能滿足長江刀鱭群體遺傳分析及分子標記輔助良種選育對SSR的需求，亟待大規(guī)模挖掘開發(fā)[5]。

與傳統(tǒng)的基因組SSR(genomic SSR，G-SSR)開發(fā)技術相比，基于高通量轉錄組測序技術所開發(fā)的SSR，則被定義為表達序列標簽-SSR(expressed sequence tag SSR，EST-SSR)，雖然標記多態(tài)性相對G-SSR較低，但由于其數(shù)量豐富、開發(fā)成本低和開發(fā)周期短，且常常與相關性狀的功能基因關聯(lián)[5，14]，而被廣泛應用于水產(chǎn)經(jīng)濟動物多態(tài)性EST-SSRs的規(guī)模化開發(fā)與應用。近年來，陸續(xù)出現(xiàn)的海量高通量測序數(shù)據(jù)，亦為水產(chǎn)動物微衛(wèi)星標記的開發(fā)提供了便利條件，同時，一大批針對高通量轉錄組數(shù)據(jù)挖掘EST-SSRs的軟件，如MISA(MIcroSAtellite Identification Tool)[15]、Candi-SSR[16]、SSRMMD(Simple Sequence Repeat Molecular Marker Developer)[17]等多態(tài)性SSR位點篩選軟件陸續(xù)被開發(fā)出來，極大地加快了水產(chǎn)經(jīng)濟動物多態(tài)性EST-SSRs的開發(fā)和利用研究進程。

本研究中，基于長江刀鱭雌、雄個體的腦轉錄組數(shù)據(jù)，采用MISA軟件深入挖掘長江刀鱭腦轉錄組Unigenes中的EST-SSRs，采用SSRMMD軟件規(guī)?；亻_發(fā)多態(tài)性EST-SSRs，并利用篩選獲得的18個多態(tài)性較好的EST-SSRs，評估了3個長江刀鱭養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性，以期為長江刀鱭的群體遺傳分析、分子標記規(guī)?；_發(fā)與利用及分子標記輔助良種選育提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

用于轉錄組測序的12尾2齡長江刀鱭(雌、雄各6尾)，取自上海市水產(chǎn)研究所奉賢科研基地2018年的繁育群體；用于EST-SSRs多態(tài)性分析和有效性驗證的長江刀鱭，分別取自該基地2018、2019和2020 年獲得的繁育子代，每年各取24尾，分別記為2018、2019、2020養(yǎng)殖群體。

1.2 方法

1.2.1 長江刀鱭腦轉錄組測序 利用Illumina轉錄組文庫構建試劑盒分別構建長江刀鱭雌、雄個體腦組織的轉錄組cDNA測序文庫，并基于Illumina HisSeq 4000高通量測序平臺進行測序。測序原始數(shù)據(jù)(Raw Reads)采用SeqPrep和Sickle軟件進行質控和過濾處理，獲得質量較高的純凈數(shù)據(jù)(Clean Reads)；采用Trinity軟件對所獲得的Clean Reads進行從頭組裝和去冗余后，獲得高質量的雌性腦轉錄組Unigenes(以下簡稱“CEF.fa”)和雄性腦轉錄組Unigenes(以下簡稱“CEM.fa”)。

1.2.2 長江刀鱭EST-SSRs的識別和特征分析 在Linux操作系統(tǒng)下，利用MISA軟件(http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa /misa.html)分別掃描和檢索CEF.fa和CEM.fa中的EST-SSRs。單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復基序的最少重復次數(shù)分別設置為10、6、5、5、5和5次，經(jīng)篩選和計算后，統(tǒng)計雌性和雄性刀鱭轉錄組中這6類核苷酸重復基序的重復次數(shù)及各重復類型的比例；復合型EST-SSRs兩個位點間最大間隔堿基數(shù)設置為100。

1.2.3 長江刀鱭多態(tài)性EST-SSRs的快速識別和檢測 在Linux操作系統(tǒng)下，采用SSRMMD軟件檢索CEF.fa和CEM.fa中完美的EST-SSRs位點和候選的多態(tài)性EST-SSRs。軟件運行參數(shù)如下：perl SSRMMD.pl -f1 CEFM/CEF.fa -f2 CEFM/CEM.fa -p1 -me NW -st 0 -t 2；從篩選出的多態(tài)性EST-SSRs中隨機選取20條序列，并結合長江刀鱭參考基因組序列和EST-SSRs兩側保守側翼序列的保守性特征，通過Primer Premier 5.0軟件，設計、篩選出評分較高的EST-SSRs PCR擴增引物，委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行引物合成與純化，用于后續(xù)EST-SSRs有效性和多態(tài)性的檢測。

從不同年份養(yǎng)殖長江刀鱭的每個樣本，分別剪取鰭條組織約5 mg，用滅菌雙蒸水清洗，剪碎后轉移至1.5 mL離心管中，使用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(DP324-03)[天根生化科技(北京)有限公司)]，提取每個樣本的基因組DNA；用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳評估DNA質量，利用NanoVue Plus紫外可見分光光度計測量濃度后，將符合要求的DNA樣品稀釋到50 ng/μL，于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

隨機選取10個DNA樣本等量混合成PCR擴增的模板，在Eppendorf Mastercycler X50s梯度PCR儀(ABI，美國)上篩選各引物的最適退火溫度。PCR反應體系(10 μL)：模板DNA 1 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各0.25 μL，2×Taq PCR MasterMix(天根生化，KT201)5 μL，用ddH2O補足至10 μL。PCR反應程序：94 ℃下預變性5 min；94 ℃下變性 0.5 min，48～68 ℃下退火0.5 min，72 ℃下延伸0.5 min，共進行35個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸7 min，4 ℃下保存?zhèn)溆?。PCR產(chǎn)物用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，利用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照、保存，確定各EST-SSRs引物的最佳退火溫度和有效性。

1.2.4 長江刀鱭不同年份養(yǎng)殖群體的種質資源評估 以2018、2019和2020年的3個長江刀鱭養(yǎng)殖群體共72個DNA樣本為試驗材料，利用篩選獲得的18對多態(tài)性EST-SSRs引物(表1)，在Eppendorf Mastercycler X50s梯度PCR儀器上進行PCR擴增。PCR反應體系和反應程序參照引物最佳退火溫度的篩選過程，在各引物的最佳退火溫度(表1)下獲取PCR產(chǎn)物。利用10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，通過銀染法進行顯色定影，利用數(shù)碼相機對顯色清晰的條帶拍照保存，用于后續(xù)長江刀鱭不同養(yǎng)殖群體的遺傳差異分析。

表1 長江刀鱭多態(tài)性EST-SSRs引物信息和參數(shù)Tab.1 Primer sequences and parameters of polymorphic EST-SSRs in Coilia nasus

1.2.5 遺傳多樣性參數(shù)的計算與分析 采用GenAlEx 6.0軟件計算長江刀鱭不同養(yǎng)殖群體的等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、遺傳相似度、遺傳距離和遺傳分化指數(shù)(FST)等遺傳多樣性參數(shù)，并進行哈迪-溫伯格平衡檢測(Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE)；采用MEGA 6.0軟件構建不同群體間的UPGMA聚類分析樹。

基于Botstein等[18]的公式，計算長江刀鱭不同群體和位點的多態(tài)信息含量(polymorphism information content，PIC)：

其中：CPI為多態(tài)信息含量；pi、pj分別為群體中第i、j個等位基因的頻率；N為等位基因數(shù)。

2 結果與分析

2.1 長江刀鱭腦轉錄組序列特征

從雌性長江刀鱭腦轉錄組中共獲得49.69 Gbp Clean Data，6個樣品的Clean Data均達到了 7.79 Gbp以上，Q30堿基百分比在95.11%以上，表明測序結果良好；經(jīng)Trinity軟件組裝和優(yōu)化后，共獲得N50為1 488 bp的Unigenes 143 374個(表2)。

從雄性長江刀鱭腦轉錄組中共獲得50.15 Gbp Clean Data，6個樣品的Clean Data均達到了8.19 Gbp以上，Q30堿基百分比在95.30%以上，表明測序結果良好；經(jīng)Trinity軟件組裝和優(yōu)化后，獲得N50為1 569 bp的Unigenes 135 215個(表2)。

表2 雌、雄長江刀鱭個體腦轉錄組序列信息Tab.2 Sequence characteristics of the brain transcriptome in the female and male Coilia nasus

2.2 長江刀鱭腦轉錄中EST-SSRs特征分析

雌性長江刀鱭143 374條Unigenes中總共獲得95 905個EST-SSRs，其中，33.99%的Unigenes包含EST-SSRs，11.30%的Unigenes含有1個以上的EST-SSRs，平均每隔1 688 bp有一個EST-SSR；雄性長江刀鱭135 215條Unigenes中共獲得88 774個EST-SSRs，其中，33.17%的Unigenes包含EST-SSRs，11.03%的Unigenes含有1個以上的EST-SSRs，平均每隔1 740 bp有一個EST-SSR(表3)。

表3 雌、雄長江刀鱭個體腦轉錄組EST-SSRs搜索結果Tab.3 EST-SSRs search results in the brain transcriptome of female and male Coilia nasus

長江刀鱭雌、雄個體腦轉錄組EST-SSRs具有相似的類型特征，從單核苷酸重復EST-SSRs到六核苷酸重復EST-SSRs均有分布，且具有不同程度的數(shù)量分布差異，均以二核苷酸重復EST-SSRs數(shù)量最多，單核苷酸重復EST-SSRs數(shù)量次之，三核苷酸重復EST-SSRs的數(shù)量亦較為豐富，四核苷酸重復EST-SSRs的數(shù)量相對較少，五核苷酸和六核苷酸重復EST-SSRs的數(shù)量最少(表4)。

表4 雌、雄長江刀鱭腦轉錄組主要EST-SSRs重復基序的數(shù)量Tab.4 Number of main repeat motif of EST-SSRs in the brain transcriptome of female and male Coilia nasus

長江刀鱭雌、雄個體腦轉錄組EST-SSRs主要優(yōu)勢核苷酸重復基序亦有相似的數(shù)量分布特征，其中，單核苷酸重復EST-SSRs的優(yōu)勢重復基序均為A/T，二核苷酸均為AC/GT，三核苷酸均為AGG/CCT，四核苷酸均為ACAG/CTGT(表5)。

表5 雌、雄長江刀鱭腦轉錄組EST-SSRs主要重復基序的類型和數(shù)量Tab.5 Type and number of main repeat motif of EST-SSRs in the brain transcriptome of female and male Coilia nasus

2.3 長江刀鱭腦轉錄組多態(tài)性EST-SSRs特征分析

基于SSRMMD軟件的搜索結果顯示，從長江刀鱭雌、雄腦轉錄組EST-SSRs序列中篩選獲得了5 675 條雌、雄個體共有的EST-SSRs，并從中鑒定出1 082 個多態(tài)性EST-SSRs。從圖1可見，多態(tài)性EST-SSRs的數(shù)量隨著堿基重復基序類型次數(shù)的增加而逐級減少，表明長江刀鱭轉錄組中多態(tài)性EST-SSRs的類型極為豐富，從單核苷酸到六核苷酸均有分布，且主要以單核苷酸重復和二核苷酸重復為主，這兩類EST-SSRs的數(shù)量約占88.5%，多堿基重復基序的EST-SSRs相對保守，不易累積遺傳變異，獲得的多態(tài)性位點相對較少。

圖1 長江刀鱭多態(tài)性EST-SSRs的類型和數(shù)量特征Fig.1 Type and quantities characteristics of polymorphic EST-SSRs in Coilia nasus

2.4 多態(tài)性EST-SSRs的有效性和多態(tài)性驗證

以上海市水產(chǎn)研究所奉賢科研基地隨機選取的2018、2019和2020群體72尾養(yǎng)殖長江刀鱭的基因組DNA為模板，利用20對EST-SSRs引物進行PCR擴增和檢測顯示，除1對無擴增產(chǎn)物外，其余19對EST-SSRs引物擴增得到預期大小的PCR產(chǎn)物，有效擴增率為95%。用10%非變性聚丙烯凝膠電泳檢測顯示，有18對EST-SSRs引物具有較好的多態(tài)性，占有效擴增引物的94.7%(引物信息見表1)，部分多態(tài)性EST-SSRs引物(EST-SSR02、EST-SSR04、EST-SSR08和EST-SSR09)在24個試驗樣本(2018群體)的PCR擴增電泳圖譜見圖2。

M—DNA marker(pBR322/MspI)；1～24—24個長江刀鱭樣品(2018群體)。M—represents the DNA marker (pBR322/MspI)；1-24—denote the 24 samples of Coilia nasus in 2018 population.圖2 長江刀鱭部分EST-SSRs引物的PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.2 Electrophoretic map of PCR products with partial EST-SSRs primers of Coilia nasus

2.5 長江刀鱭養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性分析

遺傳多樣性分析結果顯示，長江刀鱭2018、2019、2020養(yǎng)殖群體的平均觀測雜合度(Ho)、平均期望雜合度(He)和多態(tài)信息含量(PIC)分別為0.445 2、0.485 4和0.420 9，表明3個養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性較為豐富，但伴隨著繁育年份的增加，3個養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性參數(shù)呈現(xiàn)逐年降低的趨勢，特別是2020養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性降低幅度相對較大(表6)。哈迪-溫伯格平衡檢測結果顯示，2018、2019、2020養(yǎng)殖群體中分別有4、6、7個位點顯著偏離哈迪-溫伯格平衡(P<0.05)，表明人工選擇壓力已經(jīng)對長江刀鱭養(yǎng)殖群體的遺傳結構產(chǎn)生了不同程度的影響(表7)。

表6 長江刀鱭不同養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性參數(shù)Tab.6 Genetic variation parameter of different cultured populations of Coilia nasus

表7 長江刀鱭不同EST-SSRs的遺傳多樣性參數(shù)Tab.7 Genetic variation parameter of different EST-SSRs loci in Coilia nasus

遺傳距離和遺傳相似系數(shù)分析結果顯示，長江刀鱭2018養(yǎng)殖群體與2020養(yǎng)殖群體的遺傳距離最大(0.148 7)，遺傳相似性最低(0.861 8)；2018養(yǎng)殖群體與2019養(yǎng)殖群體的遺傳距離最小(0.104 7)，遺傳相似性最高(0.900 6)(表8)。基于Nei’s遺傳距離構建的長江刀鱭不同養(yǎng)殖群體的UPGMA聚類分析顯示，長江刀鱭2018養(yǎng)殖群體先與2019養(yǎng)殖群體聚為一支，然后再與2020養(yǎng)殖群體聚為一支(圖3)。

表8 長江刀鱭不同養(yǎng)殖群體的遺傳相似系數(shù)(對角線下)和遺傳距離(對角線上)Tab.8 Genetic similarity index (below diagonal)and genetic distance (above diagonal)of selected populations in Coilia nasus

圖3 不同養(yǎng)殖群體間的UPGMA聚類分析Fig.3 UPGMA analysis among different cultured populations

遺傳分化指數(shù)分析結果顯示，長江刀鱭2018、2019、2020養(yǎng)殖群體間存在不同程度的遺傳分化，兩兩群體間均處于中等程度的遺傳分化(0.05

表9 長江刀鱭兩兩群體間的遺傳分化指數(shù)(FST)Tab.9 Index of genetic differentiation between selected populations in Coilia nasus

表10 長江刀鱭不同養(yǎng)殖群體間的AMOVA分子方差分析Tab.10 AMOVA analysis of selected populations in Coilia nasus

3 討論

DNA分子因復制、缺失、滑移或錯配及姐妹染色單體的不均等交換等原因而具有高度變異性[5]，故微衛(wèi)星分子標記在水產(chǎn)動物進化過程中被廣泛應用于水產(chǎn)動物群體遺傳結構分析、親子鑒定、遺傳圖譜構建、數(shù)量性狀定位和分子標記輔助育種[19-20]等相關研究。對于具有參考基因組信息的物種而言，微衛(wèi)星標記的大規(guī)模開發(fā)相對方便，而對于目前還無參考基因組信息的物種，則可利用高通量轉錄組測序技術大規(guī)模開發(fā)EST-SSRs，以深入開展相關物種基因的等位基因變異、重要經(jīng)濟性狀相關基因的挖掘和精細定位研究。長江刀鱭作為中國具有較高經(jīng)濟、營養(yǎng)和養(yǎng)殖價值的江海洄游性魚類，其可用于分子標記的資源相對匱乏，鑒于全基因組測序的成本相對較高，因此，亟需開展長江刀鱭的轉錄學研究以獲得大量的可用分子標記。

3.1 長江刀鱭腦轉錄組EST-SSRs特征分析

本研究中，基于長江刀鱭雌、雄個體的腦轉錄組數(shù)據(jù)，利用生物信息學方法挖掘其腦轉錄組中的EST-SSRs，結果在雌、雄長江刀鱭腦轉錄組中分別獲得了95 905條和88 774條EST-SSRs，這些EST-SSRs的種類較為豐富，且6類核苷酸重復基序均有不同程度的數(shù)量分布差異，均以二核苷酸重復基序為主(63.87%和62.60%)，其次是單核苷酸重復基序(22.94%和23.67%)，三核苷酸重復基序亦較為豐富(9.34%和9.93%)，其他類型的核苷酸重復基序相對較少。研究表明，多數(shù)水產(chǎn)物種EST-SSRs中的重復基序均以二核苷酸重復基序為主[21]，本研究中亦獲得了與此相一致的結果；而其余類型的優(yōu)勢重復基序則有較大的差異，這可能與不同物種轉錄組文庫構建的組織來源、不同物種的種間特異性、位點突變頻率及選擇性進化機制有關[5]。本研究中，不同重復基序的堿基優(yōu)勢重復類型表現(xiàn)出不同程度的偏倚性，單核苷酸重復基序以A/T類型為主，可能是由于富含A/T的微衛(wèi)星退火溫度相對較低，有利于雙鏈DNA的解鏈，通過DNA復制的重組和滑動機制而增加A/T重復基序的概率[5，21]；二核苷酸重復基序以AC/GT為主，這與魚類基因組微衛(wèi)星中以AC/GT重復為主相符；其余重復基序的優(yōu)勢重復堿基類型在不同物種間差異較大，可能與不同物種的種間差異性有關。

3.2 水產(chǎn)動物多態(tài)性EST-SSRs的開發(fā)

近年來，陸續(xù)有學者利用高通量轉錄組測序技術在水產(chǎn)經(jīng)濟養(yǎng)殖物種中成功鑒定到多態(tài)性較好的EST-SSRs。蔡磊等[22]利用高通量轉錄組測序技術，從諸氏鯔蝦虎魚(Mugilogobiuschulae)肝臟轉錄組中獲得了6 225個EST-SSRs，并從76對引物中篩選獲得了32對多態(tài)性較好的EST-SSRs，多態(tài)率為42.10%。龔詩琦等[23]利用高通量轉錄組測序技術，從黃姑魚(Nibeaalbiflora)轉錄組中獲得了12 254個EST-SSRs，并從80對引物中篩選獲得了18個多態(tài)性較好的EST-SSRs，多態(tài)率為22.5%。岳華梅等[24]利用高通量轉錄組測序技術，從興國紅鯉(Cyprinuscarpio)的垂體和性腺轉錄組中獲得了13 652個微衛(wèi)星標記，并從30對引物中篩選獲得了9個多態(tài)性較好的EST-SSRs，多態(tài)率為30%。本研究中，從20對微衛(wèi)星引物中篩選獲得了18對多態(tài)性較好的EST-SSRs，多態(tài)率為90%，引物多態(tài)率顯著高于其他魚類的研究結果，本課題組前期從長江刀鱭肌肉和肝臟轉錄組中隨機篩選的EST-SSRs，多態(tài)率僅為16%，而轉錄組中通常具有數(shù)萬個EST-SSRs，如果利用傳統(tǒng)方法將多態(tài)性的位點全部篩選出來，往往需要花費大量的人力、物力和財力。本研究中所使用的方法效果較好，特別是針對基因組信息比較匱乏的水產(chǎn)經(jīng)濟動物較為實用，不僅能夠借助相關水產(chǎn)動物研究中已公開發(fā)表的轉錄組數(shù)據(jù)，且隨著高通量測序成本的降低，建立轉錄組測序文庫的成本也相對低廉，因此，能夠在短時間內迅速獲得多態(tài)性較好的EST-SSRs，用于相關水產(chǎn)經(jīng)濟物種的種質資源評估。

3.3 刀鱭養(yǎng)殖群體與野生群體遺傳多樣性比較

群體遺傳多樣性是評估水產(chǎn)動物種質資源現(xiàn)狀的重要理論依據(jù)，亦是水產(chǎn)動物在分子水平上開展遺傳改良的重要遺傳基礎。遺傳多樣性越高，適應能力越強，遺傳改良的潛力越大，而觀測雜合度和期望雜合度則是評估水產(chǎn)動物不同群體遺傳多樣性高低的重要參考指標[11]。基于微衛(wèi)星分子標記技術，一些學者陸續(xù)對不同水域刀鱭的野生群體開展了遺傳多樣性研究。Ma等[11]利用12對基因組SSR引物，對30尾長江水域(武漢)野生長江刀鱭的遺傳多樣性評估顯示，該群體的平均Ho和He分別為0.675和0.650；Chen等[12]利用34對基因組SSR引物，對30尾鴨綠江水域(丹東)野生刀鱭的遺傳多樣性評估顯示，該群體的平均Ho和He分別為0.53和0.77；Rong等[13]利用20對基因組SSR引物，對60尾黃河流域野生刀鱭的遺傳多樣性評估顯示，該群體的平均Ho和He分別為0.49和0.68；Xuan等[25]利用11對基因組SSR引物，對31尾長江江口野生刀鱭的遺傳多樣性評估顯示，該群體的平均Ho和He分別為0.807 4和0.854 2；本課題組前期利用12對基因組SSR引物，對30尾靖江水域野生長江刀鱭的遺傳多樣性評估顯示，該群體的平均Ho和He分別為0.516 7和0.738 1[26]。以上結果表明，中國不同水域刀鱭野生群體的遺傳多樣性差異較大，而刀鱭養(yǎng)殖群體遺傳多樣性的報道相對較少。本課題組前期利用12對G-SSR引物，評估了長江刀鱭選育世代(F1～F3)的遺傳多樣性，F(xiàn)1群體的平均Ho和He分別為0.480 6和0.711 2、F2群體為0.444和0.693 3，F(xiàn)3群體為0.400 0和0.684 4；之后又利用16對四核苷酸重復的EST-SSRs引物，評估了長江刀鱭選育世代F3的遺傳多樣性，獲得其平均Ho和He分別為0.341 4和0.397 7。本研究中，2019養(yǎng)殖群體樣本為前期研究中選育世代F3的繁育子代(即F4)，其平均Ho和He分別為0.451 4和0.498 3，均低于其他野生刀鱭群體的遺傳多樣性。究其原因，一方面是由于本研究中主要是針對所開發(fā)的EST-SSRs進行多態(tài)性和有效性的初步驗證，所選用的試驗樣本相對較少，且EST-SSRs相對于基因組SSR更加保守，多態(tài)性相對較低；另一方面是由于試驗群體經(jīng)過數(shù)年的人工養(yǎng)殖，已經(jīng)受到了較大的人工選擇壓力，有效繁育群體的數(shù)量亦遠小于野生群體，因此，養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性相對于野生群體有所降低。

4 結論

1)利用MISA軟件分別從雌、雄長江刀鱭腦轉錄組數(shù)據(jù)中成功鑒定到95 905個和88 774個EST-SSRs，利用SSRMMD軟件成功鑒定到1 082個多態(tài)性EST-SSRs；隨機選取20個EST-SSRs進行有效性和多態(tài)性驗證，獲得了18個多態(tài)性較好的EST-SSRs，表明本研究中所用方法能夠顯著提高養(yǎng)殖長江刀鱭多態(tài)性EST-SSRs的檢出效率。

2)基于18個多態(tài)性EST-SSRs評估不同年份長江刀鱭養(yǎng)殖群體的種質資源現(xiàn)狀，結果顯示，隨著繁育年份的增加，3個養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性參數(shù)呈逐年降低的趨勢，暗示在長江刀鱭后續(xù)生產(chǎn)繁育過程中，在增加有效繁育親本數(shù)量的同時，應挑選親緣關系和遺傳分化適宜的繁育親本，以保證繁育后代仍然具有豐富的遺傳多樣性。本研究結果不僅豐富了長江刀鱭分子標記的數(shù)量，而且對于長江刀鱭后續(xù)選育群體的育種效果評估、分子標記輔助育種實踐及通用性長江刀鱭微衛(wèi)星分子標記的開發(fā)具有重要的指導意義。