膿毒癥促內(nèi)質(zhì)網(wǎng)RyR1受體磷酸化增強導(dǎo)致大鼠膈肌功能障礙

吳松林，李學(xué)欣，關(guān)發(fā)升，馮建國，賈靜，李京，劉力

西南醫(yī)科大學(xué)1附屬醫(yī)院麻醉科，2麻醉與重癥醫(yī)學(xué)中心實驗室，四川瀘州 646000

膿毒癥相關(guān)膈肌功能障礙（SIDD）是由膿毒癥引起的膈肌功能障礙和無力［1］。在重癥監(jiān)護病房需要插管的危重癥患者中膈肌功能障礙的患病率超過60%，是導(dǎo)致患者脫機困難，延長住院時間，增加患者死亡率的重要原因［1,2］。關(guān)于SIDD的發(fā)生制目前尚不清楚。有研究結(jié)果表明SIDD的發(fā)生與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、代謝失衡、線粒體功能障礙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、肌肉凋亡和萎縮有關(guān)［3-5］。RyR1是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上鈣離子（Ca2+）釋放通道，在骨骼肌興奮－收縮偶聯(lián)中發(fā)揮重要作用，骨骼肌收縮時所需要的游離Ca2+大部分是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過RyR受體釋放到胞漿中，引起肌肉收縮［6］。研究表明，急性膿毒癥引起的膈肌無力可能與RyR表達(dá)水平有關(guān)［7］。膿毒癥可以改變心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)RyR2的磷酸化水平導(dǎo)致心肌收縮功能障礙［8］。對于膿毒癥引起的RyR1受體表達(dá)及其磷酸化修飾的改變是否參與SIDD的發(fā)生發(fā)展目前尚缺乏研究。因此，本實驗通過動物模型，研究不同病程階段的膿毒癥對膈肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)RyR1受體表達(dá)及其磷酸化水平的影響，通過干預(yù)表達(dá)調(diào)控，闡明RyR1的表達(dá)量變化及其磷酸化在SIDD發(fā)生發(fā)展中的作用，為臨床治療相關(guān)膈肌功能障礙提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

8～12周齡SPF級SD雄性大鼠（成都達(dá)碩實驗動物有限公司），體質(zhì)量200～220 g，飼料、水源和墊料由西南醫(yī)科大學(xué)提供。本實驗經(jīng)過西南醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會倫理審核（動物倫理審批編號：20220927-006）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 根據(jù)前期盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）建模成功率設(shè)置樣本量，按隨機數(shù)字表法將SD大鼠分成5組。假手術(shù)組（Sham組）：行開腹盲腸探查術(shù)，在相應(yīng)觀察點進行指標(biāo)檢測及標(biāo)本取材；CLP-6 h組、CLP-12 h組、CLP-24 h 組：通過CLP 構(gòu)建膿毒癥模型，分別于6、12、24 h 后進行指標(biāo)檢測及標(biāo)本取材；KN-93 組（CLP-24 h+KN-93組）：CLP建模手術(shù)完后立即腹腔注射KN-93 3.327×10-3mmol/kg［9］，于24 h后進行指標(biāo)檢測及標(biāo)本取材。

1.2.2 動物模型構(gòu)建 參照Susanne Drechsler［10］方法，采用CLP構(gòu)建膿毒癥大鼠模型，具體步驟如下：將大鼠以仰臥位固定于動物實驗操作臺上。大鼠術(shù)前禁食12 h，可自由飲水。于腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉大鼠，沿腹中線中下部向左旁0.5～1 cm，作長約1.5～2 cm的縱行切口，探查盲腸，于回盲瓣到盲腸末端距離的1/2處結(jié)扎，避免結(jié)扎腸系膜血管以及回盲部，以保證腸道通暢避免腸梗阻壞死。用18號針頭分別在盲腸結(jié)扎處遠(yuǎn)端和盲腸末端橫貫穿孔2個，最后將盲腸回納入腹腔，逐層縫合切口。皮下注射0.9%N.S 40 mL/kg，防止循環(huán)衰竭。

1.2.3 膈肌CMAP 檢測 參照Martin 等方法［11］，通過RM6240系統(tǒng)記錄CMAP。將SD大鼠仰臥位固定在手術(shù)板，使用脫毛膏去除肋下緣及腹部皮膚的毛發(fā)，使用聚維酮碘消毒。將電極片貼于右側(cè)肋下緣，作為記錄電極；將2根同心圓針電極垂直插入右側(cè)鎖骨上方，氣管旁0.5 cm，深度為1 cm，2根同心圓針電極距離0.5 cm，作為刺激電極；刺激模式采用正電壓單刺激（強度12 V，波寬1 ms，延時1 ms）。此時顯示屏顯示的波形即為CMAP，重復(fù)刺激3次，每次間隔30 s。

1.2.4 膈肌肌條收縮功能檢測 在相應(yīng)時間點處死大鼠，切除的隔肌條被安裝到預(yù)先氧合的Krebs-Henseleit溶液中（1L主要包含：NaCl 118 mmol/L、KCl 4.7 mmol/L、MgSO41.2 mmol/L、KH2PO41.1 mmol/L、NaHCO325 mmol/L、CaCl22.4 mmol/L、葡萄糖5.5 mmol/L PH:7.4）［12］。使用脈沖方波（強度15 V，波寬0.5 ms，延時20 ms）對肌肉進行刺激，重復(fù)刺激3次，刺激間隔1 min。然后通過以10、20、30、50、60、80、100和120 Hz連續(xù)刺激肌肉600 ms，每個刺激訓(xùn)練間隔1 min以確定頻率收縮曲線關(guān)系。在測量收縮特性后，測量肌肉的初長度Lo（肌肉產(chǎn)生最大等距張力的長度）和稱重。然后另取一塊膈肌修剪成條，以50 Hz連續(xù)刺激肌肉2 min確定膈肌的疲勞指數(shù)。膈肌力的產(chǎn)生按總肌條橫截面積歸一化，并以N·cm-2表示。用肌肉質(zhì)量除以長度和組織密度（1.056 g/cm3）來確定總肌條截面積。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡分析 取50 mg膈肌標(biāo)本，用預(yù)冷的雙蒸水稱量修剪。加入蛋白酶裂解液（含1%蛋白酶抑制劑PMSF和1%磷酸酶抑制劑），低溫離心后取上清提取總蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒（beyotime，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）檢測肌肉蛋白的濃度。加入上樣緩沖液，于沸水中進行蛋白變性10 min，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。然后將樣品加入Omni-PAGE?預(yù)制膠Hepes 4%～20%（LK206，雅酶，中國）中進行電泳分離后、采用濕轉(zhuǎn)法于Omni-Flash免冰浴快速轉(zhuǎn)膜緩沖液（10×）（PS201S，雅酶）中進行轉(zhuǎn)膜5 h，將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上。用5%的脫脂牛奶進行封閉1 h（P-RyR1使用5%BSA進行封閉），洗膜后用相對應(yīng)的一抗孵育過夜：RyR1 抗體（1∶1000）（Abcam）、P-RyR1 抗體（1∶500）（Affinity）、CaMKⅡ抗體（1∶1000）（SignalwayAntibody），以羊抗小鼠單克隆抗體β-actin（Santa Cruz Biotechnology）作為內(nèi)參。用與一抗相匹配的二抗室溫孵育1 h：辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠lgG（H+L）（beyotime，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔lgG（H+L）（Proteintech group）。采用Image J進行灰度值分析，以目的蛋白的灰度值與內(nèi)參灰度值的比值反應(yīng)目的蛋白的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad8.3.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實驗數(shù)據(jù)采用Levene 檢驗方差齊性，方差齊下各組之間比較采用ANOVA分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)肌肉功能學(xué)

2.1.2 CMAP 各組CMAP電位見圖1。CLP-24 h組較Sham組CMAP幅值明顯下降（1.88±0.26 mVvs4.62±0.23 mV，P＜0.05）；CLP-24 h+KN-93組較CLP-24 h組的CMAP幅值明顯上升（4.98±0.15 mvvs1.88±0.26 mV,P＜0.05）。CLP-6 h組、CLP-12 h組和Sham組之間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖1）。

CLP-24 h 組CMAP 的時程較Sham 組明顯延長（9.91±1.13 msvs6.35±1.07 ms，P＜0.05），CLP-24 h+KN-93 組較CLP-24 h 組明顯縮短（6.42±0.11 msvs9.91±1.13 ms，P＜0.05）；CLP-6 h 組、CLP-12 h 組和Sham組之間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖1）。

圖1 各組大鼠膿毒癥建模后CMAP幅值和時程比較Fig.1 Changes in amplitude and duration of compound muscle action potential (CMAP) of the diaphragm in rats after sepsis(Mean±SD).*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.1.3 膈肌疲勞指數(shù) CLP-12 h組和CLP-24 h組的疲勞指數(shù)較Sham組明顯增大（0.53±0.04vs0.69±0.05 vs 0.13±0.06，P＜0.05），CLP-24 h+KN-93組與CLP-24 h組膈肌疲勞指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（0.55±0.06vs0.69±0.05，P＞0.05，圖2）。

圖2 各組大鼠膿毒癥建模后疲勞指數(shù)比較Fig.2 Fatigue index after sepsis modeling in each group (Mean±SD, n=6).A:Representative graph of diaphragmatic fatigue index.B:Effect of sepsis on diaphragmatic fatigue index in each group.**P＜0.01.

2.1.4 膈肌頻率-收縮曲線 CLP-6 h組、CLP-12 h組、CLP-24 h組較Sham組的收縮力明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。CLP-24 h+KN-93組較CLP-24 h組的收縮力明顯升高（P＜0.05），CLP-24 h組較CLP-6 h組和CLP-12 h組收縮力明顯降低（P＜0.05，圖3）。

圖3 各組大鼠膈肌頻率-收縮曲線比較Fig.3 Diaphragm frequency-contraction curves in each group (Mean ± SD).A:Representative graph of the diaphragm frequency contraction curve.B:Effect of sepsis on diaphragmatic frequency-contraction curves in each group.***P＜0.001 vs Sham group;＆P＜0.05 vs CLP-24 h group.

2.2 膈肌RyR1蛋白表達(dá)及其磷酸化水平

CLP-24 h組較Sham組的RyR1蛋白表達(dá)水平下降（P＜0.05），而CLP-24 h+KN-93組與CLP-24 h組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。CLP-6 h組、CLP-12 h組與Sham組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各組大鼠膈肌P-RyR1蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與Sham組比較，CLP-6 h組、CLP-12 h組和CLP-24 h組的P-RyR1蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），CLP-24 h+KN-93組的P-RyR1蛋白表達(dá)水平相比于CLP-24 h組明顯降低（P＜0.05，圖4）。

圖4 各組大鼠膈肌RyR1蛋白表達(dá)及其磷酸化水平比較Fig.4 Expression and phosphorylation of RyR1 in the diaphragm of rats in each group(Mean±SD).A,B:Effect of sepsis on RyR1 expression in the diaphragm.C,D:Effect of sepsis on P-RyR1 expression in the diaphragm.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.3 膈肌CaMKⅡ表達(dá)水平

與Sham組比較，CLP-24 h組大鼠膈肌CaMKⅡ蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），CLP-24 h+KN-93組的CaMKⅡ蛋白表達(dá)水平相比于CLP-24 h組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖5）。

圖5 各組大鼠膈肌CaMKⅡ蛋白表達(dá)水平比較Fig.5 Expression of CaMK II in the diaphragm of rats in each group detected by Western blotting(Mean±SD).*P＜0.05,**P＜0.01.

3 討論

膿毒癥是由宿主對感染的反應(yīng)失調(diào)所引起的危及生命的器官功能障礙［13］，常導(dǎo)致多器官功能衰竭和死亡。本研究采用盲腸結(jié)扎穿孔的經(jīng)典方法構(gòu)建SIDD大鼠模型，觀察膿毒癥對大鼠膈肌功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，膿毒癥大鼠膈肌功能明顯降低，具體體現(xiàn)在膈肌CMAP幅值降低，時程延長，疲勞指數(shù)明顯升高以及不同頻率刺激下膈肌收縮力下降。這與以往的研究結(jié)果相同［14-16］。隨著膿毒癥時間的延長，膈肌RyR1 受體表達(dá)水平降低，CaMKⅡ和P-RyR1 水平升高。施加干預(yù)以后，膈肌CaMKⅡ和P-RyR1水平降低，膈肌功能改善。

RyR是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上釋放鈣離子的一種大型配體門控通道，Ca2+通過肌質(zhì)網(wǎng)上的RyR受體快速釋放到胞漿中，啟動興奮-收縮耦聯(lián)，引起肌肉收縮［6,17］。RyR受體改變與多種疾病的發(fā)生有關(guān)。有研究研究慢性膿毒癥對大鼠危重癥神經(jīng)肌病快肌的影響中發(fā)現(xiàn)，在建立膿毒癥模型10 d后，趾長伸肌收縮功能下降，RyR1的表達(dá)上升，雖然RyR1受體表達(dá)升高，但并不能排除RyR1受體的升高受其本身肌病的影響［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然膿毒癥6 h和12 h組大鼠表現(xiàn)出明顯的膈肌功能障礙，但其RyR1受體蛋白的表達(dá)水平并沒有顯著性的差異。但在膿毒癥24 h組RyR1受體表達(dá)表現(xiàn)出了明顯的差異，并且膈肌功能受損明顯，其也不能排除RyR1受體表達(dá)量減少對膈肌功能的影響。研究表明，就調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放而言，RyR蛋白的水平不如通道的活性重要［19,20］，因此膿毒癥導(dǎo)致膈肌功能障礙可能是RyR1表達(dá)下降與RyR1活性改變共同作用的結(jié)果。

磷酸化以及去磷酸化是重要的細(xì)胞內(nèi)的傳導(dǎo)途徑。研究表明RyR過度磷酸化可以增加其對鈣離子敏感性，引起Ca2+紊亂，與心臟功能有著密切關(guān)系［21］。有研究在心力衰竭的患者中發(fā)現(xiàn)，RyR1 受體過度磷酸化使結(jié)構(gòu)發(fā)生重塑，導(dǎo)致RyR1功能障礙，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+泄露，最終心肌收縮無力［22］；在膿毒癥休克大鼠心肌中，隨著膿毒癥病情的發(fā)展，RyR受體磷酸化水平逐漸升高，心肌功能受損［8］。室性心律失常與心房顫動與RyR2受體磷酸化水平升高所致的心肌舒張期Ca2+泄露有關(guān)［23,24］，抑制CaMKⅡ，能夠減輕心房顫動的易感性［23］。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著膿毒癥病程的發(fā)展，RyR1受體的磷酸化水平逐漸升高，膈肌功能障礙逐漸加重，通過干預(yù)抑制鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II（CaMKⅡ）的表達(dá)，RyR1的磷酸化水平下降，膈肌功能改善。研究發(fā)現(xiàn)，CaMKII是一種多功能蛋白激酶，能導(dǎo)致RyR受體磷酸化導(dǎo)致其功能發(fā)生改變［8,25］，而KN-93能夠抑制CaMKII，能降低RyR受體磷酸化水平，改善脂多糖介導(dǎo)的心臟重塑及心功能障礙［26］。因此，本實驗采用KN-93進行干預(yù)后，RyR1受體的磷酸化水平降低，膈肌功能明顯的改善。研究發(fā)現(xiàn)蛋白激酶A（PKA）激活，介導(dǎo)的RyR2磷酸化對心臟的收縮功能也非常重要［27］，因此PKA 介導(dǎo)的RyR1受體磷酸化也是本研究的局限性所在，SIDD期間PKA與RyR1之間的關(guān)系也需要進一步研究。

綜上所述，膿毒癥引起的膈肌功能障礙的機制是由于CaMKII的表達(dá)水平的升高，導(dǎo)致了RyR1受體磷酸化，磷酸化的RyR1受體結(jié)構(gòu)功能發(fā)生改變，使Ca2+發(fā)生泄漏，進而導(dǎo)致膈肌的結(jié)構(gòu)功能發(fā)生改變。而針對RyR1受體的磷酸化做出有效干預(yù)，有望成為臨床新的治療靶點。