體外循環(huán)術(shù)后患者來源的腸道菌群重建對腸黏膜損傷大鼠菌群特征和炎癥反應(yīng)的影響

伊小婷，范嘉寧，刁玉剛，孫瑩杰

近些年來，不同疾病與腸道菌群之間的相關(guān)性得到了專家和學(xué)者們的廣泛關(guān)注。 有研究表明，腸道菌群類別的改變能夠影響結(jié)腸組織的發(fā)育，從而影響腸黏膜屏障的功能［1］。 腸黏膜屏障是機(jī)體阻擋非特異性感染的第一道防線，課題組前期的研究已證實(shí)心肺轉(zhuǎn)流（cardiopulmonary bypass，CPB）可通過炎癥反應(yīng)、缺血再灌注損傷、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡損傷等多種方式損傷腸黏膜屏障［2-3］，引發(fā)腸損傷。 因此，CPB 所致腸損傷的機(jī)制是否與腸道菌群的紊亂相關(guān)尚有待研究，本實(shí)驗(yàn)擬對此進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇無特定病原體成年雄性標(biāo)準(zhǔn)差大鼠共30 只，體重為400～450 g。 按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為3 組：偽無菌大鼠組（S 組）、偽無菌大鼠+接種健康人源糞菌濾液組（N 組）和偽無菌大鼠+接種行CPB 下心臟瓣膜術(shù)后患者糞菌濾液組（C 組），每組分別為10 只。 第1 天至第14 天給予S 組、N 組和C 組大鼠由甲硝唑（250 mg／kg）、氨芐西林（250 mg／kg）、硫酸新霉素（250 mg／kg）混合配制而成的抗生素雞尾酒胃管灌胃處理，每天2 次，每次2 ml；第15 天至第28 天N 組、C 組分別接受來自健康人源和行CPB 下心臟瓣膜術(shù)后患者源的糞菌移植，每天1 次。

1.2 制作糞菌懸液 將-80℃保存的糞便取出稱重，按1 ∶10 的比例加入無菌生理鹽水（1 g 糞便加入10 ml 生理鹽水），置于50 ml 的小燒杯內(nèi)，密封，放置于磁力攪拌器上攪拌15 min，離心管收集混懸液，標(biāo)記濾液體積，將混懸液4℃下離心10 min，上清液即為糞菌懸液。

1.3 糞菌移植 糞菌移植之前禁食6 h，大鼠取俯臥位，搔刮法盡量排空直腸內(nèi)留存糞便，在內(nèi)徑2 mm 塑料軟管表面涂抹無菌生理鹽水潤滑后輕柔置入結(jié)腸，至軟管頂端距離肛門約8 mm，緩慢注入糞菌液500 μl，輕柔拔出軟管后用無菌紗布或棉簽壓住肛門幾秒鐘，執(zhí)鼠尾使大鼠保持頭低腳高姿態(tài)約1 min 后放回籠中，1 次／d，連續(xù)14 d。

1.4 檢測指標(biāo) 建模成功后，糞菌移植14 d 后，收集各組大鼠糞便，每只大鼠取3 粒糞便貯存于-80℃冰箱供宏基因組學(xué)測序；脊椎脫臼法處死大鼠，無菌取靜脈血、離心，血清供酶聯(lián)免疫吸附（Elisa）檢測；取結(jié)腸組織置于4%多聚甲醛溶液貯存，以備光學(xué)顯微鏡下觀察；另取部分結(jié)腸組織-80℃保存，蛋白免疫印跡（Westernblot）法檢測緊密連接蛋白（zonula occludin-1，ZO-1）、閉合蛋白（occludin）的表達(dá)水平。

宏基因組學(xué)測序是對微生物群體進(jìn)行高通量測序，分析特定環(huán)境中微生物群體基因組成及功能、微生物群體的多樣性與豐度，進(jìn)而分析微生物與環(huán)境、微生物與宿主之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)具有特定功能的基因。 具體方法如下：①DNA 提?。海╝）糞便樣本加入裂解液，混勻；（b）離心取上清，加酚∶氯仿∶異戊醇（25 ∶24 ∶1），混勻，離心；（c）取上清，加氯仿∶異戊醇（24 ∶1），混勻，離心；（d）取上清，加入異丙醇，搖晃，沉淀；（e）離心后用75%乙醇洗滌2 次，吹干；（f）加入蒸餾水溶解DNA 樣品；（g）加入RNaseA加速溶劑消化RNA，37℃下放置。 ②DNA 檢測：瓊脂糖凝膠電泳分析DNA 的純度和完整性。 ③文庫構(gòu)建及質(zhì)檢。 ④上機(jī)測序。 ⑤下機(jī)質(zhì)控。 ⑥信息分析：（a）數(shù)據(jù)質(zhì)控；（b）去除宿主；（c）物種注釋；（d）常用功能數(shù)據(jù)庫注釋；（e）豐度聚類分析；（f）抗性基因注釋；（g）高級(jí)功能注釋。 ⑦測序數(shù)據(jù)處理：（a）去除接頭序列；（b）掃描序列；（c）去除最終長度小于50 bp 的序列。

1.5 HE 染色 取結(jié)腸組織置于4%多聚甲醛中固定，鹽酸緩沖液沖洗，酒精脫水過夜，蠟塊包埋后切片，HE 染色、反蘭，中性樹膠封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理學(xué)的改變。

1.6 Elisa 檢測 ①標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋；②加樣；③溫育；④配液；⑤洗滌；⑥加酶；⑦溫育；⑧洗滌；⑨顯色；⑩終止；○1 測定。

1.7 Westernblot 法檢測 將結(jié)腸組織稱重、研磨、勻漿、離心，取上清液；煮沸；配置濃縮膠、分離膠，加入樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳；舍去膠放入緩沖液，搖勻；利用濾紙、聚偏二氟乙烯蛋白印跡膜，制作夾膜，轉(zhuǎn)膜1 h；洗膜；洗膜后加入ZO-1 兔抗鼠多克隆抗體，occludin 兔抗鼠多克隆抗體，搖床孵育1 h；洗膜后加入羊抗兔免疫球蛋白IgG 多克隆抗體，放入搖床1 h；漂洗，通過電化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯影，進(jìn)而分析免疫印跡灰度值，以磷酸甘油醛脫氫酶（reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參，以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH 條帶灰度值的比值反映目的蛋白的表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩亞組設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析采用單因素方差分析，最小顯著差別法進(jìn)行兩兩比較，腸道菌群宏基因測序結(jié)果采用Student's t 檢驗(yàn)測量兩組間的差異，利用乘積矩系數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠腸道菌群宏基因組學(xué)測序結(jié)果 各組大鼠腸道菌群的聚類分析：S 組、C 組和N 組各自聚集，分區(qū)良好，提示各組大鼠種植的腸道菌群組成存在明顯差異。 見圖1、2。

圖1 各組大鼠腸道菌群的主坐標(biāo)分析

2.2 各組大鼠腸道菌群的組成及差異顯著性分析S 組、C 組和N 組腸道菌群組成在屬水平上的相對豐度如圖3 所示，克雷伯菌屬（Klebsiella）、阿克曼菌屬（Akkermansia）、普雷沃菌屬（Prevotella）和乳桿菌屬（Lactobacillus）的表達(dá)在三組中均有明顯差異。 與S 組比較，C 組和N 組克雷伯菌屬的相對豐度明顯減低（P＜0.05），而C 組和N 組間無明顯差異（P＞0.05）；與S 組比較，C 組阿克曼菌屬、普雷沃菌屬的相對豐度明顯增加（P＜0.05），而N 組和S 組間無明顯差異（P＞0.05）；與S 組比較，N 組乳桿菌屬的相對豐度明顯增加（P＜0.05），而C 組和S組間無明顯差異（P＞0.05）。 見圖3。

圖2 各組大鼠腸道菌群的非度量多維尺度分析

S 組、C 組和N 組腸道菌群組成在種水平上的相對豐度如圖4 所示，肺炎克雷伯桿菌（Klebsiella_pneumoniae）、嗜黏蛋白-艾克曼菌（Akkermansia_muciniphila）和地中海-瑪斯里菌（Mediterranea_massiliensis）的表達(dá)在三組中均有明顯差異。 與S組比較，C 組和N 組肺炎克雷伯桿菌的相對豐度明顯減低（P＜0.05），而C 組和N 組間無明顯差異（P＞0.05）；與S 組比較，C 組嗜黏蛋白-艾克曼菌的相對豐度明顯增加（P＜0.05），而N 組和S 組間無明顯差異（P＞0.05）；與S 組比較，N 組地中海-瑪斯里菌的相對豐度明顯增加（P＜0.05），而C 組和S組間無明顯差異（P＞0.05）。 見圖4。

圖4 各組大鼠腸道菌群在種水平上的變化分布圖

2.3 各組大鼠結(jié)腸病理學(xué)變化 S 組出現(xiàn)不同程度的損傷表現(xiàn)，絨毛縮短、腸黏膜水腫，細(xì)胞大量缺失并呈空泡樣變性；C 組腸黏膜層受損變短，核固縮、核深染增多；N 組黏膜層增厚，細(xì)胞形態(tài)規(guī)整，可見大量正常細(xì)胞，見圖5。

圖5 各組大鼠結(jié)腸病理學(xué)變化（HE×200）

2.4 各組炎性介質(zhì)濃度比較 與S 組比較，C 組和N 組大鼠血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 的濃度均減低（P＜0.05）；與C 組比較，N 組大鼠術(shù)后7 d 血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 的濃度明顯減低（P＜0.05），見圖6。

圖6 各組炎性因子濃度的比較

2.5 各組免疫蛋白表達(dá) 與S 組比較，C 組和N組大鼠腸組織ZO-1、occludin 表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.05）；與C 組比較，N 組大鼠腸組織ZO-1、occludin表達(dá)水平均上調(diào)（P＜0.05），見圖7。

圖7 各組大鼠ZO-1、occludin 蛋白的表達(dá)

2.6 大鼠差異性腸道菌群與炎癥反應(yīng)嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析 炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度與血清炎性因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 的水平成正相關(guān)，故將三組大鼠的腸道菌群表達(dá)豐度測得的IL-1β、IL-6 和TNF-α 的水平進(jìn)行相關(guān)性分析，研究結(jié)果提示普雷沃菌屬、副沙門氏菌屬、腸桿菌屬、阿克曼菌屬、腸球菌屬和擬桿菌屬與炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度成正相關(guān)（r＝0.21，P＜0.05），而狄氏副擬桿菌屬、乳桿菌屬與炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度成負(fù)相關(guān)（r ＝-0.58，P＜0.05）。

3 討 論

鑒于人類在體實(shí)驗(yàn)的局限性，限制了相關(guān)的檢測和機(jī)制研究，因此可將人類菌群通過糞菌移植（fecal microbiota transplants，F(xiàn)MT）的方法移植到動(dòng)物模型上。 FMT 是指將功能菌群移植到受體的消化道中，通過重建受體的腸道菌群達(dá)到研究或治療的目的［4］，目前已成為研究腸道菌群與宿主關(guān)系的重要手段。 其優(yōu)勢在于人類的腸道菌群可通過該技術(shù)定植在無菌／偽無菌大鼠的消化道中，使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腸道菌群與人類更相近，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與人類更具相關(guān)性。

課題組前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，CPB 后的大鼠腸黏膜層縮短變薄，絨毛的上皮細(xì)胞有不同程度的變形、核固縮、核壞死，固有層存在炎性細(xì)胞浸潤以及充血水腫，證實(shí)CPB 可損傷大鼠的腸黏膜屏障［5］。 腸屏障損傷后可致大量毒性產(chǎn)物及促炎細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)而誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征以及多器官功能障礙綜合征，同時(shí)全身炎癥反應(yīng)也是CPB 促發(fā)腸損傷的相關(guān)機(jī)制之一。

已有研究表明，腸道菌群的改變與炎癥反應(yīng)息息相關(guān)，特定的腸道細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物可發(fā)揮促炎或抑制炎癥反應(yīng)的作用，進(jìn)而引發(fā)腸屏障功能的改變［6］。 此外，腸屏障功能的穩(wěn)定性還有賴于腸上皮細(xì)胞間的特定連接方式，即ZO-1 和occludin 蛋白的表達(dá)。 它們是腸上皮細(xì)胞之間相互連接的骨架結(jié)構(gòu)，構(gòu)成了腸黏膜組織的第一道防線，可防止大分子物質(zhì)在細(xì)胞間隙之間任意進(jìn)出，維持腸黏膜上皮的穩(wěn)定性，保護(hù)腸屏障功能的完整性。 本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腸道菌群作為干預(yù)因素時(shí)，偽無菌組大鼠血清的IL-1β、IL-6 和TNF-α 表達(dá)水平最高，炎性反應(yīng)最明顯，腸組織ZO-1、occludin 的表達(dá)水平最低；與偽無菌大鼠比較，接受CPB 術(shù)后患者菌群移植的大鼠血清炎性因子表達(dá)有所減低，ZO-1、occludin 蛋白的表達(dá)水平均增加；而接受健康人菌群移植的大鼠血清炎性因子表達(dá)水平最低，ZO-1、occludin 蛋白的表達(dá)水平最高。 各組大鼠腸道菌群的組成及差異顯著性分析，炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度可能與普雷沃菌屬、阿克曼菌屬的相對豐度增加，肺炎克雷伯菌的相對豐度減低有關(guān)。 現(xiàn)有研究表明，普雷沃菌屬具有較強(qiáng)的炎性特性，能刺激腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-8、IL-6 等炎性因子，從而介導(dǎo)黏膜炎癥反應(yīng)的發(fā)生，提示某些普雷沃菌株可能為臨床上重要的致病菌，可通過促進(jìn)慢性炎癥參與人類的相關(guān)疾病［7］。 而阿克曼菌屬一般被認(rèn)為是益生菌，可以降解腸黏膜的黏蛋白，降低肥胖、Ⅱ型糖尿病的發(fā)病率。 然而，最新研究發(fā)現(xiàn)在高糖飲食的小鼠體內(nèi)阿克曼菌屬的相對豐度過高，結(jié)腸組織黏膜層變薄，腸屏障功能受損，導(dǎo)致結(jié)腸炎的誘發(fā)和惡化［8］。 而本研究中，普雷沃菌屬和阿克曼菌屬均為炎癥水平升高組中的特征性腸道菌群，提示腸道菌群確實(shí)可參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展，進(jìn)而導(dǎo)致腸黏膜屏障損傷，且不同的特征性腸道菌群可發(fā)揮不同的促炎作用。

綜上所述，CPB 后腸道菌群的改變所引起的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)是導(dǎo)致腸屏障功能損害的機(jī)制之一。 這可能是因?yàn)槠绽孜志鷮俸桶⒖寺鷮俚南鄬ωS度增加，促進(jìn)了有毒產(chǎn)物和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，損傷了腸屏障，進(jìn)而引發(fā)腸損傷。