新建輔助生殖實(shí)驗(yàn)室體外受精胚胎培養(yǎng)技術(shù)的小鼠實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)

桂俊豪 楊楠 常艷艷 蘇雪梅

體外受精(In vitro Fertilization,IVF)和胚胎移植(Embryo Transfer,ET)是臨床上治療不孕癥的重要技術(shù)手段。在人類(lèi)輔助生殖技術(shù)(ART)實(shí)踐中,胚胎培養(yǎng)室是人類(lèi)配子操作和胚胎培育的核心功能區(qū),受多種復(fù)雜因素影響,其中胚胎培養(yǎng)環(huán)境的氣體質(zhì)量、培養(yǎng)體系的可靠性及穩(wěn)定性、人工操作質(zhì)控水平等至關(guān)重要,事關(guān)配子機(jī)能穩(wěn)定性及相互作用、胚胎發(fā)育質(zhì)量和IVF-ET周期的治療結(jié)局[1-2]。既往研究表明,鼠胚實(shí)驗(yàn)(Mouse Embryo Assay,MEA)[3]是綜合性評(píng)價(jià)胚胎培養(yǎng)室合格與否的有效方法。本文通過(guò)MEA對(duì)本院生殖醫(yī)學(xué)中心新建胚胎培養(yǎng)室的培養(yǎng)體系和操作穩(wěn)定性進(jìn)行了臨床前評(píng)估,現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雌性昆明鼠(4～6周齡,體重25～35 g)、雄性昆明鼠(8周齡以上,體重40～50 g)購(gòu)自新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心,飼養(yǎng)溫度21～25 ℃,水、飼料供應(yīng)充足。每批雌鼠均在計(jì)劃實(shí)驗(yàn)前20 d開(kāi)始飼養(yǎng)。

2.試劑耗材:獸用PMSG和HCG(1 000 IU粉劑/支)均購(gòu)自寧波三生藥業(yè),HCG用0.9%生理鹽水5mL稀釋為200 IU/mL的濃儲(chǔ)液儲(chǔ)存,PMSG用5 mL PMSG稀釋液稀釋成200 IU/mL的濃儲(chǔ)液,-20℃保存?zhèn)溆?。G-MOPS PLUS、G-IVF PLUS、G-1 PLUS、G-2 PLUS和石蠟油均為Vitrolife公司產(chǎn)品。3001皿、四孔皿、1 mL移液管、10 mL移液管均購(gòu)自FALCON公司;高純度氮?dú)?99.999%)、高純二氧化碳?xì)?99.999%)購(gòu)自大連大特氣體有限公司。

3.主要儀器設(shè)備:Stemi 508 體視顯微鏡購(gòu)自德國(guó)卡爾蔡司公司;G-185三氣培養(yǎng)箱、C-60二氧化碳培養(yǎng)箱分別購(gòu)自丹麥K-system公司和德國(guó)Labtech公司;ECLIPSETi倒置顯微鏡為日本尼康公司產(chǎn)品;Sterile180工作站購(gòu)自丹麥IVFtech公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.實(shí)驗(yàn)分組:按照受精方式不同,采用配對(duì)隨機(jī)化設(shè)計(jì),將促排雌鼠隨機(jī)分為體內(nèi)受精組和體外受精組,共7批次兩組各20個(gè)周期。以其中一個(gè)批次的配對(duì)隨機(jī)化為例,首先將20只雌鼠編為1～20號(hào)后稱(chēng)重,同體重或體重非常接近的兩只雌鼠配成一個(gè)對(duì)子,共配成10對(duì)并依次編為A～J,然后從“隨機(jī)數(shù)字表”的任何一頁(yè)、任何一處開(kāi)始,以一定方向抄下10個(gè)數(shù)字并依次排在配對(duì)號(hào)下,分組時(shí),凡隨機(jī)數(shù)字為單數(shù)者,該對(duì)子中的第一只雌鼠分入甲組,而同對(duì)子中的另一只雌鼠歸入乙組,若隨機(jī)數(shù)字為雙數(shù),就把該對(duì)子中的第一只雌鼠分入乙組,而同對(duì)子中的另一只雌鼠則歸入甲組。

體內(nèi)受精組與雄性小白鼠交配,D1獲取體內(nèi)受精胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng);體外受精組直接獲取卵母細(xì)胞,通過(guò)體外受精后進(jìn)行體外培養(yǎng)。

2.體外受精:(1)促排卵和鼠卵采集。體外受精組雌性小鼠于18:00進(jìn)行腹腔注射PMSG 10 IU,48 h后腹腔注射HCG 10 IU。16～18 h后頸椎脫臼法處死雌鼠,在無(wú)菌條件下取出膨大的輸卵管,放入盛有G-MOPS PLUS的培養(yǎng)皿中,用一次性1 mL注射器刺破輸卵管膨大部,將卵母細(xì)胞團(tuán)收集到G-IVF PLUS受精皿中,放入37 ℃,5% CO2,90%濕度的培養(yǎng)箱。(2)鼠精采集和獲能。頸椎脫臼法處死雄鼠并開(kāi)腹,在無(wú)菌條件下分離附睪尾放入G-IVF PLUS受精液中,用一次性1 mL注射器小心刺破輸精管,輕輕擠壓出精子,收集精子懸浮液,放入37℃、6% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中獲能30～60 min。(3)體外受精及胚胎觀察。采用四孔皿集中受精法。記錄獲卵數(shù),將所獲鼠卵分配至四孔皿中,每孔10～20個(gè)卵不等;吸取獲能精子懸液到含有卵子的培養(yǎng)液中,放入37 ℃、6% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育。受精后20 h觀察2-細(xì)胞,30～40 h 觀察4-細(xì)胞,60～70 h觀察8-細(xì)胞及桑葚胚,90 h后觀察囊胚。

3.體內(nèi)受精:同日下午18:00,將體內(nèi)受精組注射HCG后的雌鼠與雄鼠按1:1比例合籠,次日早晨觀察雌鼠的陰道栓形成情況。將有陰道栓的雌鼠處死,獲取卵子。獲取2-細(xì)胞方法同體外受精組。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:計(jì)錄卵裂數(shù)和囊胚形成數(shù),其中如受精卵分裂成為2-細(xì)胞胚胎即認(rèn)為卵裂,分別計(jì)算2-細(xì)胞卵裂率(即2-細(xì)胞數(shù)/獲卵數(shù))和囊胚形成率(即囊胚形成數(shù)/2-細(xì)胞數(shù))。應(yīng)用SPSS 19.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,χ2檢驗(yàn)用于率的比較;P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、鼠胚發(fā)育的形態(tài)學(xué)觀察(×100)

促排后獲得小鼠卵母細(xì)胞團(tuán)見(jiàn)圖1A,圖1B至圖1F依次為受精卵(圖1B)、2-細(xì)胞鼠胚(圖1C)、4-細(xì)胞和8-細(xì)胞鼠胚(圖1D)、桑葚胚(圖1E)和囊胚(圖1F)。

圖1 小鼠卵母細(xì)胞體外受精后的胚胎發(fā)育(×100)Fig 1 Embryo development ofin vitro fertilized mouse oocytes(×100)

二、卵裂率和囊胚形成率

體內(nèi)受精組和體外受精組分別開(kāi)展了7批次各20 個(gè)周期的胚胎培養(yǎng)。IVF 周期共獲卵805 枚,結(jié)果見(jiàn)表1,其中 2-細(xì)胞胚胎數(shù)720 枚,卵裂率為89.4%,形成囊胚656 個(gè),囊胚形成率為90.3%(表1)。

表1 昆明小鼠體外受精(IVF)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Data analysis of in vitro fertilization experiments in Kunming breed mice

體內(nèi)受精組共獲卵752 枚,其中 2-細(xì)胞胚胎數(shù)708個(gè),卵裂率為94.1%,形成囊胚652 個(gè),囊胚形成率為92.1%(表2)。

表2 昆明小鼠體內(nèi)受精體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Data analysis of in vivo fertilization experiments of Kunming breed mice

體內(nèi)受精和IVF 周期的比較見(jiàn)表3,體內(nèi)受精組卵裂率顯著高于體外受精組(P<0.05),而兩組間囊胚形成率無(wú)顯著差異。

表3 體外受精組和體內(nèi)受精組的結(jié)果比較Tab 3 Comparison betweenin vitro and in vivo fertilization groups

討 論

在新裝修的胚胎培養(yǎng)室內(nèi)部環(huán)境下開(kāi)展鼠胚實(shí)驗(yàn)(MEA),建立合理化配子及胚胎操作流程,考察新建胚胎培養(yǎng)室環(huán)境可靠穩(wěn)定性和人員配子及胚胎操作熟練程度,為新建胚胎培養(yǎng)室的臨床前應(yīng)用提供保證[4-8]。鼠胚實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵環(huán)節(jié)主要涉及雌鼠控制性促排卵、鼠卵體外受精和受精卵體外培養(yǎng),期間所涉及的胚胎培養(yǎng)室環(huán)境質(zhì)量、設(shè)備、材料、試劑和方法等步驟與開(kāi)展人類(lèi)輔助生殖技術(shù)流程和要求具有通用性,因此,鼠胚實(shí)驗(yàn)中受精鼠卵的卵裂率、囊胚形成率等是綜合判斷新建胚胎培養(yǎng)室環(huán)境、材料質(zhì)量和人員基本技術(shù)水平的主要常用指標(biāo)。

本研究采用體內(nèi)受精和體外受精方法,共開(kāi)展了7個(gè)批次、兩組各20個(gè)周期的鼠胚實(shí)驗(yàn),體內(nèi)受精和IVF組分別獲得受精卵752和805個(gè),體內(nèi)、體外兩組的總體卵裂率分別為94.1%和89.4%,體內(nèi)受精組的卵裂率明顯高于體外受精組,可能與每批次小鼠個(gè)體差異、對(duì)環(huán)境適應(yīng)性不同以及對(duì)促排卵藥物的反應(yīng)性差異有關(guān),體外受精組略低于體內(nèi)受精組,也可能受胚胎體外操作期間環(huán)境應(yīng)激影響。數(shù)據(jù)表明,體外受精組的卵裂率介于85.3%～94.1%之間、囊胚形成率介于87.7%～92.7%之間,體內(nèi)受精組的卵裂率和囊胚形成率分別介于91.4%～100%之間和88.6%～100%之間,總體上均高于85%的要求。體內(nèi)、體外兩組實(shí)驗(yàn)的整體囊胚形成率分別為92.1%和90.3%,組間未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。上述結(jié)果說(shuō)明,本新建實(shí)驗(yàn)室的體外受精胚胎培養(yǎng)體系及人員操作技術(shù)水平達(dá)標(biāo)常規(guī)開(kāi)展ART的基本需求。