乳酸及代謝在生殖疾病中的作用研究進(jìn)展

段子博 張可心 李博 代亞利 林曉華 邊文會(huì) 李艷青

乳酸,也稱為2-羥基丙酸,一直以來(lái)都被認(rèn)為是糖酵解過(guò)程中產(chǎn)生的代謝廢物,但已有許多研究證實(shí)乳酸在多種細(xì)胞過(guò)程中起著關(guān)鍵作用,包括在能量調(diào)節(jié)、免疫耐受性、傷口愈合、癌癥發(fā)展等方面[1]。近期研究發(fā)現(xiàn),在胚胎植入過(guò)程中也會(huì)產(chǎn)生大量的乳酸,并且乳酸在其中發(fā)揮著重要的作用。

一、乳酸代謝的生理過(guò)程

葡萄糖是維持人體生命活動(dòng)的重要物質(zhì)之一,人體主要通過(guò)糖酵解、磷酸戊糖途徑和氧化磷酸化三種途徑來(lái)利用葡萄糖。通常僅在缺氧的情況下,機(jī)體才啟用糖酵解途徑。在有氧條件下,哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)存在著巴斯德效應(yīng),即氧可以降低糖類的分解代謝和減少糖酵解產(chǎn)物的積累[2]。在糖酵解過(guò)程中,葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將葡萄糖轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中,然后在6-磷酸果糖激酶-1、丙酮酸激酶、己糖激酶等相關(guān)酶的催化作用下轉(zhuǎn)化為丙酮酸。有氧條件下,丙酮酸通過(guò)三羧酸循環(huán)被完全氧化產(chǎn)生大量的ATP,而缺氧條件下丙酮酸則在乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)催化下生成乳酸[3]。乳酸有D-乳酸和L-乳酸兩種形式,都是通過(guò)LDH轉(zhuǎn)化而成[4]。因LDH存在異構(gòu)體特異性,所以D-乳酸的轉(zhuǎn)化需要通過(guò)D-LDH,L-乳酸則需要通過(guò)L-LDH轉(zhuǎn)化[5]。由于人類細(xì)胞僅含有L-LDH,因此在人類中產(chǎn)生的乳酸幾乎都是L-乳酸[4-6]。

當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行糖酵解時(shí),為避免細(xì)胞內(nèi)積累導(dǎo)致負(fù)反饋抑制糖酵解過(guò)程,需要將細(xì)胞中產(chǎn)生的乳酸運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外部[7],同時(shí)以乳酸作為能量底物的細(xì)胞需要將細(xì)胞外乳酸運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞中[8]。乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)主要依靠一羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(monocarboxylate transporter,MCT)和G蛋白偶聯(lián)受體81(G-coupled protein receptor,GPR81)完成。MCT最常見的類型是MCT1和MCT4,其中MCT1在腫瘤細(xì)胞中表達(dá),是乳酸的高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,其主要功能是將細(xì)胞外乳酸運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞中[9],但在缺氧條件下,MCT1也可以介導(dǎo)乳酸從細(xì)胞內(nèi)運(yùn)出[10]。MCT4主要在高度糖酵解細(xì)胞中表達(dá),是乳酸的低親和力轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,負(fù)責(zé)將乳酸從細(xì)胞內(nèi)運(yùn)出,MCT4的表達(dá)受缺氧作用的調(diào)控,缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)可以上調(diào)MCT4的表達(dá)以促進(jìn)乳酸輸出[9]。GPR81在大多數(shù)腫瘤中高度表達(dá),生理濃度的乳酸就可以激活GPR81在腫瘤存活、轉(zhuǎn)移和血管生成等活動(dòng)中發(fā)揮作用[11]。

二、乳酸代謝與妊娠

在胚胎植入前,哺乳動(dòng)物的胚胎代謝發(fā)生了巨大的變化。在形成桑葚胚前,胚胎對(duì)能量的需求較低,此時(shí)胚胎的能量主要來(lái)源于丙酮酸的氧化。隨著胚胎的發(fā)育,葡萄糖的消耗量逐漸增加[12],當(dāng)發(fā)育到囊胚階段時(shí),葡萄糖則成為主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),存活的囊胚表現(xiàn)出高水平的葡萄糖攝取[13]。在小鼠和人囊胚中,超過(guò)50%的葡萄糖在有氧條件下轉(zhuǎn)化為乳酸,而沒(méi)有被氧化消耗[14-15]。這種在有氧條件下葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸的特殊過(guò)程由Warburg首次提出,因此被稱為瓦氏效應(yīng)(Warburg effect),也稱作有氧糖酵解[16]。最開始瓦氏效應(yīng)被認(rèn)為特定存在于某些腫瘤中,而后證實(shí)某些如淋巴細(xì)胞這類快速增殖的細(xì)胞也具備此特點(diǎn)[17]。保守估計(jì),在植入前后小鼠和人類囊胚每胚胎每小時(shí)將分別消耗約50～320 pmols葡萄糖,其中消耗的90%葡萄糖的將形成乳酸[18]。無(wú)論是常氧條件還是缺氧條件下,在囊胚中檢測(cè)Hk2(hexokinase 2)、Pkm2(pyruvate kinase M2)、Pdk1(phosphoinositide dependent protein kinase 1)及LDHA等糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)并無(wú)差異[19]。在胚胎植入的過(guò)程中,由于植入部位缺乏母體血管而形成相對(duì)缺氧的環(huán)境,低氧條件將激活的缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α),并且研究表明HIF-1α能推動(dòng)小鼠胚胎干細(xì)胞完全依靠糖酵解來(lái)獲取能量[20]。在囊胚晚期和早期胚胎植入階段,LDH亞型從有利于丙酮酸形成的LDHB亞型轉(zhuǎn)變成有利于乳酸形成LDHA亞型,這也與腫瘤細(xì)胞侵襲的特點(diǎn)相同[21-22]。以上都表明在囊胚中存在著瓦式效應(yīng)并產(chǎn)生大量乳酸。在人類和其他哺乳動(dòng)物中,胎兒循環(huán)中的乳酸水平顯著高于母體循環(huán)[29]。因此乳酸可能作為一種能量來(lái)源用于各種胎兒組織的發(fā)育,與其在腫瘤發(fā)展中起著相同的作用。

胎盤中也存在著有氧糖酵解,葡萄糖在胎盤中被代謝產(chǎn)生的乳酸,是胎兒的生長(zhǎng)的關(guān)鍵能源[23]。在小鼠蛻膜細(xì)胞中,黃體酮通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路激活HIF-1α以維持有氧糖酵解產(chǎn)生大量的乳酸[24]。在蛻膜免疫細(xì)胞中,活化的巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞的一個(gè)重要特征就是細(xì)胞從氧化磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)橛醒跆墙徒鈁25-26],并且在淋巴細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了增強(qiáng)的有氧糖酵解在特定時(shí)期產(chǎn)生乳酸[17]。因此,囊胚、胎盤和蛻膜免疫細(xì)胞可能在妊娠早期通過(guò)有氧糖酵解產(chǎn)生大量的乳酸,在母胎界面創(chuàng)造一個(gè)細(xì)胞外低pH值的微環(huán)境。

此外,在健康育齡婦女的陰道中也發(fā)現(xiàn)大量乳酸,在參與陰道的抗菌和免疫調(diào)節(jié),優(yōu)化上皮細(xì)胞功能,維持妊娠延長(zhǎng)至足月等方面發(fā)揮作用[27]。

三、乳酸促進(jìn)胚胎著床的機(jī)制研究

乳酸通過(guò)促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞蛻膜化、促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞外基質(zhì)降解、誘導(dǎo)血管生成、影響免疫調(diào)節(jié)等方式參與胚胎著床的過(guò)程。

1.乳酸促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞蛻膜化:在腫瘤細(xì)胞中乳酸可以作為代謝底物來(lái)滿足其能量需求,例如在缺氧區(qū)域,腫瘤細(xì)胞通過(guò)MCT4排出乳酸,并在有氧區(qū)域通過(guò)MCT1攝取乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸,為需氧細(xì)胞氧化磷酸化提供燃料,從而為糖酵解的癌細(xì)胞節(jié)省可利用的葡萄糖[28]。在妊娠早期,未分化的蛻膜細(xì)胞也可以通過(guò)MCT1導(dǎo)入乳酸從而加速細(xì)胞增殖,并且抑制的乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)會(huì)導(dǎo)致蛻膜化失敗[24]。

2.乳酸促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞外基質(zhì)降解:控制子宮內(nèi)膜細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrixc,ECM)的降解以促進(jìn)滋養(yǎng)層的侵蝕是胚胎植入的關(guān)鍵過(guò)程之一[30],而基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)則是降解ECM的關(guān)鍵蛋白酶。其中MMP-2和MMP-9在月經(jīng)周期和懷孕期間的子宮內(nèi)膜組織重塑中發(fā)揮著重要作用[31]。已發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中,乳酸可以通過(guò)上調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2(transforming growth factor-beta2,TGF-β2)表達(dá)來(lái)增強(qiáng)MMP2的水平,從而促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移[32]。在妊娠過(guò)程同樣發(fā)現(xiàn)蛻膜組織中調(diào)節(jié)T細(xì)胞(regulatory T cells,Treg細(xì)胞)聚集并產(chǎn)生TGF-β[33],并且在植入期人子宮內(nèi)膜腔上皮和腺上皮中也能發(fā)現(xiàn)TGF-β1和TGF-β2的存在[34]。由此推測(cè)乳酸可能通過(guò)增強(qiáng)子宮內(nèi)膜細(xì)胞和Treg細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β,從而增加MMPs的產(chǎn)生以促進(jìn)ECM的降解。

囊胚創(chuàng)造的細(xì)胞外部低pH的微環(huán)境同樣有利于MMPs的激活[35]。MMPs受內(nèi)源性金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TIMP)的調(diào)控,而MMP/TIMP的比值通常決定了ECM蛋白降解和組織重塑的程度[35]。已證明在髓核細(xì)胞中,低pH值使TIMPs的產(chǎn)生減少了90%,而基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生幾乎不受影響。因此,低pH值使這些酶的相對(duì)活性出現(xiàn)不平衡也有利于促進(jìn)ECM的分解[36]。

組織蛋白酶B也與哺乳動(dòng)物囊胚細(xì)胞外分解ECM相關(guān)[37]。在小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞分化過(guò)程中,組織蛋白酶B和D的表達(dá)上調(diào)對(duì)于胚胎的正常發(fā)育和子宮蛻膜化是至關(guān)重要的。在早孕母羊子宮內(nèi)膜中也觀察到組織蛋白酶的表達(dá)上調(diào),并且在母胎妊娠識(shí)別過(guò)程中活性增加。自1細(xì)胞到桑椹胚階段組織蛋白酶B和D的表達(dá)水平很高,并且抑制組織蛋白酶的表達(dá)作用將阻止胚胎發(fā)育。因此組織蛋白酶家族,特別是組織蛋白酶B,在胚胎植入和發(fā)育中具有重要作用[38]。在許多癌癥中都可發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶B的表達(dá)升高,并且與患者的生存率密切相關(guān),并有研究表明組織蛋白酶在酸性條件下最活躍,細(xì)胞周圍低pH環(huán)境更有利于組織蛋白酶以活性形式釋放[39]。由此推測(cè)在乳酸也可能通過(guò)上調(diào)組織蛋白酶B的表達(dá)而加速ECM的分解。

綜上所述,乳酸形成的低pH值環(huán)境可能通過(guò)增加MMPs和組織蛋白酶的產(chǎn)生,從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜組織ECM的分解,使胚胎能夠順利植入。

3.乳酸誘導(dǎo)血管生成:血管生成是正常著床和胎盤形成的關(guān)鍵組成部分,而血管成分在妊娠早期發(fā)揮著重要作用,許多蛋白酶,代謝物,離子,生長(zhǎng)因子,細(xì)胞因子,基質(zhì)蛋白都參與血管生成的過(guò)程。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一種多功能因子,主要參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化和存活以及血管通透性[40]。研究發(fā)現(xiàn)VEGF在囊胚植入期間增多并作為子宮血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[41]。TGF-β1蛋白參與母胎界面的精子發(fā)生、排卵、植入、滋養(yǎng)層細(xì)胞分化、血管生成和免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程。體外研究表明,TGF-β1可以直接在脈絡(luò)膜上誘導(dǎo)血管生成,也可以通過(guò)增加滋養(yǎng)層細(xì)胞中的VEGF表達(dá)間接誘導(dǎo)血管生成[41]。

乳酸誘導(dǎo)的酸中毒已被證明可以增加腫瘤細(xì)胞中VEGF的表達(dá)而刺激內(nèi)皮細(xì)胞遷移,并且能促進(jìn)VEGF活性形式的釋放以刺激新血管的發(fā)育[18]。傷口愈合過(guò)程中乳酸可以誘導(dǎo)VEGF和TGF-β等介質(zhì)的釋放,從而刺激血管生成并促進(jìn)傷口愈合[42]。因此推測(cè)乳酸可能通過(guò)腫瘤發(fā)展和傷口愈合中類似的機(jī)制來(lái)促進(jìn)囊胚植入過(guò)程中血管的生成。

4.乳酸影響免疫調(diào)節(jié):在腫瘤細(xì)胞中,活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞(natural killer cells)會(huì)通過(guò)有氧糖酵解產(chǎn)生乳酸,細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的乳酸依賴于濃度梯度排出到細(xì)胞外。因此腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的乳酸在細(xì)胞外積累進(jìn)而抑制活化T細(xì)胞內(nèi)的乳酸排出,乳酸在T細(xì)胞內(nèi)積累減緩能量代謝并最終誘導(dǎo)抑制表型的形成[43-44]。并且乳酸通過(guò)抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)的增殖和細(xì)胞因子(Interleukin 2,IL-2和interferon-γ,IFN-γ)的產(chǎn)生來(lái)降低它們的細(xì)胞毒性活性[44]。因此囊胚產(chǎn)生的乳酸抑制T細(xì)胞的代謝和功能可能是調(diào)節(jié)胚胎植入中局部免疫反應(yīng)的機(jī)制之一。

Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在維持妊娠和預(yù)防相關(guān)并發(fā)癥中發(fā)揮著重要的作用,在孕婦血液、子宮及胎盤中可發(fā)現(xiàn)大量Treg細(xì)胞的積累[45],研究發(fā)現(xiàn)乳酸不會(huì)降低Treg細(xì)胞的增殖與免疫抑制作用[46],并且在乳腺癌細(xì)胞中乳酸還可誘導(dǎo)幼稚的CD4+細(xì)胞分化成Treg細(xì)胞[47],乳酸的積累將更有利于Treg細(xì)胞的存在和發(fā)揮功能。

胎兒-母體免疫耐受性的建立依賴Treg細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的共同調(diào)節(jié),TGF-β1在其中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。TGF-β1通過(guò)誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的產(chǎn)生和維持其免疫抑制功能,介導(dǎo)M1/M2巨噬細(xì)胞的平衡,并調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的功能,從而參與維持胎兒-母體免疫耐受性[48]。與非孕女性相比,孕婦血清的TGF-β值明顯升高[49]。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中已證實(shí),乳酸可以誘導(dǎo)細(xì)胞中TGF-β的表達(dá)增加[32],因此推測(cè)妊娠女性體內(nèi)增加的TGF-β可能也與乳酸的積累有關(guān)。

在胚胎植入處還可發(fā)現(xiàn)大量的巨噬細(xì)胞,有人推測(cè)這有助于子宮內(nèi)膜組織重塑以適應(yīng)胚胎外組織增殖[50]。研究發(fā)現(xiàn),在腫瘤細(xì)胞中乳酸是誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化為具有下調(diào)免疫應(yīng)答能力的M2樣表型的信號(hào),并且誘導(dǎo)了高水平的VEGF和精氨酸酶1(arginase 1,Arg1)的表達(dá)[51],這可能與巨噬細(xì)胞在胚胎植入中的作用機(jī)制一致。

四、乳酸與生殖相關(guān)疾病

多種生殖相關(guān)疾病都具有乳酸代謝異常的表現(xiàn),對(duì)乳酸作用機(jī)制的研究有助于揭示此類生殖相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制,指導(dǎo)疾病的治療。

1.子宮內(nèi)膜異位癥是導(dǎo)致女性不孕的病因之一。有研究發(fā)現(xiàn)腹膜型子宮內(nèi)膜異位癥女性腹膜液中的TGF-β1水平和乳酸濃度較正常女性顯著增加,并且乳酸濃度與腹膜液中TGF-β濃度呈正相關(guān)。TGF-β1可增加糖酵解途徑中關(guān)鍵酶的表達(dá)和腹膜間皮細(xì)胞中乳酸的產(chǎn)生,為子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞提供高能量代謝物,以促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥病變的發(fā)展。而乳酸同樣可以激活潛伏的TGF-β1,可能形成TGF-β1和乳酸增加的正反饋回路。已有研究證明乳酸增加可以激活TGF-β配體從而誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞分化,這可能與導(dǎo)致相鄰腹膜或病變內(nèi)的上皮發(fā)生間充質(zhì)轉(zhuǎn)變,再次促進(jìn)異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞侵襲的機(jī)制相同。綜上,腹膜組織和腹膜液內(nèi)增加的乳酸可能有利于異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞的存活,植入并入侵腹膜,引起子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生[52]。

2.胎盤代謝葡萄糖產(chǎn)生的乳酸是胎兒生長(zhǎng)的關(guān)鍵能源,在滋養(yǎng)層細(xì)胞中,水通道蛋白9(aquaporin 9,AQP9)可能與單羧酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(MCT)一起作為乳酸的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)揮作用。Yollyseth[53]等人通過(guò)研究提出先兆子癇中的增強(qiáng)的氧化應(yīng)激可能會(huì)損害AQP9作為乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能,從而損害胎盤對(duì)乳酸的利用,促進(jìn)更多活性氧的積累并對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞的存活產(chǎn)生不利影響。滋養(yǎng)層細(xì)胞在此情況下可能會(huì)加強(qiáng)凋亡細(xì)胞的脫落,使其進(jìn)入母體循環(huán),從而導(dǎo)致以全身性的內(nèi)皮功能紊亂為特點(diǎn)的孕產(chǎn)婦綜合征。

3.多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是一種與代謝紊亂相關(guān)的原發(fā)性排卵功能障礙疾病。在正常卵巢中顆粒細(xì)胞通過(guò)糖酵解代謝葡萄糖產(chǎn)生乳酸和丙酮酸,其中產(chǎn)生的丙酮酸用于卵母細(xì)胞的能量來(lái)源,成熟的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物(cumulus-oocyte complex,COC)消耗的葡萄糖和丙酮酸是未成熟卵母細(xì)胞復(fù)合物的兩倍,隨著COC成熟發(fā)展,葡萄糖、丙酮酸鹽和氧氣消耗也逐漸增加[54]。與年齡和體重匹配的正常女性相比,PCOS女性外周胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取減少了35-45%[55]。D.Maruthini[56]等人的研究證明卵巢顆粒細(xì)胞除了減少葡萄糖攝取外,還優(yōu)先將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸從而減少了丙酮酸的產(chǎn)生。由于涉及到卵母細(xì)胞發(fā)育和成熟的關(guān)鍵能量底物的丙酮酸產(chǎn)生減少,卵母細(xì)胞質(zhì)量也受到負(fù)面影響。

在胚胎植入和發(fā)育過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的乳酸,研究證明乳酸不應(yīng)被看作糖酵解的副產(chǎn)物,而應(yīng)被視為胚胎植入中關(guān)鍵的信號(hào)分子并在這個(gè)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。乳酸在母胎界面中的作用雖尚未明確,但基于胚胎植入與腫瘤發(fā)展中相似的生物學(xué)行為,可以推測(cè)出乳酸可能在促進(jìn)組織分解中以利于胚胎植入,傳遞信號(hào)以促進(jìn)血管生成,調(diào)節(jié)免疫以防止母體排斥反應(yīng)等方面發(fā)揮作用。進(jìn)一步研究乳酸在胚胎植入中的作用可以幫助我們深入了解更多妊娠相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制,從而解決許多臨床治療中的問(wèn)題。