年齡對不明原因不育男性精子運動參數(shù)及DNA損傷的影響

郭麗媛 黎青 王曉蔓

不孕不育是當(dāng)今生殖健康領(lǐng)域的重大問題之一,其中男性不育約占50%[1-2],傳統(tǒng)的常規(guī)精液參數(shù)包括精子的濃度及活力等指標(biāo),是男性生育情況評估的基礎(chǔ)[3]。隨著計算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)(computer-aided sperm analysis,CASA)在男科實驗室的推廣應(yīng)用,臨床上不僅能獲得精子濃度及活力等常規(guī)參數(shù),還可以獲得更客觀、準(zhǔn)確的精子運動參數(shù),包括平均路徑速率(average path velocity,VAP)、曲線速率(curvilinear velocity,VCL)、直線速率(straight-line velocity,VSL)、精子頭側(cè)擺幅度(amplitude of lateral head displacement,ALH)、前向性(straightness,STR)、直線性(linearity,LIN)和鞭打頻率(beat-cross frequency,BCF)。這些指標(biāo)可以間接反映人類精子的受精能力,但在臨床中仍未得到充分重視。不明原因男性不育癥(unexplained male infertility,UMI)指常規(guī)精液分析結(jié)果正常且排除身體及內(nèi)分泌失調(diào)的男性不育癥,其發(fā)病率約為15%[4]。目前關(guān)于CASA分析獲得的精子運動參數(shù)對UMI患者的檢測意義尚不清楚。

近年來,精子DNA損傷的評估也是男性不育癥的一個研究熱點。既往研究表明精子DNA損傷與許多生殖健康的指標(biāo)密切相關(guān),包括受精、胚胎質(zhì)量、著床、臨床妊娠、自然流產(chǎn)、先天性畸形和兒童疾病等[5-8]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在UMI患者中有相當(dāng)一部分人的精子DNA碎片非常高[9]。同時隨著年齡的增長,男性的精子DNA完整性也變得更差[10-13]。全國二孩政策開放以后,高齡男性的生育問題備受關(guān)注。而國內(nèi)關(guān)于UMI患者年齡與精子DNA損傷的關(guān)系鮮有報道,本文旨在研究UMI患者的年齡與其精子活力、精子運動參數(shù)及DNA損傷的關(guān)系,為UMI的臨床診治提供有用的信息。

對象與方法

1.研究對象:本文對2013年1月—2018年12月在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院不孕不育?？崎T診就診的400例UMI患者進(jìn)行回顧性分析。納入標(biāo)準(zhǔn):男性,發(fā)育正常,BMI <24 kg/m2;無遺傳病、傳染病;否認(rèn)吸煙史;不存在性功能異常和射精障礙;2次精液分析結(jié)果正常(精子濃度≥15×106/mL,PR% ≥32%并且正常形態(tài)精子百分率≥4%);與配偶未采取避孕措施,有規(guī)律性生活至少12個月未能獲得臨床妊娠[14]并排除女方不孕因素而未找到明確原因。按照年齡將UMI患者分為二組:<35歲組(276例)和≥35歲組(124例)。所有研究對象的樣本及信息采集皆通過廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

2. 精液分析:所有研究對象禁欲2～7 d,手淫法收集精液于無菌取精杯中,37°C 孵育待其完全液化后,按照WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》 (第5版) 進(jìn)行顯微鏡濕片初檢后,采用計算機(jī)輔助精子分析(CASA)系統(tǒng) (Hamilton Thorne IVOSⅠ,USA) 檢測精子濃度、活力及精子運動參數(shù)(VAP、VSL、VCL、ALH、STR、LIN和BCF):取混勻后的精液樣本6 μL加入固定蓋片計數(shù)板(Leja公司,深度20 μm),將計數(shù)板放入CASA分析儀中預(yù)熱后分析20個視野,每個樣本掃描精子總數(shù)不少于400條。根據(jù)儀器制造商的說明書設(shè)定,精子具有VAP >5 μm/s且VSL>11 μm/s則被分類為前向運動。精子形態(tài)評估采用改良巴氏染色法,光鏡下分類200條精子。

3. 精子DNA損傷檢測:采用精子染色質(zhì)擴(kuò)散(sperm chromatin dispersion,SCD)試驗檢測精子DNA缺損率。試劑盒來源于深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司,實驗步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行,光鏡下計數(shù)400條精子,分類暈環(huán)的有無和大小,小暈環(huán)、無暈環(huán)和退化表示精子核DNA斷裂,大暈環(huán)和中暈環(huán)表示精子核DNA完整。結(jié)果以DFI表示,DFI =異常精子數(shù)/計數(shù)精子總數(shù)×100%。DFI的正常參考值為小于30%。

結(jié)果

1. 不同年齡組的精子活力、運動參數(shù)及DFI水平比較:≥35歲組的PR%、VAP和VCL均低于<35歲組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩個年齡組間精子總活力、VSL、ALH、STR、LIN及BCF的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。所有研究對象總體的DFI異常率為8.5%(34/400)?！?5歲組的DFI水平及DFI異常率均高于<35歲組且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)?！?5歲組的精子DNA損傷風(fēng)險是<35歲組的2.759倍(95%CI:1.356～5.614)。見表1和表2。

表1 不同年齡組的精子活力、運動參數(shù)及DFI水平比較

表2 不同年齡組精子DFI異常率的比較

二、年齡與精子活力、運動參數(shù)及DFI的相關(guān)性分析

UMI患者年齡與PR%、總活力、VAP、VSL和VCL呈負(fù)相關(guān)(P均<0.05),而與精子DFI呈正相關(guān)(P<0.05)且具有統(tǒng)計學(xué)意義。年齡與ALH、STR、LIN和BCF的相關(guān)關(guān)系無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

表3 年齡與精子活力、運動參數(shù)及DFI的相關(guān)性分析(n=400)

討論

1.年齡與UMI患者精子運動參數(shù)的關(guān)系:CASA具有分析速度快、客觀測量精子運動參數(shù)的優(yōu)點,其提供的LIN、STR、VSL和VAP是精子前向運動的指標(biāo),VCL和BCF是精子生存能力和活力的標(biāo)志,而LIN和STR也被用來描述精子的游動模式。由于精子運動參數(shù)的準(zhǔn)確性容易受到儀器溫度、計數(shù)板深度和精子濃度等的影響,本研究由經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的資深男科實驗室技術(shù)人員進(jìn)行實驗操作,嚴(yán)格按照儀器說明書進(jìn)行設(shè)置參數(shù)和操作,初檢精子濃度>50×106/mL的標(biāo)本稀釋后再進(jìn)行精子運動參數(shù)檢測。

既往研究表明,隨著男性年齡的遞增,精液質(zhì)量呈下降趨勢[15],更有學(xué)者發(fā)現(xiàn),大于29歲的男性其精液體積、形態(tài)及活動力的異常率明顯升高[12]。精子的運動學(xué)特征由精子運動速度、速度比和擺動來決定。然而年齡對UMI男性精子運動參數(shù)的影響研究甚少。Veron等[16]通過對5000多例不育患者研究發(fā)現(xiàn),精子的活力及VAP、VSL、VCL和BCF與患者年齡呈負(fù)相關(guān)。Fréour等[17]在年輕的具有生育力的男性中也發(fā)現(xiàn),ALH、VCL、LIN和STR的值伴隨年齡升高而顯著下降。本研究在UMI患者中發(fā)現(xiàn),其年齡與PR%、總活力以及精子運動參數(shù)VAP、VSL和VCL呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。表明UMI患者與未進(jìn)行臨床分類的不育患者相似,隨著年齡的增長,精子活力及VAP、VSL和VCL均顯示出下降的趨勢,但與正常生育力男性相比,本研究中UMI男性的VCL和ALH較高而LIN和STR較低。VAP、VSL和VCL是反映精子運動速度的重要指標(biāo),盡管UMI患者的精液分析檢測結(jié)果處于WHO第5版標(biāo)準(zhǔn)的參考范圍之內(nèi),但通過CASA的應(yīng)用,本課題發(fā)現(xiàn)年齡可能會通過影響精子VAP、VSL和VCL而導(dǎo)致UMI男性前向運動精子百分率及精子總活力的最終下降,與此同時,本研究發(fā)現(xiàn)≥35歲組的PR%、VAP和VCL均明顯低于<35歲組。這提示≥35歲的UMI患者其精子運動的平均路徑速率與曲線速率出現(xiàn)了明顯的下降,其發(fā)生機(jī)制可能與年齡增長引起附睪的氧化應(yīng)激狀態(tài)改變,包括ROS總體水平上升和附睪組織的抗氧化保護(hù)失效引起精子損傷有關(guān)[18],本課題組將在后續(xù)研究中開展氧化應(yīng)激相關(guān)的實驗中來進(jìn)一步驗證。

2.年齡對UMI患者DNA損傷的影響:既往研究顯示,隨著年齡的增長,DNA嚴(yán)重受損的精子比例也在增加[19]。Deenadayal等[20]報道>45歲的印度男性具有更高的精子DNA碎片。有學(xué)者研究顯示,>40歲的男性比<40歲的男性精子DNA損傷程度更高[21]。駱強翔等[22]對6162例不育患者的精液樣本研究發(fā)現(xiàn),精子DFI與患者年齡呈正相關(guān)。本課題組先前也證實了年齡的增長引起不育男性的精子DFI水平升高[13]。Oleszczuk等[9]在122例UMI患者中,發(fā)現(xiàn)DFI ≥ 30% 的比例為8.4%,與本文研究對象總體的DFI異常率8.5%相近,另外本研究還通過年齡分組,發(fā)現(xiàn)不同年齡組間的DFI水平及DFI異常率均存在明顯差異,≥35歲組的DFI異常率高達(dá)14.52%,其精子DNA損傷風(fēng)險是<35歲組的2倍多。這進(jìn)一步反映了年齡可能對UMI男性精子DNA損傷存在影響。Agarwal等[23]提出男性年齡的增長是引起精子DNA碎片水平升高的高風(fēng)險因子,而氧化應(yīng)激水平的升高被認(rèn)為是其主要機(jī)制。精子DNA損傷與年齡增長以及不良的生育結(jié)局密切相關(guān)[24]。因此在臨床診療工作中,UMI患者的年齡及其精子DNA損傷程度應(yīng)該引起高度重視。

綜上所述,本研究初步闡明了年齡的增長可能影響UMI患者精子運動參數(shù)下降以及精子DNA損傷水平的上升。精子細(xì)胞VAP、VCL和VSL的下降與較高的精子DNA損傷有關(guān),從而降低生育潛力。本文推測精子DNA損傷水平的升高可能是高齡UMI男性的不育原因之一,為臨床UMI的診治提供一個新的視角。由于本研究未能獲得研究對象的日常飲食生活習(xí)慣、職業(yè)及居住環(huán)境等相關(guān)資料,故無法完全排除混雜因素對研究結(jié)果的影響,這仍需要本課題組后續(xù)實驗深入研究。