霞多麗葡萄果實(shí)降異戊二烯香氣物質(zhì)積累及代謝酶活變化分析

張 禎,崔媛媛,陳春霞,馮麗丹,趙 勇,李霽昕,把靈珍,孔祥錦,張 煜,蔣玉梅,*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅省葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)中心,甘肅 蘭州 730070; 2.甘肅莫高實(shí)業(yè)發(fā)展股份有限公司生態(tài)農(nóng)業(yè)示范種植園區(qū),甘肅 武威 733006)

香氣是衡量葡萄和葡萄酒品質(zhì)的重要指標(biāo),葡萄酒的品種香主要來自葡萄果實(shí),葡萄果實(shí)香氣在葡萄的生理生化代謝過程中生成積累,受葡萄品種、生長(zhǎng)環(huán)境、氣候、栽培管理模式和成熟度等因素的影響[1]。目前葡萄果實(shí)中已確定的香氣物質(zhì)有600多種,包括醛、醇、酯、酮、萜類和吡嗪等多類物質(zhì)[2-3]。其中降異戊二烯香氣物質(zhì)閾值較低,通常具有蘋果、覆盆子、木瓜、紫羅蘭等花果香氣特征,是霞多麗葡萄特征香氣的重要組成,主要由類胡蘿卜素在類胡蘿卜素裂解雙加氧酶(carotenoid cleavage dioxygenase,CCD)的酶促或非酶作用下降解代謝生成[4],包括C9、C10、C11和C13降異戊二烯香氣物質(zhì),以游離態(tài)和糖苷結(jié)合態(tài)2種形式存在[5]。

CCD是類胡蘿卜素酶促降解代謝生成降異戊二烯香氣物質(zhì)的關(guān)鍵酶[6]。研究發(fā)現(xiàn)葡萄品種[7]、栽培措施[1]、生長(zhǎng)環(huán)境[8]和成熟度[9]等因素均會(huì)影響降異戊二烯香氣物質(zhì)的積累。玫瑰香和黑比諾葡萄發(fā)育過程中降異戊二烯香氣物質(zhì)總量整體呈先升后降趨勢(shì),結(jié)合態(tài)含量高于游離態(tài)[9-10]。目前葡萄果實(shí)中發(fā)現(xiàn)的CCD基因家族成員有VvCCD1、VvCCD4a、VvCCD4b、VvCCD7和VvCCD8,其中VvCCD1、VvCCD4a和VvCCD4b能夠催化環(huán)狀和鏈狀類胡蘿卜素,生成降異戊二烯香氣物質(zhì)[11-12]。藤稔葡萄生長(zhǎng)發(fā)育過程中總類胡蘿卜素含量與VvCCD基因轉(zhuǎn)錄水平有一定的相關(guān)性[13]。基于降異戊二烯香氣物質(zhì)在葡萄和葡萄酒香氣構(gòu)成中的重要性,近二十年來,眾多學(xué)者開始關(guān)注研究葡萄中降異戊二烯物質(zhì)的構(gòu)成、代謝和影響因素[14]。但是關(guān)于霞多麗葡萄果實(shí)生長(zhǎng)期降異戊二烯香氣物質(zhì)積累及代謝酶活變化分析研究目前鮮見報(bào)道。

試驗(yàn)在2020和2021年兩個(gè)連續(xù)生產(chǎn)季,以霞多麗葡萄為試材,于果實(shí)幼果(花后10 d)至成熟(花后80 d)期間每2周采集樣品,測(cè)定樣品理化指標(biāo)、總類胡蘿卜素含量、降異戊二烯香氣物質(zhì)含量和CCD活性,分析類胡蘿卜素含量、降異戊二烯香氣物質(zhì)含量和CCD活性三者間的相關(guān)性,探討降異戊二烯香氣代謝前體和酶活性對(duì)其生成的影響,確定霞多麗葡萄果實(shí)生長(zhǎng)期間降異戊二烯香氣物質(zhì)的積累規(guī)律。以期為霞多麗葡萄降異戊二烯香氣代謝機(jī)理研究和香氣品質(zhì)調(diào)控提供科學(xué)數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

霞多麗(Chardonnay)葡萄:2010年定植,砧木5BB,單干單臂架形,南北行向,株行距0.6 m×2 m,每行20株,規(guī)范化管理,種植于甘肅省蘭州市安寧區(qū)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心葡萄品種園(103°41′E,36°5′N;海拔1 530 m)。蘭州市2020年年均溫為11.2 ℃,年降水量為367 mm;2021年年均溫為14.1 ℃,年降水量為341 mm。氣象數(shù)據(jù)從中國(guó)氣象數(shù)據(jù)共享服務(wù)系統(tǒng)(http://cdc.cma.gov.cn/home)查詢獲得。

標(biāo)準(zhǔn)品:6-甲基-5-庚烯-2-酮、α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、β-環(huán)檸檬醛、β-大馬士酮、香葉基丙酮和2-辛醇等標(biāo)品購(gòu)于美國(guó)Sigma Aldrich公司;類胡蘿卜素裂解雙加氧酶(CCD)ELISA試劑盒購(gòu)于江蘇科晶生物科技有限公司;糖苷酶AR2000購(gòu)于Creative Enzymes公司;固相萃取柱(Cleanert PEP-SPE,150 mg/6 mL)購(gòu)于天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo Scientific 265079氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS),美國(guó)Thermo Scientific公司;色譜柱,DB-WAX(60 m×2.5 mm×0.25 μm),美國(guó)Thermo Scientific公司;固相微萃取頭(SPME)Fiber,DVB/CAR/PDMS(50/30 μm),美國(guó)Surpelco公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

2020和2021年6—8月,選擇樹勢(shì)、負(fù)載量基本一致的3行葡萄植株,花后10 d(幼果)至花后80 d(成熟),每隔2周,上午8:00—10:00采樣,逢雨天隔天采。采樣排除邊緣葡萄藤,兼顧陰陽(yáng)面和葡萄葉幕內(nèi),隨機(jī)摘取3～10穗葡萄,去除果梗,混勻,取100粒進(jìn)行理化指標(biāo)測(cè)定,其余漿果根據(jù)檢測(cè)要求處理液氮速凍,-80 ℃貯藏待測(cè)。

1.3.2 理化品質(zhì)分析

參照王福榮[15]的方法測(cè)定葡萄百粒重、可溶性固形物含量、可滴定酸含量(以酒石酸計(jì))和pH值。

1.3.3 總類胡蘿卜素含量測(cè)定

參照Leng等[13]的方法,準(zhǔn)確稱取0.500 0 g葡萄果皮樣品,加10 mL 95%乙醇勻漿,10 000 r·min-1(4 ℃)離心15 min。取0.5 mL上清液加4.5 mL 95%乙醇。分光光度計(jì)測(cè)定664 nm、649 nm和470 nm處吸光值,計(jì)算總類胡蘿卜素含量。

1.3.4 CCD活性測(cè)定

葡萄果實(shí)加液氮研磨成粉,稱取0.200 0 g粉末,置于1.5 mL離心管,加入pH 值7.4 磷酸鹽緩沖液(1 g∶4 mL),搖勻,4 000 r·min-1(4 ℃)離心15 min,取上清液,ELISA試劑盒測(cè)定活性。

1.3.5 香氣物質(zhì)提取

游離態(tài)香氣。樣品50 g解凍、去籽、去果蒂,制備葡萄醪。

結(jié)合態(tài)香氣。參照劉斌[3]的方法并修改。50 g葡萄果實(shí),去籽,去果蒂,液氮速凍后,加入1 g PVPP和0.5 gD-葡萄糖酸內(nèi)酯于組織搗碎機(jī)打粉,置于50 mL離心管4 ℃冰箱靜置2 h,8 000 r·min-1(4 ℃)離心10 min。取2 mL澄清葡萄汁過活化后的固相萃取柱,依次用2 mL水和5 mL二氯甲烷洗脫去除低分子量的糖、酸和游離態(tài)香氣等化合物,20 mL甲醇洗脫結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)收集至50 mL圓底燒瓶,30 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。加10 mL檸檬酸/磷酸緩沖液(0.2 mol·L-1,pH值5)溶解,轉(zhuǎn)移至含有0.1 g糖苷酶AR2000的密閉離心管,37 ℃恒溫酶解16 h,制得結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)樣品。

1.3.6 香氣物質(zhì)分析

參照王雨等[16]的方法并修改,準(zhǔn)確稱取5.00 g樣品于20 mL樣品瓶中,加入1.00 g NaCl,10 μL內(nèi)標(biāo)(2-辛醇,0.5 mg·kg-1)及磁力轉(zhuǎn)子,40 ℃水浴磁力攪拌平衡30 min,插入活化后的SPME萃取頭40 ℃頂空萃取30 min,氣相色譜進(jìn)樣口230 ℃解析10 min進(jìn)樣。

色譜條件:進(jìn)樣口溫度230 ℃;不分流進(jìn)樣;載氣(高純He),流速1 mL·min-1;升溫程序:50 ℃(10 min),3 ℃·min-1升至180 ℃(6 min)。

質(zhì)譜條件:電子轟擊離子源(EI);電子能量70 eV;連接桿溫度180 ℃;離子源溫度250 ℃;質(zhì)譜掃描范圍m/z50～350。

1.3.7 定性與定量分析

定性:外標(biāo)法結(jié)合NIST譜庫(kù)檢索和相對(duì)保留指數(shù)(RI)定性;

定量:外標(biāo)定量。標(biāo)準(zhǔn)品樣品制備加入內(nèi)標(biāo)2-辛醇,消除基質(zhì)影響。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程見表1。

表1 降異戊二烯香氣物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Table 1 Standard curve equation of norisoprenoids

1.4 數(shù)據(jù)處理

Microsoft Excel 2016統(tǒng)計(jì),SPSS Statistics 25.0顯著性分析(Duncan法,P<0.05),Origin 2018繪圖,Metabo Analyst 5.0進(jìn)行正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)和相關(guān)性分析(Pearson法),所有處理均做3個(gè)生物樣本重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄果實(shí)生長(zhǎng)期理化指標(biāo)的變化

葡萄的成熟度可通過可滴定酸含量、pH值、可溶性固形物含量等指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估[17],霞多麗葡萄在花后38～52 d可滴定酸含量開始下降、可溶性固形物含量開始上升、百粒重緩慢增長(zhǎng)(圖1-A、C、D),符合葡萄轉(zhuǎn)色期糖酸積累和果實(shí)生長(zhǎng)規(guī)律[17],該時(shí)期為轉(zhuǎn)色期,進(jìn)而確定花后10～38 d試驗(yàn)果實(shí)處于幼果期,花后52～80 d試驗(yàn)果實(shí)處于成熟期。

隨著葡萄成熟,樣品果實(shí)可滴定酸含量呈先升后降趨勢(shì)(圖1-A),花后38 d達(dá)到峰值,2020和2021年分別為30.41 g·L-1和27.27 g·L-1,花后52 d樣品果實(shí)進(jìn)入成熟期可滴定酸急劇下降,成熟果實(shí)樣品(花后80 d)可滴定酸下降至4.91 g·L-1(2020年)和4.98 g·L-1(2021年)。樣品pH值呈先降后升趨勢(shì)(圖1-B),花后38 d達(dá)到最低值(2020年2.49;2021年2.60),花后52 d后成熟期急劇增加,成熟果實(shí)(花后80 d)上升至3.63(2020年)和3.64(2021年),變化趨勢(shì)與可滴定酸含量變化相符。

可溶性固形物含量(圖1-C)和百粒重(圖1-D)在果實(shí)生長(zhǎng)期間均呈上升趨勢(shì)?？扇苄怨绦挝锖吭诔墒炱?花后52～80 d)急劇增加,成熟果實(shí)(花后80 d)兩個(gè)生產(chǎn)季的可溶性固形物含量分別為20.32oBrix(2020年)和22.30oBrix(2021年);百粒重在轉(zhuǎn)色期(花后38～52 d)增加緩慢,花后10～24 d、52～80 d果實(shí)先后兩次膨大,百粒重顯著增加,2020年分別增加了82.47%、85.50%,2021年分別增加了174.00%、57.01%,成熟果實(shí)(花后80 d)兩個(gè)生產(chǎn)季的百粒重分別為111.19 g(2020年)和81.66 g(2021年)。霞多麗葡萄果實(shí)在幼果期和成熟期均膨大,幼果期果肉細(xì)胞快速分裂,體積快速膨大,果實(shí)硬度大,以積累有機(jī)酸為主,果肉細(xì)胞開始積累淀粉,該時(shí)期結(jié)束時(shí)有機(jī)酸含量達(dá)到最大,pH值最小;成熟期果實(shí)體積再次迅速增大,果實(shí)逐漸變軟,酸度下降,果實(shí)細(xì)胞液泡開始積累糖分,葡萄糖和果糖含量迅速增加,二者比例接近1[18],試驗(yàn)果實(shí)的可溶性固形物含量、可滴定酸含量、百粒重和pH值變化與李秀杰等[18]報(bào)道的葡萄基本理化指標(biāo)變化規(guī)律相符。

A,可滴定酸含量;B,pH值;C,可溶性固形物含量;D,百粒重。不同小寫字母表示2020年不同時(shí)期之間差異顯著(P<0.05);不同大寫字母表示2021年不同時(shí)期之間差異顯著(P<0.05),下同。A, Titratable acid content; B, pH; C, Soluble solids content; D, 100-grain weight. Different lowercase letters indicate significant differences between different periods in 2020 (P<0.05); different capital letters indicate significant differences between different periods in 2021 (P<0.05). The same as below.圖1 霞多麗葡萄果實(shí)發(fā)育過程中理化指標(biāo)變化Fig.1 Changes of physical and chemical indexes during development of Chardonnay grape berries

2020和2021年兩個(gè)連續(xù)生產(chǎn)季霞多麗葡萄可滴定酸含量、pH值、可溶性固形物含量和百粒重的變化趨勢(shì)一致,但含量存在差異。成熟果實(shí)(花后80 d)2021年百粒重較2020年降低了26.56%,可能與生產(chǎn)地2021年較2020年降水量少有關(guān),張曉霞[19]研究發(fā)現(xiàn),在葡萄膨大期進(jìn)行調(diào)虧灌溉會(huì)導(dǎo)致果實(shí)粒徑減小,百粒重降低;2020年可溶性固形物含量較2021年降低了8.88%,可能是由于2020年漿果體積較大而產(chǎn)生的稀釋作用[20];可滴定酸含量、pH值差異不大,表明生產(chǎn)季氣候條件對(duì)其積累的影響不大。

2.2 葡萄果實(shí)總類胡蘿卜素含量的變化

總類胡蘿卜素含量整體呈下降趨勢(shì),但轉(zhuǎn)色期前后會(huì)有一個(gè)生成積累小高峰(圖2)。幼果期果實(shí)膨大過程(花后10～24 d)總類胡蘿卜素含量快速下降(2020年30.50%,2021年47.04%),這可能是稀釋效應(yīng)[19]所致;隨后總類胡蘿卜素含量增加(2020年花后24～38 d;2021年花后24～52 d),2020年峰值(71.96 μg·g-1)出現(xiàn)在轉(zhuǎn)色期前(花后38 d),2021年峰值(46.68 μg·g-1)出現(xiàn)在轉(zhuǎn)色期后(花后52 d)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[21],類胡蘿卜素異構(gòu)酶基因(VvOR)在葡萄果實(shí)轉(zhuǎn)色期有最低或最高的表達(dá)量,VvOR基因影響了類胡蘿卜素合成,使果實(shí)總類胡蘿卜素含量在轉(zhuǎn)色前期或后期出現(xiàn)峰值,試驗(yàn)結(jié)果符合此規(guī)律。成熟期樣品果實(shí)總類胡蘿卜素含量呈下降趨勢(shì),至果實(shí)成熟總類胡蘿卜素含量2020和2021年分別較峰值下降了48.22%和57.01%。可能是由于果實(shí)成熟期八氫番茄紅素合成酶基因(VvPSY1)表達(dá)量降低,VvCCD1和9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶基因(VvNCED2)表達(dá)量增高[13],類胡蘿卜素合成速率降低,降解加快所致。

圖2 霞多麗葡萄果實(shí)發(fā)育過程中總類胡蘿卜素含量的變化Fig.2 Changes of total carotenoid content during development of Chardonnay grape berries

2020年葡萄生長(zhǎng)過程中總類胡蘿卜素含量始終高于2021年,說明生產(chǎn)季氣候?qū)︻惡}卜素積累影響較大。葡萄類胡蘿卜素穩(wěn)態(tài)水平取決于生物合成和降解之間的平衡[22],類胡蘿卜素生物合成和降解代謝速率與代謝酶活性大小相關(guān),而酶活性又受年份因素(光照、溫度等)影響。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),強(qiáng)光照能夠提高PSY、CCD等基因的表達(dá)量,從而影響果實(shí)中類胡蘿卜素的合成或降解[7,23]。通過中國(guó)國(guó)家氣象數(shù)據(jù)分享系統(tǒng)(http://cdc.cma.gov.cn)檢索蘭州兩個(gè)生產(chǎn)季氣溫和光照發(fā)現(xiàn),2021年生產(chǎn)季較2020年的溫度高、光照強(qiáng),這可能影響了果實(shí)的CCD活性,后續(xù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),2021年樣品CCD活性顯著高于2020年樣品,2021年樣品總類胡蘿卜素含量較2020年低,可能是樣品CCD活性較高,總類胡蘿卜素降解量增加的結(jié)果。

2.3 葡萄果實(shí)CCD活性的變化分析

由圖3可知,幼果膨大期試驗(yàn)果實(shí)CCD活性顯著下降(2020年13.46%,2021年11.01%),植物中CCD定位于胞質(zhì)或質(zhì)體[7],幼果膨大期果實(shí)細(xì)胞處于快速分裂階段,質(zhì)體數(shù)目維持在低水平[24],CCD整體活性降低;幼果后期試驗(yàn)果實(shí)CCD活性上升。轉(zhuǎn)色期樣品CCD活性再次下降。果實(shí)進(jìn)入成熟期,樣品CCD活性開始上升,花后66 d開始快速升高,果實(shí)成熟時(shí)(花后80 d)上升至2020年430.99 U·g-1,2021年872.13 U·g-1。Leng等[13]發(fā)現(xiàn),VvCCD1和VvCCD4a均在果實(shí)成熟期表達(dá)量增加,其中VvCCD1在成熟期達(dá)到最大值,與本研究結(jié)果一致。

A,2020年CCD活性;B,2021年CCD活性。A, CCD activity in 2020; B, CCD activity in 2021.圖3 霞多麗葡萄果實(shí)發(fā)育過程中CCD活性的變化Fig.3 Changes of CCD activity during development of Chardonnay grape berries

兩年CCD活性變化趨勢(shì)基本一致,但2021年活性明顯高于2020年,可能是由于蘭州2021年的氣溫和光照強(qiáng)度較2020年高,降雨量少(http://cdc.cma.gov.cn)導(dǎo)致。Wang等[25]研究發(fā)現(xiàn),脫水脅迫可提高CCD1基因表達(dá)量;降雨量少,果實(shí)水分虧缺可提高CCD轉(zhuǎn)錄豐度[26]。

2.4 降異戊二烯香氣物質(zhì)總量的變化分析

霞多麗果實(shí)樣品中定性定量6種游離態(tài)和結(jié)合態(tài)降異戊二烯香氣物質(zhì),其中6-甲基-5-庚烯-2-酮是C8降異戊二烯香氣物質(zhì),β-環(huán)檸檬醛是C10降異戊二烯香氣物質(zhì),α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、β-大馬士酮和香葉基丙酮是C13降異戊二烯香氣物質(zhì)。兩個(gè)生產(chǎn)季所檢測(cè)出的游離態(tài)和結(jié)合態(tài)組分種類相同,但含量不同,表明生產(chǎn)季氣候條件差異不會(huì)改變降異戊二烯香氣物質(zhì)的種類,但會(huì)影響降異戊二烯物質(zhì)的含量。

樣品果實(shí)降異戊二烯香氣物質(zhì)總量在幼果期和轉(zhuǎn)色期兩年變化趨勢(shì)有差異(圖4),但成熟期變化趨勢(shì)一致(先降后升),果實(shí)成熟時(shí)(花后80 d)總量達(dá)到16.05 μg·kg-1(2020年)和39.04 μg·kg-1(2021年)。試驗(yàn)成熟期CCD活性也呈先降后升趨勢(shì),說明成熟期降異戊二烯香氣物質(zhì)總量變化與CCD活性有一定的相關(guān)性,與Meng等[27]研究結(jié)果一致。

A,2020年降異戊二烯香氣物質(zhì)含量;B,2021年降異戊二烯香氣物質(zhì)含量。A, The content of norisoprenoids in 2020; B, The content of norisoprenoids in 2021.圖4 霞多麗葡萄果實(shí)發(fā)育過程中降異戊二烯香氣物質(zhì)含量的變化Fig.4 Changes of norisoprenoids during development of Chardonnay grape berries

兩個(gè)生產(chǎn)季結(jié)合態(tài)降異戊二烯香氣物質(zhì)含量變化趨勢(shì)在果實(shí)幼果期相反,轉(zhuǎn)色期和成熟期一致,但都在花后52 d轉(zhuǎn)色期結(jié)束時(shí)達(dá)到峰值(2020年,12.73 μg·kg-1;2021年,30.13 μg·kg-1)。2021年結(jié)合態(tài)降異戊二烯香氣物質(zhì)含量高于2020年,2021年生產(chǎn)季光照較2020年高,Bureau等[28]研究發(fā)現(xiàn),光照能刺激果實(shí)類胡蘿卜素分解,促進(jìn)結(jié)合態(tài)降異戊二烯香氣物質(zhì)合成,這可能是導(dǎo)致兩個(gè)生產(chǎn)季結(jié)合態(tài)降異戊二烯物質(zhì)含量差異的原因。

幼果期游離態(tài)降異戊二烯香氣物質(zhì)含量在兩個(gè)生產(chǎn)季均呈上升趨勢(shì);轉(zhuǎn)色期2020年下降迅速,2021年下降幅度小;成熟期2020年先降后升,成熟果實(shí)含量為5.38 μg·kg-1,2021年持續(xù)上升至11.04 μg·kg-1。就含量而言,2021年轉(zhuǎn)色期和成熟期游離態(tài)降異戊二烯香氣物質(zhì)含量比2020年高,可能是由于香氣物質(zhì)主要分布于果皮[29],2021年該時(shí)期氣溫較高、降雨量少,百粒重小于2020年樣品,果皮果肉比增大,這可能是2021年樣品降異戊二烯香氣物質(zhì)含量較高的原因之一。

2.5 降異戊二烯香氣物質(zhì)組分的變化分析

為了直觀反映不同生產(chǎn)季和不同成熟度對(duì)葡萄果實(shí)降異戊二烯香氣組分的影響,以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)降異戊二烯香氣組分含量為變量,進(jìn)行了正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)(圖5)。由圖5-A可知,兩個(gè)主成分可以反映總體66.6%的原始變量信息,其中RX2、RY2、Q2分別為0.905、0.574和0.462,由圖5-C可知,兩個(gè)主成分可以反映總體77.5%的原始變量信息,其中RX2、RY2、Q2分別為0.855、0.982和0.975,說明這兩個(gè)模型可以反映游離態(tài)和結(jié)合態(tài)降異戊二烯香氣組分的總體情況,且模型穩(wěn)定。圖5-A、C可以將不同生產(chǎn)季樣品清楚地分開,表明不同生產(chǎn)季果實(shí)中降異戊二烯香氣組分含量有較大差別,尤其是結(jié)合態(tài)香氣組分(圖5-C),2020年樣品分布于X軸的負(fù)半軸,2021年樣品分布于正半軸,雖然樣品點(diǎn)分布隨果實(shí)成熟未呈現(xiàn)規(guī)律性分布,但大部分樣品點(diǎn)可以較好地分離。從圖5-B、D樣品得分圖可以看出,生產(chǎn)季氣候?qū)τ坞x態(tài)和結(jié)合態(tài)降異戊二烯香氣組分(得分>1.0)的影響有所不同,生產(chǎn)季氣候?qū)τ坞x態(tài)β-紫羅蘭酮和結(jié)合態(tài)β-大馬士酮的積累影響最大。

對(duì)2個(gè)生長(zhǎng)季游離態(tài)β-紫羅蘭酮和結(jié)合態(tài)β-大馬士酮的積累動(dòng)態(tài)進(jìn)一步進(jìn)行分析,結(jié)果見圖5-E、F。2個(gè)生產(chǎn)季游離態(tài)β-紫羅蘭酮在幼果期含量呈下降趨勢(shì),轉(zhuǎn)色期(花后38～52 d)含量上升,2020年花后52 d較38 d含量上升了86.67%,2021年花后52 d含量是花后38 d的6.08倍。成熟期2個(gè)生產(chǎn)季的游離態(tài)β-紫羅蘭酮含量變化不一致。2020年游離態(tài)β-紫羅蘭酮含量持續(xù)顯著下降至0.08 μg·kg-1;2021年游離態(tài)β-紫羅蘭酮含量在花后52～66 d顯著上升并達(dá)到最大值(2.80 μg·kg-1),隨后含量顯著下降至1.50 μg·kg-1。2021年轉(zhuǎn)色期和成熟期β-紫羅蘭酮含量高于2020年,可能與2021年氣溫較2020年高,降雨量少,果實(shí)體積脫水縮小,香氣濃度上升[29]有關(guān)。β-大馬士酮是C13-降異戊二烯香氣物質(zhì)中貢獻(xiàn)最大的組分[30],在果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過程中,2020年結(jié)合態(tài)β-大馬士酮含量無顯著變化(P>0.05);2021年β-大馬士酮幼果期含量顯著上升,轉(zhuǎn)色期緩慢下降,成熟期含量上升并達(dá)到最大值(2.03 μg·kg-1),成熟后期又開始顯著下降(P<0.05)。β-大馬士酮的積累受溫度、日照時(shí)長(zhǎng)等因素的強(qiáng)烈影響[31],較高氣溫有利于β-大馬士酮的生成[32],2021年蘭州氣溫高于2020年,因此導(dǎo)致2021年幼果期至成熟期的β-大馬士酮含量遠(yuǎn)高于2020年。

A、B,游離態(tài)降異戊二烯香氣組分OPLS-DA分析;C、D,結(jié)合態(tài)降異戊二烯香氣組分OPLS-DA分析;E,果實(shí)發(fā)育過程中游離態(tài)β-紫羅蘭酮含量變化;F,果實(shí)發(fā)育過程中游離態(tài)結(jié)合態(tài)β-大馬士酮含量變化。A and B, OPLS-DA analysis of free norisoprenoid components; C and D, OPLS-DA analysis of bound norisoprenoid components; E, The changes of free β-ionone content during fruit development; F, The changes of bound β-damascone content during fruit development.圖5 霞多麗葡萄果實(shí)發(fā)育過程中降異戊二烯香氣組分OPLS-DA和主要組分的分析Fig.5 Analysis of OPLS-DA and main components of norisoprenoids during development of Chardonnay grape berries

2.6 葡萄果實(shí)CCD活性、總類胡蘿卜素含量與降異戊二烯香氣組分含量相關(guān)性分析

CCD催化下,霞多麗果實(shí)中定性定量的6-甲基-5-庚烯-2酮主要來自類胡蘿卜素中的番茄紅素,α-紫羅蘭酮主要來自ε-胡蘿卜素,β-紫羅蘭酮和β-環(huán)檸檬醛主要來自β-胡蘿卜素生成,香葉基丙酮主要來自ξ-胡蘿卜素[12,33]。

CCD活性、總類胡蘿卜素含量與降異戊二烯香氣組分含量相關(guān)性分析顯示(圖6),總類胡蘿卜素含量與CCD活性呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),與Leng等[13]在藤稔葡萄中的研究結(jié)果一致。游離態(tài)和結(jié)合態(tài)α-紫羅蘭酮含量與CCD活性均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),與總類胡蘿卜素含量分別呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)和顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),與總類胡蘿卜素含量相比,結(jié)合態(tài)α-紫羅蘭酮含量與CCD活性相關(guān)性更強(qiáng),說明結(jié)合態(tài)α-紫羅蘭酮生成受CCD活性影響更大。游離態(tài)和結(jié)合態(tài)β-紫羅蘭酮含量均與CCD活性呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),與總類胡蘿卜素含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),說明總類胡蘿卜素含量和CCD活性對(duì)β-紫羅蘭酮的生成具有同等影響。游離態(tài)和結(jié)合態(tài)β-大馬士酮含量與CCD活性分別呈顯著正相關(guān)(P<0.05)和極顯著正相關(guān)(P<0.01),與總類胡蘿卜素含量均呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。可見,游離態(tài)β-大馬士酮生成受總類胡蘿卜素含量影響更大。游離態(tài)香葉基丙酮含量與CCD活性呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),與總類胡蘿卜素含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),說明CCD活性和總類胡蘿卜素含量均會(huì)影響游離態(tài)香葉基丙酮的生成。結(jié)合態(tài)6-甲基-5-庚烯-2-酮含量與CCD活性呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),與總類胡蘿卜素含量相關(guān)性不顯著(P>0.05),說明CCD活性是影響結(jié)合態(tài)6-甲基-5-庚烯-2-酮生成的主要因素,總類胡蘿卜素含量對(duì)其沒有影響。

*,顯著相關(guān)(P<0.05);**,極顯著相關(guān)(P<0.01); F,游離態(tài);B,結(jié)合態(tài)。*, Significant correlation (P<0.05); **, Very significant correlation (P<0.01); F, Free state; B, Bound state.圖6 CCD活性、總類胡蘿卜素含量與降異戊二烯香氣組分含量相關(guān)性分析Fig.6 Analysis of correlation between CCD activity, total carotenoid content and norisoprenoids content

3 結(jié)論

2020—2021年連續(xù)兩年,通過對(duì)不同生長(zhǎng)期霞多麗葡萄果實(shí)的基礎(chǔ)理化指標(biāo)、總類胡蘿卜素含量、CCD活性和降異戊二烯香氣物質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定分析,結(jié)果表明,在霞多麗葡萄果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過程中,可滴定酸含量在轉(zhuǎn)色期達(dá)到峰值后開始下降,pH值、可溶性固形物含量和百粒重均呈上升趨勢(shì);總類胡蘿卜素含量總體呈下降趨勢(shì),轉(zhuǎn)色期前后會(huì)有一個(gè)生成積累小高峰。CCD活性幼果期呈上升趨勢(shì),轉(zhuǎn)色期下降,成熟期呈再次上升;果實(shí)樣品共定性定量6種降異戊二烯香氣物質(zhì),隨著果實(shí)成熟,降異戊二烯香氣物質(zhì)總含量呈上升趨勢(shì);相關(guān)性分析顯示,CCD活性與總類胡蘿卜素含量呈負(fù)相關(guān),游離態(tài)和結(jié)合態(tài)α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、β-大馬士酮以及游離態(tài)香葉基丙酮、結(jié)合態(tài)6-甲基-5-庚烯-2-酮與CCD活性呈正相關(guān),與總類胡蘿卜素含量呈負(fù)相關(guān)。不同生產(chǎn)季樣品比較發(fā)現(xiàn),生產(chǎn)季氣候?qū)麑?shí)理化指標(biāo)、總類胡蘿卜素含量、CCD活性和降異戊二烯香氣物質(zhì)含量均有影響。