不同海拔黃果柑果實(shí)有機(jī)酸代謝的生態(tài)響應(yīng)

吳 嬌,龔成宇,陳超群,陳紅旭,劉俊宏,唐文靜,初元琦,楊文龍,張 瑤,龔榮高

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,四川 成都 611130)

黃果柑(Citruscultivarcv. Huangguogan)屬蕓香科(Rutaceae)柑橘屬(Citrus),具無(wú)核、優(yōu)質(zhì)、晚熟等特點(diǎn),是我國(guó)大渡河流域中段干暖河谷區(qū)特有的天然雜交柑資源[1]。漢源地區(qū),黃果柑適宜栽培的海拔范圍為800～1 200 m,不同海拔因溫度、濕度和光照等生態(tài)因子的差異大幅度地影響著果實(shí)的品質(zhì)及生長(zhǎng)代謝[2]。柑橘果實(shí)中含豐富內(nèi)含物,糖分、有機(jī)酸含量及二者比值是決定果實(shí)風(fēng)味的重要指標(biāo)[3]。果實(shí)內(nèi)有機(jī)酸含量比糖含量的變化幅度大,因此有機(jī)酸對(duì)決定糖酸比大小而言更為重要[4]。已有柑橘有機(jī)酸代謝方面研究表明,檸檬酸合成酶(CS)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、蘋果酸脫氫酶(MDH)、順-烏頭酸酶(ACO)和異檸檬酸脫氫酶(NADP-IDH)是檸檬酸代謝的關(guān)鍵酶[5],上述酶通過三羧酸循環(huán)共同參與檸檬酸代謝;在不同砧木與黃果柑果實(shí)有機(jī)酸含量的影響研究中,NADP-IDH被認(rèn)為是關(guān)鍵限制因子[6]。目前黃果柑產(chǎn)地因海拔不同造成果實(shí)品質(zhì)差異明顯,一定程度上制約了黃果柑產(chǎn)業(yè)的均衡發(fā)展。本試驗(yàn)主要通過測(cè)定不同海拔間黃果柑果實(shí)中有機(jī)酸含量、檸檬酸代謝相關(guān)酶活性及基因表達(dá)量之間的關(guān)聯(lián)性,掌握海拔對(duì)黃果柑有機(jī)酸代謝的影響,為因地制宜栽培黃果柑,提高果實(shí)品質(zhì),提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)地位于四川省雅安市漢源縣小堡藏族彝族鄉(xiāng)(102°33′E,29°18′N),地處大渡河中游南岸,山地地形,海拔840～1 200 m,年均氣溫16.5 ℃,無(wú)霜期300 d左右,日照時(shí)數(shù)達(dá)1 475.8 h,年活動(dòng)積溫>5 500 ℃,年均降水量650 mm,土壤類型為紅壤土。

1.2 試驗(yàn)材料

本次試驗(yàn)在同一山體海拔高度分別為875 m、1 014 m和1 174 m處選取3個(gè)黃果柑種植樣點(diǎn)作為本試驗(yàn)的3個(gè)處理(3個(gè)點(diǎn)的環(huán)境情況如表1所示),各海拔3個(gè)小區(qū),每小區(qū)3株,共27株7年生黃果柑,砧木枳殼,株行距2.5 m × 4 m,所有黃果柑的栽植均為東西行向,樹勢(shì)、樹距、管理方式等一致。試驗(yàn)材料從2018年4月開始統(tǒng)一管理,觀察記錄各樣點(diǎn)開花時(shí)期,于花后75 d開始,每隔15 d進(jìn)行一次樣品采集(每株樹樹冠外圍中上部的東、南、西、北四個(gè)方向各3個(gè)),直至果實(shí)成熟,將采集的果實(shí)液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 不同海拔高度黃果柑園區(qū)的主要?dú)夂蛞蜃硬町怲able 1 The difference of main climatic factors in Huangguogan gardens at different altitudes

1.3 黃果柑果實(shí)有機(jī)酸組分含量測(cè)定方法

參照肖玉明[7]的高效液相色譜(HPLC)法,檢測(cè)條件略作修改。流動(dòng)相[甲醇∶磷酸二氫鉀(0.06 mol·L-1,pH值2.5)=4∶96(V/V)],上機(jī)前抽濾(有機(jī)相,0.22 μm)超聲(25 ℃、20 min);進(jìn)樣量為10 μL。

1.4 黃果柑果實(shí)檸檬酸代謝相關(guān)酶活性測(cè)定方法

檸檬酸代謝相關(guān)酶液制備和酶活性測(cè)定參照龔榮高[8]的方法。

1.5 總RNA提取及cDNA合成

果實(shí)RNA提取按照TreliefTMRNAprep Pure Plant Plus Kit (Polysaccharides &Polyphenolics-rich) RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒進(jìn)行。提取的RNA用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)分別進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)和濃度分析,然后再按照GoldenstarM RT6 cDNA Synthesis Kit Ver. 2反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,合成試驗(yàn)所需cDNA。

1.6 果實(shí)有機(jī)酸代謝相關(guān)酶基因qPCR分析

參考曹淑燕[9]的黃果柑相關(guān)基因序列片段,運(yùn)用Primer 6.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),設(shè)計(jì)序列見表2,使用2×TsingKEMaster qPCR Mix (SYBR Green I)熒光定量試劑盒進(jìn)行qPCR驗(yàn)證。

表2 黃果柑果實(shí)有機(jī)酸代謝相關(guān)酶基因qPCR序列Table 2 qPCR sequence of organic acid metabolism-related enzymes in Huangguogan fruit

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過Microsoft Excel和SPSS 20.0軟件整理并分析,采用Origin85軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 海拔對(duì)黃果柑果實(shí)發(fā)育過程中酸含量的影響

由圖1知,各海拔黃果柑果實(shí)蘋果酸和奎寧酸含量花后75～330 d呈下降趨勢(shì),在果實(shí)發(fā)育后期趨于平穩(wěn),且含量占比較低;檸檬酸含量與有機(jī)酸含量變化趨勢(shì)一致,在果實(shí)發(fā)育前期增加中后期降低,含量占比高達(dá)48.48%～96.85%,說明黃果柑果實(shí)有機(jī)酸的積累以檸檬酸為主。在果實(shí)發(fā)育前期(檸檬酸大量合成時(shí)期),隨著海拔升高,檸檬酸含量越高,而成熟期檸檬酸含量與海拔高度呈反比,說明檸檬酸含量在后期降解是影響果實(shí)有機(jī)酸含量的主要原因,海拔越高,檸檬酸降解程度越大。

2.2 海拔對(duì)檸檬酸合成酶類活性的影響

由圖2知,CS活性自花后135 d活性差異較小。與之類似,不同海拔間MDH的活性差異不大。說明CS、MDH活性與檸檬酸含量及海拔的關(guān)聯(lián)性不大,不同海拔間果實(shí)檸檬酸含量最終差異并非由CS和MDH活性差異造成。PEPC活性和檸檬酸含量在果實(shí)發(fā)育中后期都呈下降趨勢(shì),且在成熟期都表現(xiàn)為海拔越高,活性和含量越低。由此可以得出,在試驗(yàn)海拔范圍內(nèi),海拔越高,PEPC活性越低,檸檬酸合成量越少。

圖2 不同海拔黃果柑果實(shí)成熟期有機(jī)酸合成酶類活性的變化Fig.2 Changes of organic acid synthase activity in Huangguogan fruit at different altitudes at mature stage

2.3 海拔對(duì)檸檬酸分解酶類活性的影響

由圖3知,各海拔間細(xì)胞質(zhì)ACO和NADP-IDH活性分別自花后105 d和195 d開始表現(xiàn)出與果實(shí)檸檬酸降解程度相一致的規(guī)律,即海拔1 174 m>1 014 m>875 m,NADP-IDH活性隨著果實(shí)成熟逐漸升高,特別是在255 d后劇烈增加,細(xì)胞質(zhì)ACO活性全程保持在較高水平。線粒體ACO活性在不同海拔間沒有表現(xiàn)出明顯規(guī)律,且自花后135 d開始其活性穩(wěn)定在較低水平。由此說明,NADP-IDH作用關(guān)鍵時(shí)期是在果實(shí)成熟后期,一定范圍內(nèi)海拔升高顯著提升了檸檬酸降解階段果實(shí)細(xì)胞質(zhì)ACO活性和成熟期NADP-IDH活性,從而促進(jìn)了檸檬酸降解,造成黃果柑果實(shí)檸檬酸含量隨海拔升高而降低。

圖3 不同海拔黃果柑果實(shí)成熟期有機(jī)酸分解酶類活性的變化Fig.3 Changes of organic acid synthase activity in Huangguogan fruit at different altitudes at mature stage

2.4 海拔對(duì)檸檬酸合成酶類基因表達(dá)的影響

由圖4知,MDH基因表達(dá)量呈下降-上升-下降的趨勢(shì),與其酶活性變化趨勢(shì)有較大差異,CS和PEPC基因表達(dá)量與二者酶活性的變化趨勢(shì)雖大體一致,但CS自花后135 d開始,其基因表達(dá)豐度差異在不同海拔間的規(guī)律較為紊亂,PEPC基因在各海拔間的相對(duì)表達(dá)豐度差異也不大,表明海拔與檸檬酸合成酶類的基因表達(dá)沒有明顯關(guān)系。

圖4 不同海拔黃果柑果實(shí)成熟期有機(jī)酸合成酶類基因相對(duì)表達(dá)豐度的變化Fig.4 Changes of relative expression level of organic acid synthetic enzyme genes in Huangguogan fruit at different altitudes at mature stage

2.5 海拔對(duì)檸檬酸分解酶類基因表達(dá)的影響

圖5顯示,各海拔間ACO和NADP-IDH基因相對(duì)表達(dá)豐度自花后165 d開始表現(xiàn)為海拔1 174 m>1 014 m>875 m,由高到低各海拔果實(shí)ACO基因相對(duì)表達(dá)量的峰值在果實(shí)發(fā)育前期出現(xiàn)在花后135 d,后期則分別出現(xiàn)在花后240 d、300 d和330 d,NADP-IDH的基因相對(duì)表達(dá)豐度和酶活性自花后195 d開始,都表現(xiàn)出隨海拔升高而上升的趨勢(shì)。由此判斷,海拔的升高可能會(huì)通過提前啟動(dòng)ACO基因表達(dá)和增加NADP-IDH基因表達(dá)量來(lái)提升細(xì)胞質(zhì)ACO及NADP-IDH活性,以促進(jìn)果實(shí)檸檬酸的降解。

圖5 不同海拔黃果柑果實(shí)成熟期有機(jī)酸分解酶類基因相對(duì)表達(dá)豐度的變化Fig.5 Changes of relative expression level of organic acid synthetic enzyme gengs in Huangguogan fruit at different altitudes at mature stage

3 討論

黃果柑果實(shí)有機(jī)酸中檸檬酸占比最大,且在果實(shí)酸降解過程中降解最多,這與代琳等[10]研究一致,其在不同海拔之間的不同降解程度是導(dǎo)致黃果柑果實(shí)有機(jī)酸含量最終差異的決定性因素。

在本研究的海拔區(qū)段內(nèi),海拔主要通過影響檸檬酸降解程度來(lái)影響有機(jī)酸含量,海拔越高果實(shí)發(fā)育后期檸檬酸降解程度越大,這與曹永華等[11]和孫國(guó)超等[12]研究結(jié)果相近。毛如志等[13]研究也表明,美樂葡萄果實(shí)酸含量變化受到海拔區(qū)段影響。與之相反,羅顯揚(yáng)等[14]對(duì)朋娜臍橙研究認(rèn)為果實(shí)有機(jī)酸的含量與海拔呈正相關(guān),這可能是與不同果實(shí)種類有關(guān)。

海拔主要是通過對(duì)光、熱、水、氣、土壤和生物等生態(tài)因子的影響而對(duì)果實(shí)品質(zhì)起間接的生態(tài)作用。光照是黃果柑光合作用的能量來(lái)源,有研究表明,在秋季陰雨低溫天氣中,隨著日照時(shí)數(shù)的增加,尾張溫州蜜柑酸度相應(yīng)增加[1],此外,在馬瑟蘭葡萄的研究中也有數(shù)據(jù)指出,葡萄果穗遮光后其可滴定酸含量增加,完全遮光后,可滴定酸含量顯著增加[2]。溫度主要通過影響光合作用的效率而影響果實(shí)碳水化合物的積累,我國(guó)甜橙在日均氣溫≥10 ℃的活動(dòng)積溫低于8 000 ℃時(shí),隨年積溫的增加,可滴定酸含量逐漸降低[3],大多數(shù)柑橘品種在炎熱潮濕的熱帶地區(qū)含酸量低于亞熱帶地區(qū)[4]。降雨量和空氣濕度也會(huì)在不同程度上影響果實(shí)的可滴定酸含量,有報(bào)道指出,生長(zhǎng)期降雨量與蘋果果實(shí)中的有機(jī)酸含量呈顯著正相關(guān)[5],空氣相對(duì)濕度越低,柑橘果實(shí)的酸含量也越低[6]。在本研究中,黃果柑園區(qū)中主要?dú)夂蛞蜃釉诓煌０伍g均表現(xiàn)出了一定的差異,隨著海拔的升高,光照強(qiáng)度、年平均空氣相對(duì)濕度和年平均日溫差表現(xiàn)出了增大的趨勢(shì),海拔1 174 m處的光照強(qiáng)度、年平均空氣相對(duì)濕度和年平均日溫差較海拔875 m處分別增加約8.2%、6.2%和59.7%,而年平均氣溫和≥10 ℃年積溫這兩個(gè)指標(biāo)則隨著海拔的升高而降低,海拔1 174 m處的年平均氣溫和≥10 ℃年積溫較海拔875 m處分別降低約13.7%和6.2%。由此說明,不同海拔間的主要?dú)夂蛞蜃硬町愝^大,但哪個(gè)氣候因子是造成不同海拔間黃果柑糖品質(zhì)差異的關(guān)鍵還需要進(jìn)一步分析。

不同海拔果實(shí)檸檬酸代謝相關(guān)酶活性測(cè)試結(jié)果表明,各海拔間CS活性僅在花后75～105 d表現(xiàn)出顯著差異,之后沒有表現(xiàn)出較強(qiáng)活性差異規(guī)律,這可能是造成果實(shí)有機(jī)酸積累階段在不同海拔間出現(xiàn)差異的原因。PEPC和MDH活性整體表現(xiàn)出下降趨勢(shì),這可能是造成檸檬酸含量在花后120 d開始降低的重要原因。MDH在整個(gè)發(fā)育期沒有表現(xiàn)出較強(qiáng)活性差異規(guī)律,果實(shí)發(fā)育中后期PEPC活性與檸檬酸含量在不同海拔間表現(xiàn)出一致規(guī)律,說明不同海拔間PEPC活性差異對(duì)檸檬酸含量具有一定影響。細(xì)胞質(zhì)ACO活性在果實(shí)成熟期活性較高,NADP-IDH活性隨著果實(shí)成熟逐漸升高,且表現(xiàn)為海拔越高,果實(shí)檸檬酸降解程度越高,說明成熟期細(xì)胞質(zhì)ACO活性的增加有利于降低果實(shí)檸檬酸水平[21],NADP-IDH是果實(shí)發(fā)育后期檸檬酸降解的關(guān)鍵酶,這與龔榮高[8]在不同生境下臍橙果實(shí)酸代謝中所找到的主要酶一致?？偟膩?lái)說,一定范圍內(nèi)海拔升高顯著提升了果實(shí)檸檬酸降解階段細(xì)胞質(zhì)ACO活性和NADP-IDH活性,從而促進(jìn)了檸檬酸降解,造成黃果柑果實(shí)檸檬酸含量隨海拔升高而降低。

各酶基因表達(dá)豐度的結(jié)果表明,由高到低各海拔果實(shí)ACO基因相對(duì)表達(dá)量峰值出現(xiàn)的時(shí)間有所提前,說明海拔升高可能是通過提前啟動(dòng)ACO基因的表達(dá)來(lái)提升細(xì)胞質(zhì)ACO的活性。NADP-IDH基因表達(dá)量隨海拔上升的趨勢(shì)也說明,海拔升高有利于提升果實(shí)NADP-IDH基因的相對(duì)表達(dá)豐度,從而調(diào)控其酶活性,促進(jìn)果實(shí)檸檬酸的降解,造成不同海拔間果實(shí)有機(jī)酸的含量差異,這與曹淑燕等[6]在不同砧木黃果柑果實(shí)酸代謝的研究中所找到的差異關(guān)鍵基因具有一致性。本研究中PEPC活性在不同海拔間差異顯著,但PEPC基因的表達(dá)在不同海拔間卻沒有顯著差異,產(chǎn)生這一現(xiàn)象的具體原因還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

黃果柑果實(shí)有機(jī)酸的積累以檸檬酸為主,不同海拔間果實(shí)有機(jī)酸含量差異是由檸檬酸降解程度不同所引起的,一定范圍內(nèi)隨海拔升高果實(shí)檸檬酸含量反而下降。海拔的改變帶來(lái)的光照、溫度和濕度等氣象因子的改變可能是造成酸積累差異的重要因素。NADP-IDH、細(xì)胞質(zhì)ACO和PEPC是造成不同海拔間有機(jī)酸積累差異的主要酶。海拔的升高可能會(huì)通過提前啟動(dòng)ACO基因表達(dá)和增加NADP-IDH基因表達(dá)量來(lái)增加細(xì)胞質(zhì)ACO及NADP-IDH活性,促進(jìn)果實(shí)檸檬酸的降解,導(dǎo)致果實(shí)有機(jī)酸含量降低。因此,在生產(chǎn)中進(jìn)行栽培時(shí),應(yīng)注意海拔對(duì)黃果柑果實(shí)酸積累的影響。結(jié)合本文的研究結(jié)果而言,在四川地區(qū)種植黃果柑應(yīng)選擇高海拔內(nèi)較為適宜,此時(shí)果實(shí)有機(jī)酸含量最低。