綿羊GRM1基因多態(tài)性及其與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性

聶 瑋,孟 科,榮 軒,強(qiáng) 浩,郭晨浩,陶毛孩,馮登偵

(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,寧夏 銀川 750021)

灘羊是寧夏中部地區(qū)有名的裘皮用綿羊品種,灘羊肉膻味較輕且脂肪分布均勻、肉質(zhì)細(xì)嫩、風(fēng)味獨(dú)特、營養(yǎng)均衡[1];但其具有生長緩慢、繁殖力低的缺點(diǎn),所以引進(jìn)其他綿羊品種進(jìn)行雜交,對于提高其生產(chǎn)力具有重要意義。杜泊羊是國內(nèi)引進(jìn)較早的肉用綿羊,與地方品種雜交利用的效果較好,可以明顯改善后代的產(chǎn)肉性能[2]。小尾寒羊具有繁殖能力強(qiáng)、遺傳性能穩(wěn)定等特點(diǎn)[3]。故寧夏地區(qū)引進(jìn)杜泊羊和小尾寒羊,與灘羊進(jìn)行三元雜交,它們的后代能夠繼承生長發(fā)育快、產(chǎn)肉性能高、繁殖力強(qiáng)且肉質(zhì)鮮美的優(yōu)點(diǎn)[4]。

遺傳標(biāo)記是指可以用來區(qū)分生物個體或群體及其特定基因型的物質(zhì)標(biāo)記,分子遺傳標(biāo)記是以核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記,可以準(zhǔn)確地評估和預(yù)測動物的育種和生產(chǎn)質(zhì)量,理想的分子標(biāo)記相比傳統(tǒng)的遺傳標(biāo)記具有信息量大、分布廣、穩(wěn)定性好的優(yōu)勢。代謝型谷氨酸受體1(GRM1)是代謝型谷氨酸受體(medium glutamate receptors,mGluRs)家族成員之一,代謝型谷氨酸受體和離子型谷氨酸受體(ionotropic glutamate receptors,iGluRs)的激活可以直接引起興奮性神經(jīng)毒性,這一過程參與腦外傷、中風(fēng)、帕金森等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過程[5]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)8種mGluRs,分別命名為GRM1～GRM8,GRM1受到眾多學(xué)者的關(guān)注。GRM1基因位于綿羊8號染色體上,其在大腦中分布廣泛[6-7]。研究表明,mGluRs受體的過激活會產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)[8],進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞毒性,GRM1基因表達(dá)量的不同可產(chǎn)生不同的生理學(xué)效應(yīng)[9]。GRM1作為神經(jīng)元信號調(diào)節(jié)器時可以刺激神經(jīng)元的興奮性,GRM1基因在神經(jīng)元膜突觸前和突觸后特異性表達(dá)G蛋白偶聯(lián)受體,該受體可以激活細(xì)胞內(nèi)的Ca+,并通過一系列信號通路調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的興奮性[10-13]。GRM1能激活磷脂酶C,主要機(jī)理是刺激和激活更多的谷氨酸從突觸前細(xì)胞釋放。當(dāng)GRM1激活磷脂酶C時,可以產(chǎn)生三磷酸肌醇和1,2-二?；视?三磷酸肌醇和1,2-二酰基甘油對動植物早期發(fā)育和分化過程中的細(xì)胞增殖起著重要作用[14]。GRM1的活化能夠激活PI3K-AKT通路,PI3K-AKT信號通路參與肌肉生長發(fā)育、代謝調(diào)控和穩(wěn)態(tài)維持等重要生物學(xué)過程的調(diào)控。其中,PI3K家族成員可以促進(jìn)脂質(zhì)代謝、細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移;AKT家族成員在動物不同器官中均有不同程度的表達(dá)[15],AKT1、AKT2和AKT3的協(xié)同作用具有調(diào)控細(xì)胞大小、發(fā)育和新陳代謝的功能[16]。GRM1通過激活PI3K-AKT等信號通路,促進(jìn)對動物細(xì)胞增殖、生長、脂肪生成、肌肉生長發(fā)育等的調(diào)控。Zhang等[17]研究發(fā)現(xiàn),GRM1與綿羊斷奶后日增重顯著相關(guān),并參與骨骼和肌肉的發(fā)育。GRM1基因目前已被證實(shí)與綿羊的肌間脂肪有關(guān)[18],肌間脂肪含量與肉質(zhì)的嫩度、適口性和多汁性有關(guān)[19]。

本研究以灘羊(T)、杜泊羊(D)和小尾寒羊(XH)3個綿羊群體為研究對象,利用液相捕獲測序技術(shù)對D、T、XH綿羊群體GRM1基因的遺傳變異位點(diǎn)進(jìn)行檢測,篩選出具有多態(tài)性且品種間差異顯著的位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析。采用Sequenom MassARRAY?SNP技術(shù)對篩選到的2個位點(diǎn)與綿羊的肉質(zhì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,挖掘綿羊肉質(zhì)性狀相關(guān)的候選位點(diǎn),以期為寧夏地區(qū)肉羊新品種(系)選育提供有效的分子標(biāo)記手段,為肉羊的品種選育和雜交改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)動物均來自于石嘴山市平羅縣威震肉羊繁育場。隨機(jī)選擇健康無病、飼養(yǎng)管理一致的杜泊羊(D,n=30)、灘羊(T,n=30)和小尾寒羊(XH,n=31),共計(jì)91只綿羊,均為母羊。采用EDTA抗凝采血管頸靜脈采血5 mL,-20 ℃保存,用于DNA提取和液相捕獲測序分析。

隨機(jī)選取8月齡杜灘寒雜交羊(DTH)和灘羊(各8只,公母各半)、杜泊羊和小尾寒羊(各7只,3公4母),共30只綿羊,取耳組織放于75%乙醇中,-20 ℃保存,用于DNA提取和飛行質(zhì)譜檢測。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取

綿羊血液樣本DNA提取采用動物血液DNA提取試劑盒(北京天根科技有限公司)。使用0.8%瓊脂凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量,并利用Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)和0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測3個綿羊群體血液DNA濃度、純度和完整性。

1.2.2 液相捕獲測序

通過查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)和NCBI數(shù)據(jù)庫,確定GRM1基因序列ID號。然后將91個綿羊群體DNA樣本交由北京康普森農(nóng)業(yè)科技有限公司利用液相捕獲測序技術(shù)進(jìn)行測序,所得測序結(jié)果與現(xiàn)有綿羊參考基因組(Oar_rambouillet_v1.0)進(jìn)行比對分析。

1.2.3 飛行質(zhì)譜檢測

采用Sequenom MassARRAY?SNP技術(shù)對30只綿羊GRM1基因的2個位點(diǎn)進(jìn)行基因檢測,待檢樣品為DNA。由北京康普森農(nóng)業(yè)科技有限公司進(jìn)行飛行質(zhì)譜檢測。實(shí)驗(yàn)步驟包括引物設(shè)計(jì)(利用Ensemble數(shù)據(jù)庫中公開的綿羊GRM1基因SNPs位點(diǎn)信息,使用Assay Design 3.1軟件設(shè)計(jì)待測SNP位點(diǎn)的PCR引物和單堿基延伸引物)、DNA質(zhì)檢、PCR擴(kuò)增、單堿基延伸反應(yīng)、樣本脫鹽、芯片點(diǎn)樣、上機(jī)檢測,引物序列見表1。

表1 SNP位點(diǎn)引物信息Table 1 Primer information for SNP loci

1.3 肉質(zhì)性狀測定

1.3.1 屠宰

將用于DNA檢測和飛行質(zhì)譜檢測的30只綿羊進(jìn)行屠宰,宰前24 h禁食,8 h禁水,稱量后按照常規(guī)方式進(jìn)行屠宰,放血后去除皮、頭、蹄、尾、內(nèi)臟和生殖器。

1.3.2 屠宰性能測定

測定指標(biāo)包括宰前活重、胴體重、背膘厚、凈肉重、屠宰率、凈肉率和胴體脂肪含量(GR值)。稱取心、肝、脾、肺、腎、全骨的質(zhì)量。

1.3.3 肉品質(zhì)測定

取第3肋骨到第12肋骨之間的背最長肌肉樣品,使用嫩度儀測定剪切力,用壓力法測定失水率,用石蠟切片法測定肌纖維直徑、肌纖維密度,用普及型pH計(jì)測定pH值。

1.3.4 肌肉營養(yǎng)成分測定

肌肉中氨基酸含量依據(jù)GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測定》測定,肌肉中肌苷酸和肌苷含量用HPLC法測定,脂肪含量依據(jù)GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》測定,蛋白質(zhì)依據(jù)GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》測定,膽固醇依據(jù)GB 5009. 128—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中膽固醇的測定》測定,銅、鋅、鈣、鐵、鎂、硒元素含量分別依據(jù)GB 5009.13—2017、GB 5009.14—2017、GB 5009.92—2016、GB 5009.90—2016、GB 5009.241—2017、GB 5009.93—2017推薦的原子吸收分光光度法測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2019軟件計(jì)算3個綿羊群體rs415006419和rs403075278位點(diǎn)的等位基因頻率、基因型頻率,利用卡方獨(dú)立性檢驗(yàn)判斷其顯著性;統(tǒng)計(jì)計(jì)算多態(tài)信息含量(PIC)、觀測雜合度(He)、期望雜合度(Ho)和有效等位基因數(shù)(Ne),并進(jìn)行卡方適合性檢驗(yàn),分析其是否處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)。利用SPSS 25.0軟件對綿羊群體各基因型與肉質(zhì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

所采用的分析模型為一般線性模型:Y=μ+G+m+e。式中,Y代表性狀測定值,μ代表群體均值,G代表基因型效應(yīng),m代表性別效應(yīng),e代表隨機(jī)殘差。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA檢測結(jié)果

Nanodrop 2000檢測結(jié)果顯示,所有樣品基因組DNA的D260/D280均合格。瓊脂糖凝膠電泳顯示所有DNA均保持完好明亮,未發(fā)生降解(圖1),可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

M,DL2000 DNA marker;1～8,部分綿羊基因組DNA。M, DL2000 DNA marker; 1-8, Genomic DNA of some sheep.圖1 試驗(yàn)羊群基因組DNA電泳圖Fig.1 DNA electrophoresis diagram of experimental sheep

2.2 GRM1基因多態(tài)性

在91只羊的GRM1基因中共檢測到共有28個突變位點(diǎn),均為外顯子突變,在rs415006419和rs403075278位點(diǎn)存在多態(tài)性,這2個位點(diǎn)均為同義突變,突變堿基均為C>T(表2),其余位點(diǎn)無多態(tài)性。卡方獨(dú)立性檢驗(yàn)顯示,在3個綿羊群體中GRM1基因的rs415006419、rs403075278位點(diǎn)基因型頻率存在顯著性差異,2個位點(diǎn)在3個綿羊群體中均處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)(P>0.05)。由表3可知,rs415006419位點(diǎn)在D綿羊群體中均表現(xiàn)為低度多態(tài)(PIC<0.25),在T和XH綿羊群體中均表現(xiàn)為高純合度與中度多態(tài)(0.25

表2 GRM1基因2個位點(diǎn)在3個群體中的基因頻率和基因型頻率Table 2 Gene frequencies and genotype frequencies of two loci of GRM1 gene in three populations

表3 GRM1基因SNP位點(diǎn)群體遺傳學(xué)分析Table 3 Population genetic analysis of SNP locus of GRM1 gene

2.3 GRM1基因分型結(jié)果

由圖2與表4可見:GRM1基因rs403075278位點(diǎn)在D、DTH、T、XH 4個綿羊群體中有CC、TT和CT 3種基因型,TT基因型個體最多(15),CC基因型個體最少(1);rs415006419位點(diǎn)在D、DTH、T、XH 4個綿羊群體中存在CC、TT和CT 3種基因型,TT基因型個體最多(21),CC基因型個體最少(1)。

表4 GRM1基因rs403075278位點(diǎn)和rs415006419位點(diǎn)的群體分型結(jié)果Table 4 Population typing results for rs403075278 locus and rs415006419 locus of GRM1 gene

續(xù)表4 Continued Table 4

圖2 GRM1基因rs403075278位點(diǎn)和rs415006419位點(diǎn)的分型結(jié)果Fig.2 Typing results for the rs403075278 locus and rs415006419 locus of GRM1 gene

2.4 rs415006419和rs403075278位點(diǎn)與綿羊肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性

2.4.1 不同基因型綿羊的屠宰性能

淘汰群體數(shù)量低于5%的基因型(CC基因型),然后對CT和TT基因型進(jìn)行分析,結(jié)果見表5。rs415006419位點(diǎn)CT基因型綿羊腎的質(zhì)量顯著(P<0.05)大于TT基因型,不同基因型間其他屠宰性能均無顯著差異(P>0.05)。rs403075278位點(diǎn)TT基因型的宰前活重、胴體重、凈肉重、十二指腸長度,以及心、肺和腎的質(zhì)量均極顯著(P<0.01)大于CT基因型,TT基因型的背膘厚、凈肉率和脾的質(zhì)量顯著(P<0.05)大于CT基因型,TT和CT基因型的GR值、屠宰率、肝的質(zhì)量和全骨的質(zhì)量無顯著差異(P>0.05)。

表5 綿羊GRM1基因不同位點(diǎn)各基因型的屠宰性能Table 5 Slaughter performance of each genotype at different loci of GRM1 gene in sheep

2.4.2 不同基因型綿羊的肉品質(zhì)

淘汰群體數(shù)量低于5%的基因型(CC基因型),然后對CT和TT基因型進(jìn)行分析,結(jié)果見表6。rs415006419位點(diǎn)CT和TT基因型綿羊的肉品質(zhì)均無顯著差異(P>0.05);rs403075278位點(diǎn)CT基因型綿羊的pH值、剪切力和失水率極顯著(P<0.01)大于TT基因型,2個基因型綿羊的肌纖維直徑、肌纖維密度和熟肉率無顯著差異(P>0.05)。

表6 綿羊GRM1基因不同位點(diǎn)各基因型的肉品質(zhì)Table 6 Meat quality of each genotype at different loci of GRM1 gene in sheep

2.4.3 不同基因型綿羊的肌肉營養(yǎng)成分

淘汰群體數(shù)量低于5%的基因型(CC基因型)后,對CT和TT基因型進(jìn)行分析,結(jié)果見表7。rs415006419位點(diǎn)TT基因型綿羊肌肉的酪氨酸含量顯著(P<0.05)高于CT基因型,2個基因型的他營養(yǎng)成分含量均無顯著差異(P>0.05)。rs403075278位點(diǎn)TT基因型綿羊肌肉的脂肪、鈣含量、苯丙氨酸和組氨酸含量顯著(P<0.05)高于CT基因型,2個基因型綿羊的其他營養(yǎng)成分含量均無顯著差異(P>0.05)。

表7 綿羊GRM1基因不同位點(diǎn)各基因型的肌肉營養(yǎng)成分Table 7 Nutrient composition in sheep muscle of each genotype at different loci of GRM1 gene

3 討論

3.1 三個綿羊群體GRM1基因的多態(tài)性

群體遺傳變異程度的大小反映了群體遺傳多樣性,通常使用PIC表示,PIC數(shù)值越大,群體的遺傳多樣性越高[20],表明該群體存在一定的遺傳變異潛力[21]。PIC取決于檢測等位基因的數(shù)量和頻率分布[22]。GRM1基因rs403075278位點(diǎn)在3個綿羊群體中均表現(xiàn)為中度多態(tài)(0.25

3.2 GRM1基因與屠宰性能的關(guān)聯(lián)性

屠宰性能是評價肉用性能和經(jīng)濟(jì)效益的重要指標(biāo),肉品質(zhì)是衡量肉質(zhì)性狀的關(guān)鍵[23]。胴體重是影響肉類品質(zhì)和價值的重要因素,直接影響著肉制品的加工與消費(fèi)。屠宰率和凈肉率是測定畜禽產(chǎn)肉性能和生長發(fā)育的重要依據(jù)[24]。Zhang等[17]對綿羊體重性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn),GRM1是影響綿羊體增重的重要候選基因。彭珍等[25]通過對恩施黑豬胴體與肉質(zhì)性狀間相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),背膘厚與胴體重有極顯著相關(guān)性,背膘厚的增加可以引起胴體重的增加,從而影響活體重。本研究中GRM1基因rs403075278位點(diǎn)不同基因型綿羊的背膘厚、胴體重、活體重均有顯著差異,表明GRM1可以影響到綿羊的體增重,與前人研究結(jié)果一致。殷雨洋等[26]研究表明,湖羊心質(zhì)量的顯著提高可能與湖羊體重的提高有關(guān)。隨著體重的增加,機(jī)體需要營養(yǎng)物質(zhì)增多,代謝廢物增加,使得心質(zhì)量增加以滿足這種不平衡。閔凡貴等[27]研究表明,臟器質(zhì)量明顯受到體重的影響。GRM1基因的rs403075278位點(diǎn)不同基因型間綿羊的十二指腸長度與心、肺、腎、脾的質(zhì)量均有顯著差異,rs415006419位點(diǎn)不同基因型間綿羊的腎重有顯著差異,說明體重的增加影響了綿羊的臟器質(zhì)量。王國森等[28]研究表明,CLPC基因CT型綿羊體重、體尺指標(biāo)均高于CC型的綿羊,表明C→T轉(zhuǎn)換可以促進(jìn)綿羊的生長發(fā)育。同樣,在本研究中TT基因型綿羊的宰前活重、胴體重、凈肉重、十二指腸長度,以及心、肺、腎的質(zhì)量均高于CT型綿羊,說明C→T轉(zhuǎn)換促進(jìn)了綿羊的生長發(fā)育。

3.3 GRM1基因與肉品質(zhì)、營養(yǎng)成分的關(guān)聯(lián)性

肉品質(zhì)是評價肉質(zhì)特性的主要依據(jù),pH值、剪切力是衡量肌肉品質(zhì)重要感官指標(biāo)之一[29-30]。肌肉中營養(yǎng)物質(zhì)的含量與肉品質(zhì)直接相關(guān),營養(yǎng)價值、感官特征與理化特性是影響肉品質(zhì)的重要因素[31]。研究表明,GRM1的活化能夠激活PI3K-AKT通路,PI3K-AKT可以參與脂肪生成和肌肉生長發(fā)育等重要生物學(xué)調(diào)控。GRM1基因與谷氨酸代謝通路相關(guān),李武峰等[32]研究表明,谷氨酸代謝通路可能與廣靈驢的肉質(zhì)嫩度有關(guān)。在本研究中GRM1基因rs403075278位點(diǎn)不同基因型的綿羊脂肪含量、失水率、剪切力、pH值等有顯著差異,可能是由于GRM1基因活化激活PI3K-AKT通路,從而影響了肌間脂肪的生成,肌間脂肪可以改善綿羊肉質(zhì)的嫩度和適口性。肌肉中的氨基酸含量不但對羊肉的營養(yǎng)價值有重要影響,而且會對羊肉的風(fēng)味產(chǎn)生一定的影響,必需氨基酸的組成和含量是蛋白質(zhì)食品中的一項(xiàng)重要指標(biāo)。GRM1基因與谷氨酸代謝通路相關(guān),谷氨酸是各種氨基酸代謝和轉(zhuǎn)化的樞紐和中間環(huán)節(jié),通過谷氨酸代謝的變化,可以影響其他多種氨基酸的代謝。Rowe等[33]研究表明,體內(nèi)氧化可以抑制蛋白酶活化,激活鈣蛋白酶抑制酶活性,組氨酸可以參與體內(nèi)氧化還原反應(yīng),通過調(diào)節(jié)鈣蛋白酶活性調(diào)節(jié)肌肉嫩度。翟彪[34]研究表明,飼料中添加適量的組氨酸可以提高肌肉中粗蛋白和粗脂肪的含量,同時可以提高肌肉的剪切力。李文[35]研究發(fā)現(xiàn),添加適宜水平的苯丙氨酸可以提高肌肉中蛋白和脂肪的含量,同時可以提高肌肉的相對剪切力和持水能力。曹艷芳等[36]研究表明,酪氨酸可以在一定程度上提高淅川烏骨雞的肉品質(zhì)。GRM1基因rs403075278位點(diǎn)不同基因型的苯丙氨酸和組氨酸含量有顯著差異,rs415006419位點(diǎn)不同基因型的酪氨酸含量有顯著差異,苯丙氨酸和組氨酸均可以提高肌肉中蛋白和脂肪的含量,酪氨酸可以提升肌肉品質(zhì),提升肉質(zhì)營養(yǎng)價值,與上述研究結(jié)果基本一致。GRM1基因rs403075278位點(diǎn)不同基因型的鈣含量差異顯著,可能與GRM1基因可以在神經(jīng)元膜中表達(dá)G蛋白從而激活細(xì)胞內(nèi)的鈣離子[10-13]有關(guān)。GRM1基因的rs403075278位點(diǎn)和rs415006419位點(diǎn)突變可以影響綿羊肉品質(zhì)和肌肉營養(yǎng)成分,說明GRM1基因可以調(diào)控綿羊的肉品質(zhì),可作為綿羊肉質(zhì)性狀的重要候選基因。

4 結(jié)論

GRM1基因的rs403075278位點(diǎn)和rs415006419位點(diǎn)在D、T、XH和DTH群體具有多態(tài)性,不同基因型綿羊的肉質(zhì)性狀存在顯著差異。TT基因型綿羊的屠宰性能和肌肉營養(yǎng)成分高于CT基因型,CT基因型綿羊的肉品質(zhì)高于TT基因型。GRM1基因可以作為綿羊肉質(zhì)性狀的候選基因,該基因的2個位點(diǎn)適用于綿羊的肉質(zhì)性狀選育,可作為綿羊肉質(zhì)性狀選育的潛在候選遺傳標(biāo)記。