南酸棗大小孢子發(fā)生及雌雄配子體發(fā)育過程研究

楊如夢 汪加魏 孫榮喜 丁菲 張露 寧曉丹 熊偉 詹麗紅 吳南生

摘要：[目的]觀察南酸棗雌雄配子的發(fā)育過程，初步探究南酸棗雌雄蕊敗育的發(fā)生原因。[方法]利用石蠟切片觀察法研究南酸棗的大小孢子和雌雄配子體的發(fā)育過程。[結(jié)果]（1）南酸棗雌雄異株、單性花，雄花無子房，雌花具退化雄蕊；雄花縱長大于3mm時(shí)，花藥成熟，子房縱長達(dá)3.5 mm時(shí)，胚囊成熟；（2）雄花成熟花藥壁共分5層，由外向內(nèi)為1層表皮、1層藥室內(nèi)壁、2層中層、1層絨氈層，發(fā)育形式屬基本型；（3）小孢子母細(xì)胞分裂形式屬同時(shí)型，四面體型小孢子四分體，2-細(xì)胞型花粉，見3個(gè)萌發(fā)孔胞質(zhì)囊；（4）雙珠被、厚璩心；胚囊發(fā)育類型為蓼型，后期倒轉(zhuǎn)；（5）雌花退化雄蕊的花藥壁5層，雌花具左右對(duì)稱型小孢子四分體，小孢子期絨氈層解體，小孢子解體后花藥空囊，藥室內(nèi)壁略纖維狀加厚，表皮此時(shí)退化；（6）南酸棗雄花從現(xiàn)蕾到散粉約25 d時(shí)間，雌花從現(xiàn)蕾到胚囊成熟約24 d時(shí)間。[結(jié)論]南酸棗雌雄配子發(fā)育模式與漆樹科大多數(shù)種一致；雄花無雌蕊，系花芽發(fā)育過程中雌蕊原基退化所致；南酸棗未見退化胚珠，雌花退化雄蕊具正常的小孢子母細(xì)胞、異常的小孢子四分體和小孢子，且絨氈層不正常解體，花藥空囊，無花粉粒。

關(guān)鍵讕：南酸棗；大孢子；小孢子；雌配子體；雄配子體

中圖分類號(hào)：Q944.57 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1001-1498（2023）03-0109-10

南酸棗系無患子目（Sapindales）、漆樹科（Anacardiaceae）、南酸棗屬（Choerospondias）植物，該屬僅有原變種南酸棗和變種毛脈南酸棗（C.axillaris var pubinervis）兩個(gè)種或變種。南酸棗為落葉喬木，雌雄異株；3-4月開花，5月坐果，種子常具5個(gè)萌發(fā)孔，分布于江西、福建、湖南、浙江、四川、貴州、廣東、廣西、云南等地。南酸棗是我國重要的果材兩用型經(jīng)濟(jì)樹種，果實(shí)既可食用又可人藥，材質(zhì)好、抗性強(qiáng)，果實(shí)的可食率約為60%，總黃酮含量可達(dá)34 mg·g-1，果皮中有機(jī)酸含量達(dá)8.13%，富含18種氨基酸，果皮中酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)含量高于果肉；果肉可制成各類風(fēng)味食品，營養(yǎng)價(jià)值高；果實(shí)中的甲醇提取物具抗炎作用，可減輕類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎性炎癥；果核可作活性炭原料，樹皮可用作鞣革和單寧提取物的原料，開發(fā)和研究價(jià)值巨大。

漆樹科植物的利用價(jià)值高，開發(fā)前景較大，漆樹科下的腰果（Anacardium occidentale Linn.）、阿月渾子（Pistacia vera Linn）、扁桃（Mangifera persciforma C.Y.Wu&T.LMing）、杧果（Mangifera indica Linn.）及南酸棗等樹種的果實(shí)均可食用，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而，對(duì)漆樹科各樹種生殖發(fā)育特性的研究還不夠深入，研究多集中在果樹的花果特性、花粉培養(yǎng)等。目前，對(duì)南酸棗的研究主要集中在無性繁殖、群落生態(tài)學(xué)、藥用價(jià)值等方面，但與南酸棗繁殖和育種密切相關(guān)的大小孢子發(fā)生及雌雄配子體發(fā)育過程仍不清楚。

果樹雌雄配子的發(fā)育過程是果樹繁殖的重要生理階段，揭示雌雄配子發(fā)育過程和方式，可為經(jīng)濟(jì)林果樹的優(yōu)良品種選育、高效增產(chǎn)栽培技術(shù)等提供重要的生殖生物學(xué)基礎(chǔ)。已有研究證實(shí)，不同品種棗（Ziziphus jujuba Mill）的花粉質(zhì)量差別較大，棗去雄困難，選育出的無花粉品種‘Zaocuiwang的小孢子在四分體階段發(fā)生敗育，是一個(gè)十分理想的雄性不育種質(zhì)。梨（Pyrus ussuriensis Maxim）人工授粉的成功率與花粉狀態(tài)、人工授粉時(shí)間緊密相關(guān)。低溫會(huì)減緩柁果小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂過程從而影響花粉的正常發(fā)育。軟棗獼猴桃（Actindra arguta Planch）的小孢子處于單核晚期時(shí)，花藥愈傷組織誘導(dǎo)率高于其他時(shí)期，切片觀察可以為花粉培養(yǎng)提供較精準(zhǔn)的數(shù)據(jù)資料，為育種工作提供幫助。黃連木（Pistacia chinensis Bunge）、阿月渾子中出現(xiàn)的胚珠退化現(xiàn)象可能是造成其結(jié)實(shí)率低的原因。漆樹（Toxicodendron vemicifluum（Stokes） F.A.Barkl）具有敗育花粉會(huì)導(dǎo)致授粉受精不良對(duì)南酸棗開花結(jié)實(shí)及其雌雄配子發(fā)育機(jī)理的研究是開展育種工作的重要基礎(chǔ)。本研究利用常規(guī)石蠟切片技術(shù)探究南酸棗的大小孢子和雌雄配子體的發(fā)育過程，揭示南酸棗雌雄配子的發(fā)育特性，觀察雌雄蕊敗育發(fā)生的情況，豐富南酸棗的生殖生物學(xué)理論，并為進(jìn)一步開展品種選育提供理論指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料栽培在江西省南昌市江西農(nóng)業(yè)大學(xué)南酸棗實(shí)驗(yàn)基地內(nèi)?；匚挥诮魇≈斜辈浚?15°27′E-116°35′E、28°10′N-29°11′N之間，海拔為49.5 m，屬亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候。供試材料為2012年嫁接、長勢良好、處于盛年期的南酸棗。

1.2試驗(yàn)方法

南酸棗雌雄異株，雄花芽先于雌花芽萌發(fā)。選擇雌、雄株各3株，于2021年3月10日至4月15日采集雄花，3月20日至4月25日采集雌花，每隔3d采一次。一部分鮮樣置于日產(chǎn)SM21270i顯微鏡下觀察，一部分鮮樣立即投入50%的FAA固定液中固定24h。材料固定后經(jīng)乙醇各梯度溶液逐級(jí)脫水，后經(jīng)二甲苯透明，浸蠟6h以上；采用德國SLEE半自動(dòng)石蠟切片機(jī)切片；番紅單染或番紅固綠對(duì)染，番紅染色16 h以上，固綠染色30 s，95%酒精洗固綠60 s，樹膠封片。每時(shí)期制作石蠟切片20片，在日產(chǎn)尼康ECLIPSECiL顯微鏡下觀察，并用NIS-Elements軟件進(jìn)行拍照，Photoshop CC進(jìn)行圖片整理。

2結(jié)果與分析

2.1花藥壁發(fā)育

觀察發(fā)現(xiàn)，南酸棗每花具雄蕊10～12枚，花藥具4個(gè)蝶型小孢子囊（圖1，L）。孢原細(xì)胞平周分裂產(chǎn)生初生周緣細(xì)胞（圖1，A），初生周緣細(xì)胞分裂形成2層次生周緣細(xì)胞（圖1，B-C），由外至內(nèi)分化形成1層藥室內(nèi)壁、2層中層及1層絨氈層，即成熟花藥壁結(jié)構(gòu)（圖1，D），花藥壁形成方式屬基本型。表皮細(xì)胞初期排列整齊（圖1，B-D），二細(xì)胞花粉期表皮細(xì)胞波狀不規(guī)則排列（圖1，H），之后逐漸萎縮退化，花粉成熟時(shí)消失（圖1，1-L）。中層細(xì)胞具2層結(jié)構(gòu)，小孢子單核靠邊期向內(nèi)一層消失（圖1，H），向內(nèi)一層被擠壓（圖1，1-J），成熟花粉期中層消失（圖1，K-L）。小孢子發(fā)育期藥室內(nèi)壁細(xì)胞體積增大（縱向增大）（圖1，G-H），后期細(xì)胞壁發(fā)生帶狀加厚（圖1，J-L），成熟花藥的花藥壁剩下纖維層（藥室內(nèi)壁），花粉成熟后藥室內(nèi)壁無帶狀加厚的外切向壁破裂釋放花粉粒（圖1，L）。絨氈層在小孢子母細(xì)胞期質(zhì)濃、碎裂式多核的情況與漆樹類似（圖1，D）。小孢子四分體期，絨氈層細(xì)胞可見明顯細(xì)胞壁（圖1，E）。四分體釋放小孢子后絨氈層處于皺縮的狀態(tài)，多核，胞質(zhì)濃（圖1，F(xiàn)-G），小孢子單核靠邊期至二細(xì)胞花粉期的絨氈層細(xì)胞逐漸囊泡化，絨氈層細(xì)胞具大液泡，絨氈層內(nèi)切向壁開始溶解（圖1，H）。生殖細(xì)胞分裂時(shí)，絨氈層細(xì)胞胞質(zhì)逐漸釋放到藥室中（圖1，I-J）。花粉成熟時(shí)，絨氈層細(xì)胞胞質(zhì)完全釋放，外切向壁溶解消失，最后絨氈層完全溶解（圖1，K-L），小孢子發(fā)育階段對(duì)應(yīng)著花藥壁發(fā)育階段（詳見表1）。

2.2小孢子的發(fā)育

小孢子囊中央的造孢細(xì)胞（孢原細(xì)胞）平周分裂產(chǎn)生初生造孢細(xì)胞（圖1，A-B），再經(jīng)分裂形成小孢子母細(xì)胞（圖1，C-D）。小孢子母細(xì)胞核大，細(xì)胞器多、分布密集，細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常（圖2，A）。每個(gè)小孢子母細(xì)胞經(jīng)過減數(shù)分裂形成四分體，這四個(gè)單倍體細(xì)胞釋放后就是小孢子，小孢子繼續(xù)發(fā)育成為雄配子體。小孢子母細(xì)胞開始減數(shù)分裂，紡錘絲將一對(duì)同源染色體拉向兩極（圖2，B），二分體移至兩極后，不形成細(xì)胞板（圖2，c）；核膜重建后，形成兩個(gè)子細(xì)胞，至此完成第一次分裂，形成一個(gè)雙核細(xì)胞（圖2，D）。兩個(gè)核同時(shí)進(jìn)行第二次分裂（圖2，E-F），分裂完成后四個(gè)核之間產(chǎn)生壁，同時(shí)分隔成四個(gè)細(xì)胞，在切面上表現(xiàn)為等邊三角形排列狀，四個(gè)細(xì)胞被胼胝質(zhì)包圍，形成四面體型四分體（圖2，G-H）。最后胼胝質(zhì)壁溶解，小孢子最后從四分體中被釋放（圖3，A）。

2.3雄配子體的發(fā)育

小孢子從四分體釋放后（圖3，A），體積增大，此時(shí)細(xì)胞核大且位于細(xì)胞中央（圖3，B）。隨后，細(xì)胞質(zhì)液泡化，形成中央大液泡并將細(xì)胞核擠向一邊（即雄配子體發(fā)育的單核靠邊期）（圖3，c），同一花藥內(nèi)小孢子分裂并不一致（圖3，D-F）。單核靠邊期小孢子經(jīng)過一次不均等的胞質(zhì)分裂和有絲分裂，形成了透鏡型的生殖細(xì)胞和圓形的營養(yǎng)細(xì)胞（圖3，D-E），此時(shí)，兩個(gè)細(xì)胞的核明顯，營養(yǎng)細(xì)胞體積更大。生殖細(xì)胞逐漸與壁脫離游離在營養(yǎng)細(xì)胞中，此時(shí)胞質(zhì)少（圖3，F(xiàn)）。營養(yǎng)細(xì)胞靠近萌發(fā)孔，生殖細(xì)胞在遠(yuǎn)離萌發(fā)孔的一端（圖3，G）。成熟花粉可見3個(gè)萌發(fā)孔，細(xì)胞壁厚，胞質(zhì)濃（圖3，G-H）。

2.4胚珠和大孢子產(chǎn)生

南酸棗子房多5室，柱頭具乳突（圖4，A），每室一個(gè)胚珠，各自獨(dú)立發(fā)育，發(fā)育不同步（圖4，C）。子房壁內(nèi)表皮下的細(xì)胞進(jìn)行平周分裂產(chǎn)生胚珠原基（圖4，B），胚珠原基的底部發(fā)育成為珠心，與胎座著生的位置成為珠柄（圖4，C-D）。南酸棗胚珠具兩層珠被，分別為內(nèi)珠被和外珠被。外珠被生成后，細(xì)胞大，略為方形，排列有序，開始平周分裂和垂周分裂（圖版4，1）。珠心深處珠孔端逐漸分化出孢原細(xì)胞（圖4，H-J），孢原細(xì)胞發(fā)育，經(jīng)平周分裂產(chǎn)生一個(gè)周緣細(xì)胞和一個(gè)造孢細(xì)胞（圖4，K）。造孢細(xì)胞分裂兩次形成排列為線形大孢子四分體（圖4，L），近珠孔端的3個(gè)周緣細(xì)胞逐漸退化消失（圖4，M-N），剩下的合點(diǎn)端的一個(gè)孢原細(xì)胞行使大孢子母細(xì)胞的功能，繼續(xù)發(fā)育形成單核胚囊（圖4，O）。

2.5雌配子體發(fā)育

大孢子第一次分裂形成的兩個(gè)核分別向合點(diǎn)端和珠孔端移動(dòng)建立極性（圖5，A-E），兩端的核繼續(xù)分裂一次形成4核胚囊（圖5，F(xiàn)），再經(jīng)過第三次分裂形成8核胚囊，珠孔端的3個(gè)核組成卵器，卵器包括一個(gè)卵細(xì)胞，內(nèi)含2個(gè)助細(xì)胞核（圖5，H-M），另一個(gè)核成為上極核。合點(diǎn)端的3個(gè)核形成反足細(xì)胞，呈品字形排列（圖5，G-1），1個(gè)核成為下極核；下極核移至上極核旁邊一起組成具有雙核的中央細(xì)胞（圖5，1），即次生核（帶2個(gè)細(xì)胞核的極核），胚珠開始發(fā)生倒轉(zhuǎn)（圖5，J）。至此，形成7細(xì)胞8核的成熟胚囊（圖5，N-P），故南酸棗胚囊發(fā)育模式為蓼型。

2.6雌花中退化雄蕊的發(fā)育

雌花的退化雄蕊短且空囊，花絲長于花藥，花藥逐漸萎縮（圖6，E），短于雌蕊（圖6，A-B）；雄花的正常雄蕊飽滿呈橙黃色（圖6，C-D）。雌花胚珠原基出現(xiàn)時(shí)，雄蕊開始發(fā)育（圖6，F(xiàn)），小孢子母細(xì)胞多可發(fā)育為左右對(duì)稱型四分體（圖6，H）；小孢子發(fā)育不良（圖6，I），最后花藥空囊（圖6，J）。大孢子母細(xì)胞期絨氈層多核，具1層表皮、1層藥室內(nèi)壁、2層中層、1層絨氈層，大孢子母細(xì)胞核大，表現(xiàn)正常（圖6，G）；從四分體釋放的小孢子核明顯且居中，絨氈層開始溶解，小孢子開始溶解（圖6，1）；小孢子退化后，表皮逐漸退化波浪狀排列，藥室內(nèi)壁的細(xì)胞壁發(fā)生纖維狀加厚，絨氈層最后只見殘留痕跡（圖6，J）?；ㄋ幙漳?，雄蕊敗育（圖6，J）。

2.7外部形態(tài)特征與雌雄配子發(fā)育的相關(guān)性

南酸棗為單性花，聚傘圓錐花序，和漆樹科的阿月渾子類似，雄蕊發(fā)育較雌蕊早。2021年的3月10日左右雌雄花芽開始萌發(fā)，南酸棗雄花進(jìn)入花粉成熟期時(shí)，雌花的胚囊還處于二核胚囊期至四核胚囊期，花序上的花多處于不同的發(fā)育狀態(tài)。由表2可知，南酸棗雄花從現(xiàn)蕾到散粉約28 d時(shí)間，雌花從現(xiàn)蕾到胚囊成熟約35 d時(shí)間，雄花縱長大于3.0 mm時(shí)，花藥成熟，子房縱長達(dá)3.5 mm時(shí)，胚囊成熟。南酸棗雌、雄蕊發(fā)育與外部形態(tài)的相關(guān)性具體內(nèi)容見表2。

3討論

3.1南酸棗大小孢子和雌雄配子體發(fā)育特性

漆樹科中的漆樹、黃連木及阿月渾子均具有厚珠心、倒轉(zhuǎn)胚珠、大孢子四分體直線型排列、胚囊蓼型發(fā)育、同時(shí)型胞質(zhì)分裂、腺質(zhì)型絨氈層、2-細(xì)胞花粉等特征，腰果（Anacardium occidentale Linn.）和杧果都具雙核花粉，南酸棗雌雄配子發(fā)育模式與上述漆樹科多數(shù)種特征相同。

漆樹成熟胚囊具有承珠盤結(jié)構(gòu)，合點(diǎn)端的承珠盤具喇叭狀結(jié)構(gòu)連接胚囊中的維管束。在觀察南酸棗胚囊發(fā)育的過程中，在八核胚囊期可觀察到反足細(xì)胞端有一群體積較大、條形喇叭狀的不規(guī)則細(xì)胞（圖5H），且細(xì)胞壁被固綠染色較深（圖5，1、L），細(xì)胞壁厚，胚囊成熟時(shí)，可以觀察到合點(diǎn)端至胚囊底部有一群明顯的細(xì)胞群相連，其中分布著維管束（圖4，G；圖5，P），因此，認(rèn)為南酸棗也具有和漆樹類似的承珠盤結(jié)構(gòu)，起物質(zhì)運(yùn)輸?shù)淖饔?。南酸棗在小孢子單核靠邊期絨氈層相對(duì)完整（圖1，G），二細(xì)胞花粉發(fā)育初期絨氈層始見壁溶解（圖1，H），黃連木、阿月渾子、漆樹的正?；ㄋ幗q氈層大多在小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期開始解體，這與南酸棗有所不同。

3.2南酸棗單性花的發(fā)育特性

南酸棗雌雄異株，雄花未見結(jié)實(shí)現(xiàn)象的研究報(bào)道，而雌花的退化雄蕊無花粉粒，故將南酸棗的花稱作“單性花：雄花只有雄蕊，雄蕊發(fā)育正常，但雌蕊原基可能很早就已退化，而雌花具無花粉的退化雄蕊。南酸棗中未見胚珠退化現(xiàn)象，是否存在胚珠退化還有待進(jìn)一步觀察。大部分植物雄蕊退化發(fā)生在小孢子四分體時(shí)期前后，如柿子（Diospyros kaki Thunberg）單性花的形成很可能與細(xì)胞程序性死亡有關(guān)，采用TUNEL（TdT-mediated dUTPNick-End Labeling）染色法可觀察到有大量細(xì)胞在雄蕊原基退化時(shí)期死亡，可預(yù)以佐證。漆樹、黃連木及南酸棗的絨氈層不正常溶解，從而導(dǎo)致雄蕊發(fā)育異常，這可能與基因調(diào)控下程序性死亡的發(fā)生有關(guān)。南酸棗正常雄蕊小孢子四分體和退化雄蕊小孢子四分體類型不同，前者為四面體形，后者為左右對(duì)稱形；漆樹和黃連木中存在少量的左右對(duì)稱型四分體，但是都出現(xiàn)在雄花中且表現(xiàn)正常。南酸棗退化雄蕊中具核大、細(xì)胞器多的正常小孢子母細(xì)胞（圖6F-G），四分體期開始才發(fā)育異常（圖6H-I），而漆樹的退化雄蕊中小孢子母細(xì)胞期開始發(fā)育異常，兩者存在差異。胞質(zhì)分裂的形式常常在同一類植物中是固定的，兩種胞質(zhì)分裂形式與細(xì)胞板的形成機(jī)制相關(guān)，胞質(zhì)分裂異常會(huì)導(dǎo)致花粉敗育，南酸棗退化雄蕊出現(xiàn)連續(xù)型胞質(zhì)分裂，即左右對(duì)稱型小孢子四分體的情況，因此，推測南酸棗退化雄蕊花粉敗育除了和絨氈層提前溶解有關(guān)之外，還與胞質(zhì)分裂過程中細(xì)胞板的形成異常有關(guān)。

4結(jié)論

綜上所述，南酸棗雌雄配子的發(fā)育與漆樹科胚胎學(xué)的特征基本一致；退化雄蕊中的小孢子四分體發(fā)育異常，小孢子溶解，花藥空囊，從而導(dǎo)致雌花的雄蕊無育性，雄花中無雌蕊，這可能是因?yàn)榇迫镌耐嘶蛉笔?，該問題還有待進(jìn)一步觀察。本文在研究中發(fā)現(xiàn)，南酸棗同一子房內(nèi)存在胚囊發(fā)育不同步的情況，由此會(huì)影響果實(shí)的發(fā)育進(jìn)程。關(guān)于南酸棗胚珠的生長發(fā)育情況還有待進(jìn)一步研究，從而為深入了解南酸棗雌花的發(fā)育特性和開展品種選育提供理論基礎(chǔ)。