鎘脅迫對刺槐幼苗生長與光合生理特性的影響

劉金秀 張松彥 周建

摘要：[目的]探究鎘脅迫對刺槐生長與光合生理特性的影響。[方法]以刺槐幼苗為研究對象，測定不同濃度鎘處理下刺槐生長、葉綠素含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)、呼吸速率和氣孔特性等。[結(jié)果]在鎘脅迫下，刺槐幼苗地徑、株高受到明顯抑制；高濃度處理植楝的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量下降，低濃度處理植株則略微上升，但均與對照差異不顯著。隨著鎘濃度增加，刺槐葉綠素a、葉綠素總量呈下降趨勢，而葉綠素b、類胡蘿卜素變化無規(guī)則，但與對照差異不顯著；初始熒光（F0）與最大熒光產(chǎn)量（Fm）先升后降，最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）逐步下降，非光化學(xué)淬滅系數(shù)（qN）逐步上升，實際光化學(xué)量子效率均低于對照值，但差異不顯著；脅迫植株氣孔寬度、氣孔面積降低，氣孔逐步閉合，呼吸效率受到顯著抑制；通過相關(guān)分析顯示．多數(shù)指標(biāo)之間顯著性相關(guān)；經(jīng)隨機森林回歸分析，初始熒光（Fo）、根系鎘含量、氣孔寬度和葉綠素a的重要性分別在葉綠索熒光參數(shù)、植株富集鎘含量、氣孔特性、光合色素中最強，成為影響刺槐光合功能的最關(guān)鍵因子。[結(jié)論]刺槐幼苗生長與光合生理受到一定影響，但仍表現(xiàn)出較強的鎘脅迫耐受性，可為鎘污染地區(qū)的園林應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞：鎘脅迫；刺槐；葉綠素；葉綠素?zé)晒?；氣?/p>

中圖分類號：S718.43 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1001-1498（2023）03-0168-11

土壤重金屬污染是我國當(dāng)前最突出的環(huán)境污染問題，2014年原環(huán)境保護部和原國土資源部聯(lián)合發(fā)表的《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》顯示，鎘的點位超標(biāo)率為7%。鎘（Cd）是毒性最強的重金屬之一，具有分解周期長、毒性大、難降解的特點，容易在植物中富集，可通過食物鏈進人人體，進而危害人類健康。針對土壤重金屬污染，植物修復(fù)技術(shù)具有成本低、對環(huán)境友好等優(yōu)勢，修復(fù)土壤的同時凈化空氣與水體，改善環(huán)境，成為了當(dāng)下研究熱點。目前，對于重金屬富集植物研究多限于草本植物，如魚腥草等，而草本植物因根系淺、生物量小對重金屬富集有一定的局限性。木本植物因其生物量大、生長周期長、根系發(fā)達等特征，日趨成為土壤重金屬污染修復(fù)的新方向。研究發(fā)現(xiàn)，在鎘脅迫中植物光合作用非常敏感，是鑒定植物對鎘耐受性的一種良好途徑。在鎘脅迫下，桑樹幼苗凈光合速率下降，抑制了光合作用過程中產(chǎn)物的輸送，最終導(dǎo)致桑樹幼苗植株矮小。

刺槐屬于豆科落葉喬木，因其耐旱、耐貧瘠、耐鉛鎘污染，同時具備生物量大、生長速度快、觀賞價值高等特點，是一種理想的環(huán)境污染修復(fù)樹種。本研究以刺槐為對象，研究不同濃度鎘處理對刺槐的幼苗生長、葉綠素含量、葉綠素?zé)晒馓匦?、呼吸速率及氣孔變化特性的影響，了解刺槐對鎘脅迫的耐受能力，并通過隨機森林回歸分析鎘脅迫對刺槐葉片光合生理的損傷途徑及刺槐幼苗對鎘脅迫的適應(yīng)機制，為進一步探索刺槐抗鎘機理提供依據(jù)，同時也為強化刺槐在鎘污染土壤修復(fù)中應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料與試驗設(shè)計

取腐葉土、蛭石、珍珠巖、普通園土按照1：1：1：3配制栽培土，其土壤理化性質(zhì)為：pH值6.3，總有機碳15.30 g·kg-1，全氮1.10 g·kg-1，速效磷為15.38 mg·kg-1。河南省土壤鎘含量背景值為0.06 mg·kg-1，本試驗從刺槐種子萌芽階段進行脅迫，植株個體較小，故設(shè)置0、5、10、20mg·kg-1等鎘濃度處理，每個處理設(shè)置3次重復(fù)，每次重復(fù)4缽。隨后在土壤中加入CdCl2，充分混合混勻。將混勻的供試土壤裝人栽培缽（口徑13cm，高度12 cm），每缽0.7 kg土壤。選取飽滿刺槐種子，浸泡24 h，待1/3種子露白后，播種于栽培缽，覆土0.5～1 cm，每缽5粒種子。其中，0、5、10、20 mg'kg叫等處理的發(fā)芽率分別為85.00%、76.67%、68.33%、85.00%。出苗后，每2周用1/4濃度的Hoagland營養(yǎng)液澆灌1次；將幼苗放置于溫室，室溫設(shè)置為白天28℃，晚間25℃。等幼苗發(fā)育5個月時取樣，測定相關(guān)指標(biāo)。

1.2測定指標(biāo)及方法

1.2.1生長指標(biāo)測定 從各處理中選取3盆中的3棵具有代表性的幼苗，用直尺測量幼苗株高，利用游標(biāo)卡尺測量莖粗，重復(fù)5次。用水沖洗植株并吸干水分，將幼苗放至烘箱內(nèi)，105℃殺青5 min，80℃恒溫處理10 h，烘至質(zhì)量不變后稱其干質(zhì)量，重復(fù)3次。

1.2.2鎘含量測定 稱取0.1 g干樣，放入聚四氟乙烯燒杯中，為了更好地消解植物依次加入10：5：3比例的硝酸·氫氟酸·高氯酸，并攪拌混合均勻；然后置于180℃的電熱板上進行消解3h，消解成黃豆粒大小時加入0.2%稀硝酸定容至刻度。采用Optima 2100 DV離子發(fā)光譜儀測定，3次重復(fù)。

1.2.3葉綠素含量測定 采用丙酮-無水乙醇提取法測定葉綠素、類胡蘿卜素含量。稱取新鮮葉片0 3 g左右，剪碎；將組織加入離心管的丙酮與乙醇混合溶液（V：V=2：1）中；用報紙包裹離心管，置于黑暗條件下14 h，直至組織變白。取上清液在可見分光光度計440、644、662 nm處比色，每組重復(fù)3次。

計算公式如下：

葉綠素a含量Ca=9.78×A662-0.99×A644

葉綠素b含量Cb=21.43×A644-4.65×A662

總?cè)~綠素含量Ca+b=5.13×A662+20.44×A644

類胡蘿卜素=4.7×A440-0.27×Ca+b

1.2.4葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定 采用便攜式Y(jié)axin-1161G葉綠素?zé)晒鈨x測定葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)。選取樣本植株中上部的全展葉，用葉片夾夾住葉片，暗處理20 min；隨后4 000 umol·m-2·s-1光強飽和脈沖處理1s，1 500 umol·m-2·s-1光化光處理9s，測得Fo、Fv/Fm、Fm、qN、PSII，每組重復(fù)3次。

1.2.5葉面氣孔觀測 現(xiàn)場剪取樣本中上部葉片，用打孔器取下樣品葉片，將葉片黏在含導(dǎo)電膠的樣品臺上，粘貼葉片時注意僅用鑷子小心按壓葉片四周，不要全葉按壓，以免破壞葉片的結(jié)構(gòu)。在QUANTA 250掃描電子顯微鏡下觀察葉面氣孔的形態(tài)，每組重復(fù)3次。用Imagej1.8.0定量軟件測定葉片氣孔長、寬度及面積，每張圖片重復(fù)測量3次。

1.2.6呼吸速率測定 采用Yaxin-1151雅欣生物氧儀測定葉片呼吸速率。從不同處理樣株上部取1 cm2葉片樣品，置入恒溫反應(yīng)室，反應(yīng)體系為8 mL去離子水與2 mL 5%Na2SO3；將攪拌子放人反應(yīng)室，以1200 r·min-1轉(zhuǎn)速攪拌3 min，隨后插入電極。遮蔽反應(yīng)室，暗處理2 min，即可進行呼吸速率測定，每組重復(fù)3次。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用Origin2018軟件制圖；用SPSS 23.0軟件進行單因素方差分析（P<0.05）；用Metabo Analyst5.0軟件包進行主成分分析、相關(guān)性分析及森林回歸分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同鎘含量對刺槐幼苗生長及生物量的影響

本試驗中，鎘脅迫植株的地徑與株高表現(xiàn)相似，隨著鎘濃度增加而逐步降低，并顯著低于對照（P<0.05），在20 mg·kg-1處理中，其地徑與株高最低，分別低于對照37.89%和16.39%9（圖1a、b）。此外，刺槐鮮質(zhì)量與干質(zhì)量表現(xiàn)相似（見圖1c、d），中高濃度處理植株的生物量低于對照植株，而5 mg·kg-1鎘處理植株的生物量最高，其鮮質(zhì)量與干質(zhì)量分別高于對照11.94%、18.57%，但差異均不顯著（P>0.05）。

2.2剌槐幼苗重金屬鎘含量

圖2表明：各處理刺槐幼苗的根系鎘含量均高于地上部，其鎘含量大小為根>葉>莖。隨著鎘處理濃度增加，刺槐幼苗根、葉、莖的鎘含量均逐步上升，其中，在20 mg·kg-1處理時達到最大值，相對于對照植株分別增加4.8、1.83、1.45倍且差異顯著（P<0.05）。

2.3不同鎘含量對刺槐幼苗葉片色素含量的影響

由圖3a、c可知：脅迫刺槐的葉綠素a、總?cè)~綠素含量表現(xiàn)相似，其含量隨鎘濃度增加而逐步降低，但與對照差異不顯著（P>0.05），其中，20mg·kg-1鎘處理植株的葉綠素a和總?cè)~綠素分別降低25.94%和20.21%。葉綠素b與類胡蘿卜素變化相似，隨鎘濃度增加，其含量先降后升，呈“v型變化（圖3b、d）．但與對照差異均不顯著（P>0.05），其中，10 mg·kg-1鎘處理植株含量最低，分別低于對照9.84%、17.18%。此外，葉綠素a/b值隨著鎘濃度的升高呈下降趨勢，在20mg·kg-1鎘處理中，其值顯著低于對照29.57%（P<0.05）（圖3e）。

2.4不同鎘含量對刺槐幼苗葉綠素?zé)晒獾挠绊?/p>

由圖4a、c、d可知：隨著鎘濃度的增加，刺槐葉片F(xiàn)o、Fm整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，但Fo變化趨勢明顯大于其他參數(shù)。在鎘濃度為10mg·kg-1時，刺欏葉片的Fo較CK增加了5.49%（P<0.05）；在鎘濃度為20 mg·kg-1時，葉片的Fm較CK減少了29.88%（P<0.05）；不同處理下刺槐葉片qN無顯著變化（P>0.05）。Fv/Fm與中PSII變化相似，隨著鎘濃度的增加，其值呈現(xiàn)下降趨勢（圖4b、e），PSII與對照無顯著差異（P>0.05），在鎘濃度5 mg·kg-1時植株含量最低，低于對照12.53%；而Fv/Fm在鎘濃度20 mg·kg-1時，其值顯著低于對照11.18%（P<0.05）。

2.5不同鎘含量對刺槐幼苗氣孔變化的影響

由表1、圖5可知：從鎘處理后刺槐的氣孔特征看，表面存在較多氣孔、凹凸不平等。隨著鎘濃度的增加，刺槐葉面氣孔長度與面積表現(xiàn)相似，均呈先升高后降低趨勢，葉面氣孔長度和氣孔面積在鎘濃度5 mg·kg-1時最大，與其他處理差異顯著（P<0.05），其中，在鎘濃度10 mg·kg-1和20mg·kg-1時，葉面氣孔長度和氣孔面積分別較CK降低了2.93%、55.18%、21.84%和61.10%。葉面氣孔寬度隨著鎘濃度的增加呈現(xiàn)下降趨勢，在鎘濃度10 mg·kg-1和20 mg·kg-1時，均比CK顯著降低了54.58%（P<0.05）。

2.6不同鎘含量對刺槐幼苗呼吸速率的影響

由圖6可知：與CK相比，隨著鎘濃度的變化都不同程度地降低了刺槐幼苗葉片的呼吸速率，呼吸速率與鎘濃度呈負相關(guān)；其各處理與對照均差異顯著（P<0.05），在鎘濃度10 mg·kg-1時對呼吸速率的影響最大，與對照相比降低了40.00%，但鎘濃度處理之間呼吸速率無明顯差異（P>0.05）。

2.7刺槐幼苗各指標(biāo)之間的相關(guān)性分析、主成分分析及隨機森林回歸分析

利用主成分分析進一步探究了Cd脅迫對刺槐幼苗生長與光合生理特性的影響。由表2可知：PC1占據(jù)了總方差的29.9%，PC2占據(jù)了總方差的26.8%。4個處理（CK、Cd5、Cd10、Cd20）被PC2顯著分離，其中，CK、Cd20處理與其他處理顯著分離（圖7a）。

由隨機森林回歸結(jié)果可知：對于刺槐幼苗葉綠素含量來說，Chla的平均精度值最高；對于刺槐幼苗葉綠素?zé)晒鈦碚f，初始熒光（Fo）的平均精度值最高；對于葉面氣孔來說，氣孔寬度的平均精度值最高；對于植株鎘含量來說，其根系鎘含量的平均精度值最高（圖7b）。

根據(jù)相關(guān)性分析結(jié)果（圖8a、b）可知：其干質(zhì)量和Chlb、Tchl、Chla/Chlb以及氣孔長度呈顯著正相關(guān)（P<0.05），與氣孔面積、氣孔寬度、類胡蘿卜素呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）；最大光化學(xué)效率（FJFm）與刺槐幼苗的株高、地徑、鮮質(zhì)量、呼吸速率呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）。

3討論

3.1不同質(zhì)量濃度的鎘處理對刺槐幼苗生長的影響

作為毒性最強的重金屬元素之一，鎘濃度較低時就可以引起植物中毒，常見癥狀為生長速率降低。本試驗中，隨著Cd脅迫增強，刺槐幼苗株高及地徑都受到明顯的抑制作用，表明在較高含量鎘脅迫下刺槐幼苗受到一定程度的毒害作用。可能是隨著Cd2+進入植物細胞，破壞細胞結(jié)構(gòu)，阻礙植株細胞分裂和伸長，抑制了植物細胞分裂及Cd2+與植物生長中的關(guān)鍵酶、含氮和硫基團及蛋白中心巰基結(jié)合，導(dǎo)致硫代巴比妥酸反應(yīng)物過量堆積以及生物大分子損傷而抑制生長發(fā)育。這與鎘脅迫下紫花地丁、巨桉等幼苗變化規(guī)律相似。然而，本試驗中，低濃度Cd脅迫植株的干質(zhì)量和鮮質(zhì)量略微上升，而中高濃度鎘脅迫植株則低于對照，但差異不顯著，表明刺槐脅迫植株的光合功能與有機物積累沒有受到明顯影響，也體現(xiàn)出刺槐植株對鎘脅迫具有較強的耐受性，這與巨桉結(jié)果一致。在本試驗中，20mg·kg-1鎘處理下刺槐根、葉的鎘濃度分別為26.80、7.21 ug·g-1；而常用修復(fù)植物一一火炬樹在25 mg·kg-1鎘處理下，其根、葉鎘濃度為15.05、0.33 ug·g-1，表明刺槐具有較強的鎘富集能力。根據(jù)隨機森林回歸分析，刺槐根部鎘含量的平均精度值最高，表明根中鎘的重要性最強，對植株生長的影響程度大于葉與莖中的鎘。應(yīng)該是刺槐幼苗在逆境環(huán)境中，根系吸收的鎘通過共質(zhì)體和原生質(zhì)體途徑到達木質(zhì)部，運輸?shù)降厣喜糠?，對地上部分造成鎘毒害，影響地上部分生物量的積累；在較低濃度鎘脅迫下，地下部可能由于Cd2+刺激根細胞壁中交換位點而排斥Cd2+，從而促進地下部的生長，這與脅迫環(huán)境中植物改變其生物量的分配方式，將其資源分配到不同器官以達到適應(yīng)逆境環(huán)境。

3.2不同鎘處理質(zhì)量濃度對刺槐幼苗光合指標(biāo)的影響

光合色素是光合作用所必需的物質(zhì)，其含量高低影響著植物的有機合成，葉片光合色素含量也直接反映了植物的生長狀態(tài)。相關(guān)試驗證明，重金屬脅迫影響葉片光合色素含量和捕光色素分子數(shù)，從而抑制植物光合作用。在本試驗中，鎘脅迫刺槐幼苗的葉綠素a與葉綠素總量隨著鎘濃度升高均呈下降趨勢，這與巨桉等植物研究結(jié)果相似。葉綠素下降可能是鎘離子進入植株體內(nèi)后，抑制了植物細胞的正常分裂；同時增加了葉綠素降解酶活性，降低參與葉綠素生物合成的6-氨基乙酰丙酸生物合成和原葉綠索還原酶復(fù)合物，導(dǎo)致葉綠素合成降低。相關(guān)研究表明，光合強度與葉綠素a/b值密切相關(guān)。本試驗中，鎘處理下葉綠素a下降趨勢明顯強于葉綠素b，其葉綠素a/b值隨著鎘濃度增加呈降低趨勢。根據(jù)隨機森林回歸發(fā)現(xiàn)，其刺槐葉綠素a的精度值最高，表明葉綠素a是影響光合作用的關(guān)鍵因子。說明刺槐葉綠素總量降低主要是葉綠素a合成受到抑制，進而影響刺槐光能利用能力。然而，各處理組植株的葉綠素含量與對照植株差異不顯著，表明對刺槐光能利用能力的影響不明顯，進而反應(yīng)出刺槐對鎘脅迫的強耐受能力。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)可反應(yīng)植物光合系統(tǒng)Ⅱ特性及其對光能的利用能力，進而可體現(xiàn)外界逆境對PⅡ產(chǎn)生的危害。隨機森林回歸結(jié)果顯示，葉綠素?zé)晒庵蠪o精度值最大，表明脅迫過程中初始熒光Fo重要性在葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)中最強，表明PSⅡ反應(yīng)中心的損害程度是影響刺槐光合功能的最關(guān)鍵因子。初始熒光Fo表示的是光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）反應(yīng)中心處于完全開放時的熒光產(chǎn)量。本試驗中，鎘脅迫刺槐Fo增加，表明刺槐葉片PSⅡ天線色素吸收的能量流向光化學(xué)的部分減少，以熒光形式等散失的能量增加，隨著濃度的增加，破壞程度越高。因而，鎘脅迫導(dǎo)致刺槐PSⅡ反應(yīng)中心受損，影響到光量子捕捉與光反應(yīng)鏈中電子傳遞，從而降低脅迫植株的PSⅡ光能轉(zhuǎn)化與光合能力，使得刺槐葉片的光合效率變低，這與Fv/Fm值逐步下降一致。Fv/Fm下降反應(yīng)出PSII反應(yīng)中心受損，大部分激化能以熱能形式耗散或光合電子傳遞受阻。過剩激化能壓力是損傷PSII的關(guān)鍵因素；而qN反映出激化能以熱形式耗散的情況，與葉黃素循環(huán)途徑密切相關(guān)。熱耗散可以避免過剩激化能對PSII的損傷。在本試驗中，鎘脅迫刺槐qN逐步增加，表明激化能通過熱耗散途徑消耗的比例上升，進而緩解了激化能對PSII的壓力?？傊k脅迫降低了刺槐光系統(tǒng)對光能捕獲效率，抑制其光化學(xué)效率，這與鎘脅迫下龍葵、頓橘等表現(xiàn)相似。

3.3不同鎘處理質(zhì)量濃度對剌槐幼苗氣孔特性的影響

氣孔是植物與環(huán)境進行水分與氣體交換的重要門戶，其孔徑大小直接影響植物光合作用，也與其他生理過程密切相關(guān)，如蒸騰、呼吸作用等生理過程，而氣孔特征也常作為一種指標(biāo)來闡明植物在逆境中的適應(yīng)性對策。隨機森林分析結(jié)果顯示，氣孔寬度的重要性在氣孔特征中最強，表明氣孔閉合程度是影響刺槐葉片水分與氣體交換的關(guān)鍵因子。在本試驗中，鎘脅迫使得葉片氣孔逐步閉合，水氣交換能力與氣孔導(dǎo)度逐步減弱，進而葉面通氣性變差抑制刺槐光合作用，從而影響植株有機物積累，這與刺槐鮮質(zhì)量、干質(zhì)量及最大光化學(xué)效率的結(jié)果一致。然而，在低濃度鎘處理中，刺槐氣孔面積大于對照，這可能是因為鎘對植物脅迫程度較弱，引起細胞膨脹，氣孔阻力減小，蒸騰速率增大，將會增強水氣交換能力與光合效率，促進刺槐有機物合成與生物量積累，這應(yīng)該是刺槐對Cd脅迫的適應(yīng)機制。當(dāng)脅迫濃度超過一定范圍后，植物耐性減弱，其細胞氣孔阻力增大甚至關(guān)閉，從而限制外界CO2進入葉肉細胞，導(dǎo)致細胞胞間CO2濃度降低，即氣孔對光合產(chǎn)生限制。

4結(jié)論

鎘脅迫抑制刺槐幼苗株高、地徑生長，但對生物量積累影響不大；影響葉綠素合成，導(dǎo)致光化學(xué)反應(yīng)減弱，熱耗散增強，但程度不明顯；降低刺槐呼吸強度，逐步閉合葉片氣孔，表明刺槐幼苗生長與光合生理受到一定影響，但刺槐仍表現(xiàn)出較強的鎘脅迫耐受性，雖然與其他超積累植物存在差距，但其根表現(xiàn)出較強的鎘積累能力，在鎘污染土壤植物修復(fù)中具有較好的應(yīng)用潛力。