桂糖42號胚性愈傷組織高效誘導及相關內源激素的動態(tài)變化

秦翠鮮 廖芬 潘有強 陳忠良

摘 要：以優(yōu)良甘蔗品種桂糖42號心葉為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，探究不同濃度2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）及營養(yǎng)成分［水解酪蛋白（CH）和椰汁（CW）］對甘蔗胚性愈傷組織誘導效果的影響，優(yōu)化甘蔗胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基；測定誘導胚性愈傷組織發(fā)生過程中不同組織樣品的4種激素［玉米素核苷（ZR）、赤霉素（GA3）、生長素（IAA）和脫落酸（ABA）］含量。結果表明，甘蔗心葉在添加3.0 mg/L 2，4-D的MS培養(yǎng)基中其愈傷組織誘導率達93.33%，第一代愈傷組織轉接于添加3.0 mg/L 2，4-D和100.0 mL/L CW的MS培養(yǎng)基，其胚性愈傷組織誘導率達83.33%；在甘蔗胚性愈傷組織誘導過程中，內源激素ZR和GA3含量呈下降趨勢，IAA和ABA含量呈上升趨勢，胚性愈傷組織與非胚性愈傷組織間的4種激素含量均存在顯著差異（P<0.05），其中，胚性愈傷組織的GA3含量是非胚性愈傷組織的1.77倍。本研究將甘蔗愈傷組織誘導培養(yǎng)基優(yōu)化為MS+3.0 mg/L 2，4-D，繼代培養(yǎng)基優(yōu)化為MS+3.0 mg/L 2，4-D+100.0 mL/L CW，并初步揭示甘蔗胚性愈傷組織誘導過程中內源激素含量的變化規(guī)律，可作為甘蔗優(yōu)質胚性愈傷組織培養(yǎng)的參考依據。

關鍵詞：甘蔗；胚性愈傷組織；2，4-D；營養(yǎng)成分；內源激素

中圖分類號：S566.1? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A 文章編號：2095-820X（2023）06-0001-09

收稿日期：2023-10-02

基金項目：廣西自然科學基金項目（2020GXNSFBA297030，2018GXNSFAA138151，2023GXNSFAA026405）；廣西農業(yè)科學院科技發(fā)展基金項目（桂農科2022JM14）

通訊作者：陳忠良（1984-），男，副研究員，主要從事甘蔗分子育種研究工作，E-mail：czl_good2007@126.com

第一作者：秦翠鮮（1984-），女，副研究員，主要從事甘蔗分子育種研究工作，E-mail：qincuixian@126.com

0 引言

甘蔗（Saccharum officinarum L.）是我國最重要的糖料作物，蔗糖產量占全國食糖總產量的90%以上，其中，廣西的蔗糖產量占全國的65%以上，對廣西乃至我國的經濟發(fā)展發(fā)揮了重要作用。甘蔗是高度雜合的非整倍性異源多倍體植物，遺傳背景相當復雜［1］，利用傳統(tǒng)雜交育種方法從有性雜交到良種育成周期長、成效低，一般育成一個品種約需10年時間［2］。轉基因輔助育種可縮短育種年限，有效提高育種效率，其中，在甘蔗遺傳轉化中主要采用農桿菌介導法和基因槍轟擊法，目前已獲得抗蟲［3］、抗病［4］、抗除草劑［5］、抗逆［6］和高糖［7］等轉基因甘蔗材料或品種（品系）。根據已發(fā)表的甘蔗轉基因相關論文，農桿菌介導法和基因槍轟擊法轉化的受體多數為胚性愈傷組織，因而獲得良好的胚性愈傷組織是遺傳轉化成功的最基本保障［3-7］。前人已在甘蔗愈傷組織培養(yǎng)技術、組織培養(yǎng)特性、愈傷組織細胞學觀察和代謝組學分析等方面開展了研究。在培養(yǎng)技術優(yōu)化方面，Kona等［8］、岑秀芬等［9］研究認為，添加不同種類激素、調整激素濃度可獲得優(yōu)化的培養(yǎng)基。在組織培養(yǎng)特性方面，譚志勇等［10］、梁計南等［11］研究表明，對不同基因型甘蔗進行組織培養(yǎng)，其愈傷組織誘導率、外植體褐化率和愈傷組織增殖率等存在明顯差異。在愈傷組織細胞學觀察方面，林慶良等［12］研究發(fā)現，甘蔗胚性愈傷組織來源于切口部位、維管束鞘、韌皮部及具有活力潛能的外皮層薄壁細胞，這種愈傷組織具有產生胚狀體能力，可通過體胚發(fā)生途徑再生植株。也有研究表明，非胚性愈傷組織是具有分生能力的一團不規(guī)則細胞，可通過器官發(fā)生途徑形成芽或根［13］。在代謝組學分析方面，Mahmud等［14］基于核磁共振代謝組學技術分析指出，甘蔗胚性愈傷組織體細胞中的葡萄糖、果糖、蔗糖和丙氨酸濃度相對較高，非胚性愈傷組織中天冬酰胺、谷氨酰胺、賴氨酸、2-羥基異丁酸酯和膽堿濃度較高。此外，植物激素在愈傷組織誘導及分化的生理活動過程中發(fā)揮著非常重要的調控作用［15］。肖關麗等［16］分析發(fā)現，甘蔗愈傷組織在分化成綠苗過程中內源激素發(fā)生了一系列變化，尤其是當胚性細胞大量發(fā)生時，生長素（IAA）合成達到峰值。但目前鮮見有關甘蔗胚性愈傷組織誘導過程中內源激素動態(tài)變化的研究報道。本研究以桂糖42號為試驗材料，以MS為基本培養(yǎng)基，探究添加不同濃度2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）及營養(yǎng)成分對其胚性愈傷組織誘導效果的影響，進而優(yōu)化甘蔗胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基，培養(yǎng)優(yōu)質胚性愈傷組織，并測定甘蔗愈傷組織和分化苗葉片的玉米素核苷（ZR）、赤霉素（GA3）、IAA和脫落酸（ABA）含量，旨在為甘蔗的遺傳轉化提供優(yōu)質胚性愈傷材料，為初步解析植物激素對甘蔗胚性愈傷組織誘導過程的調控作用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

桂糖42號具有高產高糖、宿根性好和適應性廣等特點，是當前廣西的主栽甘蔗品種，由廣西農業(yè)科學院甘蔗研究所選育提供，種植于廣西農業(yè)科學院甘蔗研究所試驗溫室。于2020年3月31日采集生長健壯的甘蔗植株，剝掉葉片，留取約30.0 cm的尾梢?guī)Щ貙嶒炇?，以其幼嫩心葉為外植體誘導愈傷組織。于2020年4月7日和15日分別采集在3.0 mg/L 2，4-D+MS培養(yǎng)基上誘導的愈傷組織，切碎混勻后分成3份，備用；于2020年4月29日分別采集在3.0 mg/L 2，4-D+100.0 mL/L椰汁（CW）+MS培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)后誘導的胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織，切碎混勻后分成3份，備用；于2020年6月17日分別采集胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織分化的甘蔗幼苗葉片，切碎混勻后分成3份，備用。

主要儀器和試劑：Rigol L3000高效液相色譜儀（北京普源精儀科技有限責任公司）、激素提取試劑（甲醇、乙酸、石油醚和乙酸乙酯等均為分析純級）、超純水（UP H2O）。

1.2 試驗方法

1.2.1 甘蔗外植體接種

用75%乙醇消毒甘蔗植株尾梢表面，剝除4～5層外葉鞘后置于超凈工作臺內，取距頂端生長點約10.0 cm的幼嫩心葉作為外植體，切成厚約0.2 mm的薄片接種于愈傷組織誘導培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)皿接種10塊外植體。

1.2.2 不同濃度2，4-D對甘蔗愈傷組織的誘導和繼代培養(yǎng)效果

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加30.0 g/L蔗糖，6.0 g/L瓊脂，pH 5.8，設添加0、1.0、2.0、3.0和4.0 mg/L 2，4-D處理（分別為Y1、Y2、Y3、Y4和Y5處理），每處理接種270塊外植體，3個重復。于27 ℃暗培養(yǎng)15～20 d誘導第一代愈傷組織，統(tǒng)計和記錄外植體污染率、褐化率和愈傷組織誘導率等，分析不同濃度2，4-D對甘蔗愈傷組織的誘導效果。

外植體愈傷組織誘導率（%）＝產生愈傷組織外植體數/接種外植體數×100

外植體褐化率（%）＝外植體褐化數/接種外植體數×100

外植體污染率（%）＝外植體污染數/接種外植體數×100

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加30.0 g/L蔗糖，6.0 g/L瓊脂，pH 5.8，設添加0、1.0、2.0、3.0和4.0 mg/L 2，4-D處理，每處理接種180塊愈傷組織進行繼代培養(yǎng)（分別為J1、J2、J3、J4和J5處理），3個重復。于27 ℃暗培養(yǎng)15～20 d，統(tǒng)計和記錄愈傷組織的污染率、褐化率和胚性愈傷組織誘導率等，分析不同濃度2，4-D對甘蔗愈傷組織的繼代培養(yǎng)效果。

胚性愈傷組織誘導率（%）＝產生胚性愈傷組織愈傷數/接種愈傷數×100

愈傷組織褐化率（%）＝愈傷褐化數/接種愈傷數×100

愈傷組織污染率（%）＝愈傷污染數/接種愈傷數×100

1.2.3 不同營養(yǎng)成分對甘蔗愈傷組織的誘導效果

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加30.0 g/L蔗糖，6.0 g/L瓊脂，3.0 mg/L 2，4-D，pH 5.8。設添加0.5 g/L水解酪蛋白（CH）、100.0 mL/L CW和100.0 mL/L CW+0.5 g/L CH處理（分別為YY2、YY3和YY4處理），以不添加營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基為對照（YY1處理）。每處理接種270塊外植體，3個重復。于27 ℃暗培養(yǎng)15～20 d誘導第一代愈傷組織，統(tǒng)計和記錄外植體污染率、外植體褐化率、愈傷組織誘導率等，分析不同營養(yǎng)成分對甘蔗愈傷組織的誘導效果。

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加30.0 g/L蔗糖，6.0 g/L瓊脂，3.0 mg/L 2，4-D，pH 5.8，設不添加營養(yǎng)成分、0.5 g/L CH、100.0 mL/L CW、100.0 mL/L CW+0.5 g/L CH處理（分別為YYJ1、YYJ2、YYJ3和YYJ4處理）。每處理接種180塊愈傷組織進行繼代培養(yǎng)獲取胚性愈傷組織，3個重復。于27 ℃暗培養(yǎng)15～20 d，統(tǒng)計和記錄污染率、褐化率和胚性愈傷組織誘導率等，分析不同營養(yǎng)成分對甘蔗愈傷組織的繼代培養(yǎng)效果。

1.2.4 愈傷組織中的內源激素含量測定

采用高效液相色譜（HPLC）技術，分別測定3.0 mg/L 2，4-D處理外植體培養(yǎng)7和15 d時愈傷組織、胚性愈傷組織、非胚性愈傷組織、胚性愈傷組織分化苗和非胚性愈傷組織分化苗的ZR、GA3、IAA和ABA等4種植物內源激素含量。參考高欣欣等［17］的方法進行激素提取和計算樣品的內源激素含量。

1.3 統(tǒng)計分析

試驗數據采用Excel 2007進行處理，以DPS v16.05進行方差分析，以Duncans新復極差法進行差異顯著性檢驗，以GraphPad Prism 8.0.2制圖。

2 結果與分析

2.1 不同濃度2，4-D對甘蔗愈傷組織的誘導效果

在外植體培養(yǎng)的第15 d，各處理均有外植體膨大，能誘導出水漬狀甘蔗愈傷組織（圖1），經繼代培養(yǎng)15 d，均產生胚性愈傷組織（圖2）。由表1可知，Y1處理的愈傷組織誘導率為6.30%，極顯著低于Y2～Y5處理（P<0.01，下同），外植體褐化率達90.00%，極顯著高于Y2～Y5處理；Y2和Y3處理的外植體愈傷組織誘導率均高于75.00%，但Y2處理的外植體褐化率（22.59%）顯著高于Y3處理（5.93%）（P<0.05，下同）；Y4處理的外植體愈傷組織誘導率最高，Y5處理次之，分別為93.33%和89.63%，但Y5處理的外植體褐化率顯著高于Y4處理。說明不同濃度2，4-D對甘蔗愈傷組織的誘導效果差異明顯，以3.0 mg/L 2，4-D的誘導效果較佳。

由表2可知，繼代培養(yǎng)第15 d時，J1處理的胚性愈傷組織誘導率為0，愈傷組織褐化率和污染率均極顯著高于其他處理；J2、J3和J5處理的胚性愈傷組織誘導率分別為60.00%、59.44%和63.89%，褐化率和污染率均較低，且三者間均無顯著差異（P>0.05，下同）；J4處理的胚性愈傷組織誘導率最高，為71.11%，顯著或極顯著高于J2、J3和J5處理，且褐化率低，無污染。說明不同濃度2，4-D對甘蔗愈傷組織的繼代培養(yǎng)效果也存在差異，總體上以3.0 mg/L 2，4-D的誘導效果較佳。

2.2 培養(yǎng)基中添加不同營養(yǎng)成分對甘蔗愈傷組織的誘導效果

以MS為基本培養(yǎng)基，在添加3.0 mg/L 2，4-D的基礎上，再分別添加不同營養(yǎng)成分進行甘蔗外植體愈傷組織誘導培養(yǎng)，培養(yǎng)第15 d誘導的甘蔗愈傷組織見圖3。由表3可知，添加0.5 g/L CH和添加0.5 g/L CH+100.0 mL/L CW處理的愈傷組織誘導率均低于60.00%，且污染率和褐化率相對較高；添加100.0 mL/L CW處理的愈傷組織誘導率達83.70%，顯著高于添加另外2種營養(yǎng)成分的處理，污染率和褐化率也相對較低；培養(yǎng)基中不添加營養(yǎng)成分，其愈傷組織污染率、褐化率和愈傷組織誘導率均最佳。

挑選誘導的第一代愈傷組織進行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)15 d的愈傷組織繼代培養(yǎng)結果見圖4。由表4可知，添加3.0 mg/L 2，4-D和100.0 mL/L CW處理的胚性愈傷組織誘導率最高，達83.33%，顯著高于其他處理，且污染率和褐化率較低，繼代培養(yǎng)獲得了遺傳轉化所需的干燥、致密、淡黃色優(yōu)良胚性愈傷組織材料。

綜上所述，在MS培養(yǎng)基中添加0.5 g/L CH或0.5 g/L CH+100.0 mL/L CW，會降低甘蔗外植體愈傷組織及胚性愈傷組織的誘導率，而添加100.0 mL/L CW的甘蔗外植體愈傷組織誘導率雖有所降低，但胚性愈傷組織誘導率得到提高。

2.3 甘蔗胚性愈傷組織誘導過程中內源激素的動態(tài)變化

圖5-A和圖5-B分別為外植體培養(yǎng)7和15 d時的愈傷組織，圖5-C和圖5-D分別為繼代培養(yǎng)15 d的胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織，圖5-E和圖5-F分別為胚性愈傷組織分化苗和非胚性愈傷組織分化苗。從圖6-A可看出，隨著愈傷組織的不斷誘導，不同愈傷組織中ZR含量呈下降趨勢，但維持在較高水平。其中，分化苗的ZR含量顯著高于愈傷組織的ZR含量；非胚性愈傷組織的ZR含量最低，為327.50 ng/gFW；分化苗的ZR含量最高，超過460.00 ng/gFW；胚性愈傷組織的ZR含量與非胚性愈傷組織差異顯著，其分化苗的ZR含量差異不顯著。從圖6-B可看出，愈傷組織的GA3含量逐漸降低，分化苗的GA3含量呈升高趨勢；非胚性愈傷組織分化苗的GA3含量最高，為750.00 ng/gFW，非胚性愈傷組織的GA3含量最低，為144.80 ng/gFW；誘導過程中不同時期不同樣品間的GA3含量差異均達極顯著水平，其中，胚性愈傷組織的GA3含量是非胚性愈傷組織GA3含量的1.77倍。從圖6-C和圖6-D可看出，在不同誘導時期，愈傷組織和分化苗的IAA和ABA含量呈緩慢上升再下降變化趨勢，均以胚性愈傷組織的IAA和ABA含量（695.70和409.10 ng/gFW）極顯著高于分化苗；胚性愈傷組織的IAA和ABA含量均極顯著高于非胚性愈傷組織。

綜上所述，在甘蔗愈傷組織誘導—胚性愈傷組織誘導—幼苗分化過程中，愈傷組織和葉片的GA3含量波動變化較大，不同時期、不同樣品間差異顯著；ZR和IAA含量表現為在大部分樣品間差異顯著；胚性愈傷組織的ABA含量與其他樣品的ABA含量差異顯著；在甘蔗胚性愈傷組織誘導過程中，ZR和GA3含量呈下降趨勢，IAA和ABA含量呈現上升趨勢?？梢?，甘蔗胚性愈傷組織誘導動態(tài)與上述內源激素代謝水平密切相關，但不同內源激素的調控作用存在差異。

3 討論

在甘蔗愈傷組織培養(yǎng)中，2，4-D是誘導愈傷組織產生的最重要激素，培養(yǎng)基中沒有2，4-D則無法形成愈傷組織［18，19］。在0～3.0 mg/L范圍內，甘蔗愈傷組織誘導率隨著2，4-D濃度的增加而提高［10］，濃度過高（4.0 mg/L）誘導率反而下降［15］。本研究結果與上述研究結果一致，培養(yǎng)基中2，4-D濃度為0時未能誘導出胚性愈傷組織；在0～3.0 mg/L范圍內，隨著2，4-D濃度的升高，甘蔗胚性愈傷組織誘導率不斷提高；當2，4-D濃度為4.0 mg/L時胚性愈傷組織誘導率降低，說明一定濃度的2，4-D能促進甘蔗胚性愈傷組織產生；2，4-D濃度為3.0 mg/L時最有利于桂糖42號愈傷組織誘導，誘導率為93.33%，與劉紅堅等［20］對桂糖48號的研究結果一致，而梁巧玲和趙鸝［21］的研究結果為2.5 mg/L 2，4-D對粵糖95-168愈傷組織的誘導率最高，陳月桂等［22］的研究結果為1.0 mg/L 2，4-D對粵糖03-373愈傷組織的誘導效果最佳，說明適宜誘導甘蔗愈傷組織的2，4-D濃度因甘蔗基因型不同存在差異。

以CH為有機氮源附加在MS培養(yǎng)基中進行植物組織培養(yǎng)，對愈傷組織的誘導具有明顯影響。查夫拉［23］研究認為，培養(yǎng)基中適宜誘導植物愈傷組織的CH含量為0.10～1.00 g/L。付鳳玲等［24］研究發(fā)現，在玉米幼穗愈傷組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基中添加0.10～0.50 g/L CH可提高胚性愈傷組織誘導率。本研究結果與上述研究結果不一致，培養(yǎng)基中添加CH會降低甘蔗愈傷組織誘導率。因此，CH在甘蔗愈傷組織誘導中的作用還需進一步探討。CW已作為天然有機物被廣泛應用于曼陀羅［25］、文心蘭［26］、白及［27］、甘蔗［28］和藏紅花［29］等植物的組織培養(yǎng)。已有研究表明，在甘蔗愈傷組織分化階段添加椰乳可提高愈傷組織分化率，在幼苗生根階段添加椰乳可促使生根苗增粗變壯［30］，椰乳具有保護藏紅花愈傷組織的作用［31］。本研究在確定2，4-D最佳濃度（3.0 mg/L）的基礎上，在MS培養(yǎng)基中添加100.0 mL/L CW，甘蔗胚性愈傷誘導率達83.33%，比未添加CW的誘導率提高12.22%，說明培養(yǎng)基中添加CW能有效促進甘蔗胚性愈傷組織形成。

植物內源激素在愈傷組織形成過程中發(fā)揮著極其重要的調控作用。前人研究結果表明，培養(yǎng)基中ABA含量過高不利于水稻愈傷組織誘導，但在愈傷繼代培養(yǎng)時適當升高ABA含量有利于水稻胚性愈傷組織形成［15］；高含量的IAA、ZR和GA3有利于黃姜胚性細胞形成［30］；在玉米胚性愈傷組織開始發(fā)生時，ABA和IAA含量出現峰值，GA3含量出現低谷［24］；在甘蔗愈傷組織分化過程中，IAA的強烈合成與胚性細胞的發(fā)生密切相關［16］。本研究結果表明，在甘蔗愈傷組織誘導—胚性愈傷組織誘導—幼苗分化過程中，內源激素含量波動變化較大，其中，胚性愈傷組織的IAA和ABA含量分別為695.70和409.10 ng/gFW，均為最高值，而胚性愈傷組織的IAA和ABA含量與非胚性愈傷組織存在顯著差異?？傮w而言，在甘蔗胚性愈傷組織誘導過程中，內源激素ZR和GA3含量呈下降趨勢，IAA和ABA含量呈上升趨勢，與前人對水稻和玉米的研究結果基本一致［15，16］。說明甘蔗胚性愈傷組織誘導動態(tài)與上述植物內源激素代謝水平密切相關，但不同內源激素的調控作用存在差異。

4 結論

以甘蔗心葉為外植體進行愈傷組織誘導，其培養(yǎng)基優(yōu)化為MS+3.0 mg/L 2，4-D，繼代培養(yǎng)基優(yōu)化為MS+3.0 mg/L 2，4-D+100.0 mL/L CW；在甘蔗胚性愈傷組織誘導過程中，ZR和GA3含量呈下降趨勢，IAA和ABA含量呈上升趨勢，胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織間的ZR、GA3、IAA和ABA含量存在顯著差異；甘蔗胚性愈傷組織誘導動態(tài)與內源激素代謝水平密切相關，但不同激素的調控作用存在差異。

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（責任編輯 思利華）