基于HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的落花生枝葉藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

李新曄 ，孔富康 ，張彤 ，浦益瓊，

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海 201203； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，上海 201203

落花生枝葉為豆科植物落花生Arachis hypogaeaL.的干燥地上部分，在我國多數(shù)地區(qū)均有種植，資源豐富[1]。該藥具有清熱解毒、寧神降壓功效，研究表明其有鎮(zhèn)靜催眠、降血壓、止血、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、調(diào)節(jié)血糖、抗氧化等藥理作用[2-5]，主治跌打損傷、癰腫瘡毒、失眠、高血壓，臨床用于落花安神合劑、欣夢(mèng)安神顆粒和花丹安神合劑等復(fù)方制劑中治療失眠[6-8]，療效顯著且無明顯不良反應(yīng)、毒性或依賴性。落花生枝葉成分復(fù)雜，主要包括萜、黃酮、苷、甾醇、酚酸和脂肪酸等類化學(xué)成分[9-14]。文獻(xiàn)表明，在對(duì)氯苯丙氨酸小鼠失眠模型中，阿魏酸可顯著延長(zhǎng)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的睡眠時(shí)間、縮短睡眠潛伏期、提高睡眠率[15]，酚酸類成分具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛作用，是改善睡眠的主要活性成分[16-17]。

目前該中藥品種尚未被《中華人民共和國藥典》收錄，僅在1993年版《河南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[18]、2009年版《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[19]、2018年版《寧夏中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[20]等地方標(biāo)準(zhǔn)有記載，且上述標(biāo)準(zhǔn)中均無含量測(cè)定項(xiàng)目規(guī)定，使落花生枝葉的質(zhì)量控制較困難。指紋圖譜結(jié)合模式識(shí)別方法能真實(shí)、形象地反映中藥質(zhì)量差異，揭示復(fù)雜化合物之間的規(guī)律，已被逐漸應(yīng)用于藥物的質(zhì)量控制、差異標(biāo)志物的篩選等中藥質(zhì)量研究中，為相關(guān)中藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供了有效策略[21-23]。因此，本研究收集多產(chǎn)地的落花生枝葉藥材，建立HPLC指紋圖譜，有效分離色譜峰，指認(rèn)其化學(xué)成分，同時(shí)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析，篩選出引起產(chǎn)地差異的標(biāo)志性成分，以期為落花生枝葉藥材資源的開發(fā)利用及質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

對(duì)照品單咖啡酰酒石酸（批號(hào)JOT-10951，含量以98.59%計(jì)），成都普菲德生物技術(shù)有限公司；原兒茶酸（批號(hào)ST04100120，含量以98%計(jì)）、菊苣酸（批號(hào)ST01970120，含量以98%計(jì)），上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)公司；對(duì)香豆酸（批號(hào)112037-201801，含量以99.3%計(jì)）、咖啡酸（批號(hào)110885-201703，含量以99.7%計(jì)）、阿魏酸（批號(hào)110773-201915，含量以99.4%計(jì)），中國食品藥品檢定研究院；HPLC級(jí)甲醇，德國Merck公司；其他試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；純凈水，自制。27批落花生枝葉藥材均為自采，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院張紅梅博士鑒定為豆科植物落花生Arachis hypogaeaL.的干燥地上部分。樣品來源信息見表1。

表1 27批落花生枝葉樣品來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用ZORBAX Eclipse XBD-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇（A）-0.5%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～30 min，8%→15%A；30～36 min，15%A；36～83 min，15A%→29%A；83～105 min，29%A），檢測(cè)波長(zhǎng)0～16 min為260 nm、16～120 min為310 nm，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 混合對(duì)照品溶液制備

分別精密稱取原兒茶酸、單咖啡酰酒石酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸和菊苣酸對(duì)照品適量于5 mL容量瓶中，加50%甲醇水溶解并稀釋至刻度，制得各對(duì)照品母液；再精密吸取6種對(duì)照品母液適量，加50%甲醇水稀釋，制得原兒茶酸為30.31 μg/mL、單咖啡酰酒石酸為121.76 μg/mL、咖啡酸為35.43 μg/mL、對(duì)香豆酸為6.91 μg/mL、阿魏酸為6.72 μg/mL、菊苣酸為80.18 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取落花生枝葉粉末（過4號(hào)篩）約 1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇水溶液10 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率400 W，頻率40 kHz）30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇水補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn)

取同一批藥材（S4）粉末，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄指紋圖譜。以單咖啡酰酒石酸的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算樣品中所含12個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.02%～0.16%，相對(duì)峰面積RSD為0.17%～2.63%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)

雪螢焦急地說：“別聽他的，他這種人什么事做不出來？！”一杭說：“聽到了嗎？如果你的話可信，看守公廁的老人能被殺？夏冰能被送進(jìn)監(jiān)獄？我能落到今天這個(gè)地步？”

取同一批藥材（S4）粉末，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣6次，測(cè)定指紋圖譜。以單咖啡酰酒石酸的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算樣品中所含12個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.11%～0.20%，相對(duì)峰面積RSD為0.84%～1.87%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取一批藥材（S4）粉末，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h測(cè)定指紋圖譜，以單咖啡酰酒石酸的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算樣品中所含12個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.05%～0.26%，相對(duì)峰面積RSD為0.25%～2.23%，表明樣品24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 指紋圖譜建立與評(píng)價(jià)

2.5.1 指紋圖譜建立及共有峰標(biāo)定

分別取27批不同產(chǎn)地的落花生枝葉藥材1.0 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。將27批落花生枝葉藥材指紋圖譜依次導(dǎo)入國家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）軟件，設(shè)定S1為參照?qǐng)D譜，采用平均數(shù)法，時(shí)間窗寬度為0.1，進(jìn)行多點(diǎn)校正和色譜峰匹配，得到落花生枝葉藥材指紋圖譜疊加圖（見圖1），并生成落花生枝葉藥材的對(duì)照指紋圖譜（見圖2）。

圖2 落花生枝葉藥材對(duì)照指紋圖譜

查閱相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[12，24-25]，并與對(duì)照品的保留時(shí)間進(jìn)行比對(duì)，確定峰2為原兒茶酸，峰4為單咖啡酰酒石酸，峰6為咖啡酸，峰8為對(duì)香豆酸，峰9為阿魏酸，峰11為菊苣酸。由于單咖啡酰酒石酸色譜峰面積最大、分離度較好，因此選擇單咖啡酰酒石酸色譜峰為參照峰，標(biāo)定出12個(gè)共有指紋峰。

2.5.2 相似度評(píng)價(jià)

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)，計(jì)算27批落花生枝葉藥材指紋圖譜的相似度，結(jié)果見表2。共有峰峰面積占77.42%，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，共有峰的相對(duì)保留時(shí)間較穩(wěn)定（RSD為0.06%～0.20%），但共有峰的相對(duì)峰面積差異較大 （RSD為23.09%～120.11%）。不同批次落花生枝葉與對(duì)照指紋圖譜比較，除河北邢臺(tái)、河北唐山和河南南陽三產(chǎn)地樣品外，相似度均大于0.9，提示不同產(chǎn)地之間落花生枝葉整體化學(xué)組分類似，藥材質(zhì)量穩(wěn)定，但部分地區(qū)樣本存在一定差異。

表2 27批落花生枝葉藥材相似度

2.6 化學(xué)模式識(shí)別研究

2.6.1 聚類分析

使用SPSS20.0軟件，以12個(gè)共有峰峰面積為變量，采用Z得分法進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理，以組間聯(lián)接法進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析（HCA），結(jié)果見圖3?？梢钥闯?，河南南陽（Ⅰa）、江蘇泰州（Ⅰb）、河北唐山（Ⅰc）、上海（Ⅰd）、河北邢臺(tái)（Ⅰe）、遼寧營(yíng)口（Ⅰf）、廣西玉林（Ⅱa）、廣東湛江、韶關(guān)（Ⅱb）落花生枝葉樣品分別各自聚成一小類，江西贛州、湖南長(zhǎng)沙和福建福州、泉州的落花生枝葉樣品聚成一小類（Ⅰg）。分類結(jié)果明顯與藥材產(chǎn)地密切相關(guān)，27批落花生枝葉藥材被聚成兩大類（Ⅰ和Ⅱ組），廣西玉林和廣東湛江、韶關(guān)產(chǎn)地距離較近被分成一大類，并和其他產(chǎn)地差距明顯較大。

圖3 27批落花生枝葉藥材HCA樹狀圖

2.6.2 主成分分析

為進(jìn)一步分析27批落花生枝葉間的差異，將27批落花生枝葉藥材作為研究對(duì)象，把共有峰的峰面積作為變量導(dǎo)入SIMCA14.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行無監(jiān)督模式的主成分分析（PCA）建模，前3個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率R2X達(dá)90.5%，Q2為0.856，說明模型有效，結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示，右側(cè)廣西玉林和廣東湛江、韶關(guān)的落花生枝葉（S10～S12、S22～S23）明顯與其他產(chǎn)地差異較大，與聚類分析結(jié)果相符，表明不同產(chǎn)地落花生枝葉藥材化學(xué)成分存在較大差異。

圖4 落花生枝葉藥材PCA得分圖

2.6.3 正交偏最小二乘-判別分析

為更好分析廣東、廣西與其他產(chǎn)地落花生枝葉藥材的差異性，以12個(gè)共有指紋峰的峰面積為變量，導(dǎo)入SIMCA14.1軟件，將不同產(chǎn)地落花生枝葉藥材分成兩組，建立有監(jiān)督模式識(shí)別的正交偏最小二乘-判別分析（OPLS-DA）模型進(jìn)行分析，得到27批OPLS-DA得分圖，該OPLS-DA模型的R2X=0.903，R2Y=0.958，Q2=0.94，表明該模型具有較好的解釋能力和預(yù)測(cè)能力。為防止該模型過擬合造成假陽性結(jié)果，設(shè)置分類Y矩陣變量隨機(jī)排列200次做置換檢驗(yàn)，得置換檢驗(yàn)圖（見圖5），R2回歸線在Y軸截距為0.076 8、Q2回歸線在Y軸截距為-0.384，表明所建立的模型沒有出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，可用于判別分析27批樣品的組間差異。

圖5 OPLS-DA模型置換檢驗(yàn)

載荷圖可以根據(jù)變量離原點(diǎn)的距離判斷變量對(duì)主成分的影響權(quán)重，距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)的變量對(duì)主成分的影響權(quán)重越大。分析各變量對(duì)主成分1的影響權(quán)重，最大為峰11，其次為峰4，見圖6。根據(jù)變量重要性投影（VIP），以VIP>1.0為顯著影響，共找出不同產(chǎn)地落花生枝葉藥材2個(gè)差異性標(biāo)志物，分別為峰11和峰4，且峰11>峰4，提示可能因?yàn)榉?（單咖啡酰酒石酸）和峰11（菊苣酸）面積相對(duì)較大，對(duì)其結(jié)果影響較為明顯，見圖7。

圖6 落花生枝葉藥材色譜峰變量載荷圖

圖7 27批落花生枝葉藥材各成分VIP

3 討論

本試驗(yàn)通過二極管陣列檢測(cè)器（DAD）進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，在波長(zhǎng)310 nm處可以較全面地反映酚酸類成分，色譜峰信息全面，各峰吸收均勻，整體峰形良好，考慮到原兒茶酸最大吸收波長(zhǎng)為260 nm且峰面積較小，為較全面反映峰面積信息，所以在前16 min波長(zhǎng)為260 nm，同時(shí)比較了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.5%甲酸水溶液、甲醇-0.5%甲酸水溶液等流動(dòng)相系統(tǒng)梯度洗脫情況，發(fā)現(xiàn)甲醇-0.5%甲酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)色譜峰分離度較好、對(duì)稱性最好，雜質(zhì)干擾較小，確定流動(dòng)相通過最終優(yōu)化建立較全面的落花生枝葉藥材HPLC指紋圖譜。

本試驗(yàn)前期考察回流法、超聲提取法的提取效果，結(jié)果2種提取方式峰個(gè)數(shù)差異不大，超聲相對(duì)回流更方便省時(shí)，所以最終選擇超聲作為提取方式。同時(shí)對(duì)提取溶劑30%、50%、70%甲醇水和甲醇進(jìn)行綜合考察，發(fā)現(xiàn)以50%甲醇水為提取溶劑、液料比為1∶50時(shí)，提取效果最佳，色譜峰基線較為平穩(wěn)、雜質(zhì)干擾較少，因此選擇50%甲醇水為提取溶劑。

對(duì)11個(gè)產(chǎn)地27批落花生枝葉藥材建立指紋圖譜，共確定12個(gè)共有峰，共有峰峰面積占比77.42%，能較好代表落花生枝葉整體質(zhì)量；通過對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)出原兒茶酸、單咖啡酰酒石酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、菊苣酸6個(gè)成分。

采用不同分析方法對(duì)落花生枝葉藥材12個(gè)共有峰進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，考察樣品整體性與差異性。結(jié)果27批樣品相似度在0.846～0.985，表明27批藥材整體化學(xué)組分類似，藥材質(zhì)量穩(wěn)定，但可能由于受到氣候降水量[26]、土壤[27]、地勢(shì)地貌等環(huán)境因素影響，花生品種[28]、種植方式[29]及采收加工過程中人為因素的影響，導(dǎo)致藥材內(nèi)在化學(xué)成分的含量存在一定差異。

為更好辨識(shí)藥材之間的質(zhì)量差異，采用HCA和PCA，將27批落花生枝葉樣品分成兩大類，結(jié)果顯示，廣西（玉林）和廣東（湛江、韶關(guān)）兩省與其他地區(qū)差異明顯。相關(guān)文獻(xiàn)調(diào)查表明，我國南方7個(gè)花生主產(chǎn)區(qū)（廣東、廣西、江西、福建、云南、湖南和海南）屬于南方春秋花生產(chǎn)區(qū)，廣西、廣東兩地氣溫較高，氣候具有光照充足、雨量充沛、無霜期長(zhǎng)等特點(diǎn)，使該地花生產(chǎn)業(yè)的溫、光、水、氣條件較其他花生產(chǎn)區(qū)具有一定優(yōu)勢(shì)[30]。此外，通過OPLS-DA篩選出2個(gè)差異性質(zhì)量標(biāo)志物，分別是4號(hào)峰（單咖啡酰酒石酸）和11號(hào)峰（菊苣酸），可作為鑒別和區(qū)分落花生枝葉飲片質(zhì)量的指標(biāo)。

本研究采用HPLC建立不同批次落花生枝葉指紋圖譜，結(jié)合HCA、PCA和OPLS-DA方法，有效評(píng)價(jià)不同批次落花生枝葉的整體質(zhì)量，并快速篩選出不同批次落花生枝葉差異性質(zhì)量標(biāo)志物，可為落花生枝葉藥材的質(zhì)量控制提供方法學(xué)與試驗(yàn)依據(jù)。