洗心湯對腸上皮屏障炎癥模型P-gp/eCBs軸的影響

程妍 ，第五永長 ，丁鴻莉 ，王登坤 ，茍于瑞 ，楊謙 ，劉奇 ，周源

1.陜西中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，陜西 咸陽 712000； 2.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712000

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一種慢性進行性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)為記憶障礙、人格情志改變和其他認知功能衰退[1]。腦實質內(nèi)大量β淀粉樣蛋白（Aβ）異常沉積、過度磷酸化Tau蛋白及中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫炎癥反應是AD典型的病理特征[2]。相關研究表明，腸道微生態(tài)紊亂可產(chǎn)生強烈致炎物如脂多糖（LPS），可增加腸上皮屏障（intestinal epithelial barrier，IEB）通透性，導致“腸滲漏”，使多種致病物質逃逸至外周循環(huán)系統(tǒng)，引起全身炎癥和特定腦區(qū)域的功能障礙，如小腦和海馬[3]，促使神經(jīng)元凋亡，促進AD樣病理進展[4]。內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)（eCBs）與炎癥的產(chǎn)生和消退有密切關系[5]。P糖蛋白（P-gp）作為一種具有廣泛的底物特異性的跨膜泵，能夠平衡eCBs系統(tǒng)中相關受體蛋白的表達，從而參與炎癥過程[6]。調控P-gp/eCBs軸，增加P-gp表達可緩解腸道炎癥，從而降低IEB通透性。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，洗心湯對AD模型大鼠腸道微生物具有調節(jié)作用，可增加腦腸區(qū)神經(jīng)營養(yǎng)因子的合成與分泌，抑制腦內(nèi)Aβ沉積，從而改善AD模型大鼠學習記憶功能[7]。本研究通過LPS誘導T84細胞體外模擬IEB炎癥模型，探討洗心湯對炎癥反應及P-gp/eCBs軸相關蛋白表達的影響，為洗心湯通過“腦-腸軸”機制防治AD提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 細胞

人結腸癌肺轉移T84細胞株，購于上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.2 藥物及制備

洗心湯：人參30 g，姜半夏15 g，茯神30 g，酸棗仁30 g，陳皮9 g，神曲9 g，石菖蒲3 g，甘草3 g，炮附片3 g。飲片批號分別為200501、210201、201002、210301、 200601、 2012004、 200901、 20201202、20210301，購于北京同仁堂。飲片加適量純水煎煮，負壓抽濾后旋轉蒸發(fā)儀濃縮至50 mL，分裝至無菌玻璃管，階梯降溫，冷凍過夜，真空冷凍干燥后收集凍干粉，于-20 ℃密閉保存。凍干粉用PBS溶解，制成10 mg/mL溶液保存，使用時以DMEM/F12無血清培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

1.3 主要試劑與儀器

胎牛血清（FBS），批號20110119ZQA，上海中喬新舟；LPS，批號12190801，Sigma公司；DMEM/F12培養(yǎng)基、青鏈霉素、胰蛋白酶，批號分別為AG29643149、2149393、2147381，以色列Biological Industries公司；MTT，批號EZ7890B104，德國BioFroxx公司；腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-6 ELISA試劑盒，批號分別為H220221-102b、H220221-004b，深圳欣博盛生物；Aβ1-42、p-Tau ELISA試劑盒，批號分別為YJ057841、YJ057791，上海酶聯(lián)生物；二甲基亞砜（DMSO），批號710N035，北京索萊寶；4%多聚甲醛、RIPA裂解液、封閉液，批號分別為17B12B68、17A12B02、17A21C04，武漢博士德；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，批號16K24C12，武漢博士德；BCA蛋白定量試劑盒，批號062321211115，上海碧云天；P-gp一抗，批號00021841，武漢博士德；大麻素受體（CB）1、CB2一抗，批號分別為WC309427、WK328154，美國Novus Biologicals。

DSZ2000X熒光倒置顯微鏡，重慶澳浦光電技術有限公司；LD5-2A低速離心機，北京雷博爾醫(yī)療器械有限公司；CPA225D電子天平，北京賽多利斯科學儀器有限公司；Multiskan FC酶標儀，美國Thermo公司；RE1600上皮細胞電阻儀，北京金工鴻泰科技有限公司。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)及造模

T84細胞用DMEM/F12完全培養(yǎng)基（含5%FBS、1%青鏈霉素）置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)期生長期細胞，以6×104個/孔接種于96孔板，細胞貼壁后，棄去舊培養(yǎng)基，空白組加入無血清培養(yǎng)基，實驗組加入無血清培養(yǎng)基稀釋的LPS（終濃度為1、5、10、20、40 μg/mL），每組6個復孔，置于培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24、48、72 h，加入5%MTT溶液，4 h后加入DMSO溶液混勻，酶標儀波長490 nm處檢測各孔光密度（OD值），計算細胞存活率。存活率（%）=實驗組OD值÷空白組OD值×100%。

2.2 洗心湯濃度篩選

將T84細胞以6×104個/孔接種于96孔板，待細胞貼壁后，更換為無血清培養(yǎng)基饑餓4 h，棄去培養(yǎng)基，空白組加入無血清培養(yǎng)基，實驗組加入無血清培養(yǎng)基稀釋的終濃度為0.025、0.05、0.1、0.5、1 mg/mL洗心湯凍干粉溶液，每組6個復孔，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，MTT法檢測細胞存活率。

2.3 分組及干預

將細胞分為空白組、模型組和洗心湯24、48、72 h組，每組6個復孔，空白組用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，模型組加入無血清培養(yǎng)基稀釋的最佳濃度LPS培養(yǎng)24 h，洗心湯24、48、72 h組先用無血清培養(yǎng)基稀釋的最佳濃度洗心湯凍干粉溶液預保護4 h，用最佳濃度LPS造模后，棄去培養(yǎng)基，繼續(xù)加入最佳濃度洗心湯凍干粉溶液培養(yǎng)24、48、72 h。

2.4 跨膜電阻檢測

取對數(shù)生長期T84細胞，以3×105個/孔接種于Transwell上室，下室加入完全培養(yǎng)基1.5 mL，細胞貼壁后，棄去舊培養(yǎng)基，加入無血清培養(yǎng)基，使用細胞跨膜電阻儀進行檢測，當檢測值≥1 000 Ω且趨于穩(wěn)定時，按“2.3”項下方法分組處理，干預結束后再次檢測，計算跨膜電阻（TEER）。TEER（Ω·cm2）=（實際檢測值-空白孔測量值）×膜有效面積。

2.5 ELISA檢測

取對數(shù)生長期T84細胞，以6×104個/孔接種于96孔板，按“2.3”項下方法分組，每組6個復孔，取細胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA試劑盒檢測上清液TNF-α、IL-6、Aβ1-42、p-Tau含量，嚴格按試劑盒說明書操作。

2.6 Western blot檢測

取對數(shù)生長期T84細胞，以1.2×106個/孔接種于6孔板，按“2.3”項下方法分組干預后，收集細胞。提取蛋白后，使用BCA法進行蛋白定量，取適量蛋白樣品電泳（6%濃縮膠60 V、10%分離膠90 V），300 mA濕轉90 min，使用5%脫脂奶粉搖床封閉1 h，加P-gp、CB1、CB2一抗（1∶5 000），4 ℃搖床過夜，TBST漂洗3次，加二抗，室溫孵育90 min，TBST漂洗3次，加入ECL發(fā)光液暗室曝光，使用Image J軟件分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達量。

2.7 免疫熒光染色

取對數(shù)生長期T84細胞，以1.2×106個/孔接種于放有細胞爬片的12孔板中，按“2.3”項下方法分組干預后，用4%多聚甲醛固定10 min，1%Triton X-100處理10 min，用5% BSA室溫封閉1 h，滴加P-gp一抗（1∶500），4 ℃孵育過夜，滴加二抗工作液，室溫孵育1 h，DAPI室溫染色10 min，抗衰減熒光封片劑封片，熒光顯微鏡下拍照。用Image Pro Plus 6.0軟件進行統(tǒng)計分析，計算平均熒光強度（熒光強度/陽性染色面積）。

2.8 RT-PCR檢測

取對數(shù)生長期T84細胞，以1.2×106個/孔接種于6孔板，按“2.3”項下方法分組干預后，收集細胞，用Trizol試劑提取細胞RNA，微量紫外分光光度計檢測RNA濃度。用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，按RT-PCR試劑盒說明書操作，用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

3 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 9.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以±s表示，用Levene 進行方差齊性檢驗，多組間比較采用One-way ANOVA，進一步用LSD-t檢驗對有統(tǒng)計學意義的數(shù)據(jù)進行兩兩比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結果

4.1 造模濃度篩選結果

與空白組同一時點比較，10、20、40 μg/mL LPS處理細胞后，細胞存活率均明顯降低（P<0.01）；與10 μg/mL LPS處理細胞24 h比較，處理48、72 h無明顯差異（P>0.05）?？紤]LPS濃度過高可能對T84細胞造成不可逆損傷，故選用10 μg/mL LPS刺激24 h對T84細胞進行造模。見表2。

表2 不同濃度LPS及不同處理時間的T84細胞存活率比較（±s，%）

表2 不同濃度LPS及不同處理時間的T84細胞存活率比較（±s，%）

注：與同一時點空白組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別空白組實驗組LPS/（μg/mL）1 5 1 0 72 h 100.50±2.37 105.00±4.16 98.60±5.47 71.75±3.41**67.54±3.72**62.21±4.17**20 40 n 6 6 6 6 6 6 24 h 100.00±0.00 101.20±4.85 100.70±3.66 75.65±4.28*69.30±1.72**64.50±2.15**48 h 102.30±7.43 103.40±8.10 96.80±5.53 75.53±1.98**69.59±4.87**64.07±4.34**

4.2 洗心湯濃度篩選結果

與空白組比較，0.025 mg/mL洗心湯培養(yǎng)T84細胞存活率明顯增加（P<0.01），0.1、0.5、1 mg/mL洗心湯培養(yǎng)T84細胞存活率明顯降低（P<0.05，P<0.01），0.05 mg/mL洗心湯培養(yǎng)T84細胞存活率與空白組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。故選擇0.05 mg/mL洗心湯進行后續(xù)實驗。見表3。

表3 不同濃度洗心湯培養(yǎng)的T84細胞存活率比較（±s，%）

表3 不同濃度洗心湯培養(yǎng)的T84細胞存活率比較（±s，%）

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別 藥物濃度/（mg/mL）n 存活率空白組實驗組0.025 0.05 0.1 0.5 1 6 6 6 6 6 6 100.00±0.00 108.90±1.25**100.03±1.33 93.91±2.06*86.01±2.06**82.12±1.25**

4.3 洗心湯對T84細胞存活率的影響

與空白組比較，模型組細胞存活率明顯降低（P<0.01）；與模型組比較，洗心湯48 h、72 h組細胞存活率明顯升高（P<0.01）；與洗心湯24 h組比較，洗心湯48、72 h組細胞存活率明顯升高（P<0.01）。見表4。

表4 各組T84細胞存活率比較（±s，%）

表4 各組T84細胞存活率比較（±s，%）

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，▲▲P<0.01；與洗心湯24 h比較，##P<0.01

組別空白組模型組洗心湯24 h組洗心湯48 h組洗心湯72 h組n 6 6 6 6 6存活率100.00±0.00 76.02±3.61*77.49±3.43 93.50±1.47▲▲##92.89±2.70▲▲##

4.4 洗心湯對T84細胞跨膜電阻的影響

與空白組比較，模型組細胞TEER明顯減?。≒<0.01）；與模型組比較，洗心湯24、48、72 h組細胞TEER明顯增大（P<0.01）；與洗心湯24 h組比較，洗心湯48 h、72 h組細胞TEER差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表5。

表5 各組T84細胞TEER比較（±s，Ω?cm2）

表5 各組T84細胞TEER比較（±s，Ω?cm2）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，▲▲P<0.01

組別空白組模型組洗心湯24 h組洗心湯48 h組洗心湯72 h組n 3 3 3 3 3 TEER 100.00±0.00 53.27±3.48**93.07±2.73▲▲93.18±7.25▲▲93.51±8.39▲▲

4.5 洗心湯對T84細胞上清液腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6、β淀粉樣蛋白1-42、p-Tau含量的影響

與空白組比較，模型組細胞上清液TNF-α、IL-6、Aβ1-42和p-Tau含量明顯增加（P<0.01）；與模型組比較，洗心湯24、48、72 h組細胞上清液TNF-α、IL-6、Aβ1-42和 p-Tau含量明顯減少（P<0.05，P<0.01）。見表6。

表6 各組T84細胞上清液TNF-α、IL-6、Aβ1-42和p-Tau含量比較（±s，pg/mL）

表6 各組T84細胞上清液TNF-α、IL-6、Aβ1-42和p-Tau含量比較（±s，pg/mL）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

組別空白組模型組洗心湯24 h組洗心湯48 h組洗心湯72 h組n 3 3 3 3 3 TNF-α 35.53±3.11 83.07±2.95**43.05±2.61▲▲41.44±1.61▲▲41.08±1.06▲▲IL-6 16.08±3.94 42.77±3.70**20.44±1.42▲▲22.69±1.55▲▲21.83±2.21▲▲Aβ1-42 36.62±4.12 70.98±7.12**47.49±2.95▲41.52±5.69▲▲39.72±3.85▲▲p-Tau 62.15±1.90 79.19±1.21**70.32±0.82▲63.01±2.79▲▲64.29±2.05▲▲

4.6 洗心湯對T84細胞P糖蛋白、大麻素受體1、大麻素受體2蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組細胞P-gp、CB2蛋白表達明顯降低（P<0.01），CB1蛋白表達明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，洗心湯48、72 h組細胞P-gp、CB2蛋白表達明顯升高（P<0.01），CB1蛋白表達明顯降低（P<0.01）；與洗心湯24 h組比較，洗心湯48、72 h組細胞P-gp、CB2蛋白表達明顯升高（P<0.01），CB1蛋白表達明顯降低（P<0.01）。見圖1、表7。

圖1 各組T84細胞P-gp、CB1、CB2蛋白免疫印跡

表7 各組T84細胞P-gp、CB1、CB2蛋白表達比較（±s）

表7 各組T84細胞P-gp、CB1、CB2蛋白表達比較（±s）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，▲▲P<0.01；與洗心湯24 h組比較，##P<0.01

組別空白組模型組洗心湯24 h組洗心湯48 h組洗心湯72 h組n3 3 3 3 3 P-gp 1.00±0.00 0.54±0.02**0.89±0.01▲▲0.95±0.01▲▲##0.94±0.01▲▲##CB1 1.00±0.00 1.56±0.07**1.50±0.05 1.11±0.01▲▲##0.89±0.08▲▲##CB2 1.00±0.00 0.41±0.01**0.71±0.03▲▲1.17±0.05▲▲##1.27±0.07▲▲##

4.7 洗心湯對T84細胞P糖蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組細胞P-gp陽性表達明顯降低（P<0.01）；與模型組比較，洗心湯24、48、72 h組細胞P-gp陽性表達明顯升高（P<0.01）；與洗心湯24 h組比較，洗心湯48、72 h組細胞P-gp陽性表達明顯升高（P<0.05，P<0.01）。見圖2、表8。

圖2 各組T84細胞P-gp表達（免疫熒光染色，×400）

表8 各組T84細胞P-gp表達比較（±s，平均熒光強度）

表8 各組T84細胞P-gp表達比較（±s，平均熒光強度）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，▲▲P<0.01；與洗心湯24 h組比較，#P<0.05，##P<0.01

組別空白組模型組洗心湯24 h組洗心湯48 h組洗心湯72 h組n3 3 3 3 3 P-gp 1.00±0.00 0.20±0.02**0.69±0.07▲▲0.90±0.04▲▲#1.05±0.05▲▲##

4.8 洗心湯對T84細胞P糖蛋白mRNA表達的影響

與空白組比較，模型組細胞P-gp mRNA表達明顯降低（P<0.01）；與模型組比較，洗心湯48、72 h組細胞P-gp mRNA表達明顯升高（P<0.01）；與洗心湯24 h組比較，洗心湯48、72 h組細胞P-gp mRNA表達明顯升高（P<0.05）。見表9。

表9 各組T84細胞P-gp mRNA表達比較（±s）

表9 各組T84細胞P-gp mRNA表達比較（±s）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，▲▲P<0.01；與洗心湯24 h組比較，#P<0.05

組別空白組模型組洗心湯24 h組洗心湯48 h組洗心湯72 h組n 3 3 3 3 3 P-gp 1.01±0.16 0.20±0.03**0.34±0.04 0.68±0.05▲▲#0.77±0.13▲▲#

5 討論

AD屬中醫(yī)學“癡呆”范疇，《靈樞·海論》有“腦為髓之?！保X髓是智能和記憶的物質基礎。先天腎精虧損不能生髓，致腦髓漸空，后天脾氣虛不能化生精微以充養(yǎng)腦髓；同時脾不運濕，濕聚成痰，腎失蒸化，水聚為痰，痰濁蒙竅，元神失用，則昏蒙呆鈍而成癡呆。本課題組第五永長教授基于長期臨床實踐和理論思考，提出老年性癡呆“髓空痰濁”核心病機[8]。洗心湯出自清代醫(yī)家陳士鐸《辨證錄》，補益脾胃元氣，生精養(yǎng)髓，化痰開竅，從后天之本補養(yǎng)先天之精，標本兼治，寓消于補。課題組在前期大量基礎實驗中發(fā)現(xiàn)，洗心湯能抑制Tau蛋白過度磷酸化、維持海馬神經(jīng)元突觸正常功能、抑制神經(jīng)元凋亡、調節(jié)AD大鼠腸道微生物群[9-12]。

T84細胞在匯合時可自發(fā)分化為單層結構和功能成熟的腸上皮細胞系，與人腸上皮十分相似，常被用于IEB完整性相關研究。LPS可降低T84細胞活力，增加IEB通透性，是體外模擬腸黏膜炎性損傷最為理想的誘導劑，被用于體外實驗多年，可靠性已得到驗證[13-14]。本研究結果顯示，造模后T84細胞TEER減小，上清液TNF-α、IL-6含量增加，表明炎癥模型制備成功?！澳X-腸軸”概念認為，腸道可能通過外周免疫炎癥參與AD的病理進展[15]。腸道微生物群的變化和IEB損傷可以影響腸壁的通透性，加劇腸道Aβ積累和Tau蛋白過度磷酸化，進而引發(fā)腸道和外周神經(jīng)炎癥反應，并通過腸腦相關通路導致腸道功能障礙及中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥[16-17]。轉基因AD小鼠在早期就表現(xiàn)出腸內(nèi)Aβ異常沉積、腸道炎癥通路激活、神經(jīng)元丟失、腸道膠質細胞活化及腸道功能障礙等腦-腸軸紊亂的表現(xiàn)[18-19]。P-gp作為一種轉運蛋白，具有防止外源性物質及有害代謝物吸收進入機體的重要作用。P-gp可減少Aβ沉積[20]，還可通過介導eCBs相關代謝途徑抑制嗜中性粒細胞跨上皮遷移，從而調控免疫炎癥反應[21]。CB1和CB2是eCBs中最常見的2個受體：CB1可與機體內(nèi)一氧化氮合酶聯(lián)合氧化巨噬細胞，從而加劇炎癥反應[22]，進而加重Aβ誘導的神經(jīng)元損傷，抑制神經(jīng)元活性[23]；而CB2具有抑炎作用，當全身發(fā)生炎癥反應時，激活的CB2不僅可以降低炎癥介質，減少促炎因子含量，且能調節(jié)腸道微生物群的穩(wěn)定[24-25]。本實驗中，采用洗心湯進行干預能提高T84細胞存活率，降低IEB通透性及減少促炎因子分泌，降低Aβ1-42、p-Tau含量，從而減輕IEB炎癥反應。此外，洗心湯能增加T84細胞P-gp mRNA及P-gp、CB2蛋白表達，降低CB1蛋白表達，提示其可能通過“P-gp泵”調節(jié)CB1、CB2，發(fā)揮治療作用。

綜上，洗心湯對IEB炎癥模型通透性具有明顯保護作用，其可能通過調節(jié)P-gp、CB1及CB2表達，緩解炎癥反應，從而發(fā)揮治療作用。本研究初步探討了洗心湯對腸區(qū)炎癥的作用及機制，洗心湯如何調節(jié)腸腦之間炎癥免疫通路，防治AD還需進一步深入研究。