內(nèi)生細(xì)菌TF28對(duì)番茄灰霉病的誘導(dǎo)抗性研究

張淑梅等

摘要 [目的]研究?jī)?nèi)生細(xì)菌TF28對(duì)番茄灰霉病的誘導(dǎo)抗性。[方法] 采用生化測(cè)定方法研究?jī)?nèi)生細(xì)菌TF28對(duì)番茄葉片6種防御酶活性和2種抗病信號(hào)分子含量的影響。[結(jié)果]內(nèi)生細(xì)菌處理后番茄葉片苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、過(guò)氧化物酶（POD）、脂氧合酶（LOX）、幾丁質(zhì)酶和β1，3葡聚糖酶活性明顯增強(qiáng)，6種防御酶最大活性分別為對(duì)照的2.7、2.5、1.6、1.5、2.7和4.1倍。水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）含量明顯上升，SA含量第7天最高，JA含量第3天最高，分別為對(duì)照的2.1和2.9倍。[結(jié)論]內(nèi)生細(xì)菌TF28可誘導(dǎo)提高防御酶活性抵抗番茄灰霉病侵染，誘導(dǎo)抗病信號(hào)傳導(dǎo)途徑可能與SA和JA介導(dǎo)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 內(nèi)生細(xì)菌；番茄；灰霉??；誘導(dǎo)抗性

中圖分類(lèi)號(hào) S476 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）11-03253-04

Abstract [Objective] To elucidate the mechanism of induced resistance of tomato to grey mold by endophytic bacterium TF28. [Method] the activity of defensive enzymes and the contents of defensive signals were determined. After the treatment with TF28， the activity of phenylalanine ammonialyase （PAL）， polyphenol oxidase （PPO）， peroxidase （POD）， lipoxygenase （LOX）， chitinase and β1，3glucanase increased significantly. [Result] The maximum of PAL， PPO， POD， LOX， chitinase and β1，3glucanase was 2.7， 2.5， 1.6， 1.5， 2.7 and 4.1times higher than that in control， respectively. The contents of salicylic acid （SA） and jasmonic acid （JA） were also improved significantly. The contents of SA reached the peak 7 days after inoculation while JA reached the maximum 3 days after treatment， which was 2.1 and 2.9 times higher than that in control， respectively. [Conclusion] Results demonstrated that endophytic bacterium TF28 could improve the activity of defensive enzymes to prevent Botrytis cinerea. The defense pathway might include SA and JA signal transmission.

Key words Endophytic bacterium； Tomato； Grey mould； Induced resistance

番茄灰霉病是番茄生產(chǎn)中的主要病害，嚴(yán)重影響番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。目前對(duì)于灰霉病的防治仍以化學(xué)農(nóng)藥為主，然而化學(xué)農(nóng)藥的毒性和殘留等問(wèn)題日益突出，嚴(yán)重威脅人畜健康和環(huán)境安全。近年來(lái)利用拮抗細(xì)菌防治番茄灰霉病研究較多，主要側(cè)重于生防菌株篩選、防效、定殖以及抗菌物質(zhì)方面，所報(bào)道的菌株以芽孢桿菌為主，其生防機(jī)制主要包括營(yíng)養(yǎng)和位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)、抗菌物質(zhì)的拮抗和誘導(dǎo)植物抗病性[2-8]。近年來(lái)，由于植物誘導(dǎo)抗病性具有廣譜性，被認(rèn)為是植物病害防治新方式，因此對(duì)于芽孢桿菌誘導(dǎo)植物抗病性的研究日益增多[9-10]。研究表明，芽孢桿菌誘導(dǎo)植物抗病性因菌株而異，其誘導(dǎo)抗病性反應(yīng)的信號(hào)識(shí)別與傳導(dǎo)途徑、生理生化反應(yīng)模式等復(fù)雜多樣。植物防御酶系活性變化是生防細(xì)菌誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性的重要生理生化反應(yīng)，涉及的主要防御酶包括苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過(guò)氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、幾丁質(zhì)酶（Chitinase）、β 1，3葡聚糖酶（β 1，3 Glucanase）和脂氧合酶（LOX）等，大量研究表明，植物受誘導(dǎo)因子刺激后這些酶活性增強(qiáng)[11]。水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）是植物抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的2個(gè)重要信號(hào)分子，其含量與植物抗病性成正相關(guān)[12]。

內(nèi)生細(xì)菌因與植物具有很好的親和性，成為近年來(lái)備受關(guān)注的一類(lèi)重要生防菌株。內(nèi)生細(xì)菌TF28是筆者從大豆根部分離到的一株解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens，對(duì)大豆根腐病菌、水稻惡苗病菌、番茄灰霉病菌等10多種植物病原真菌具有很好的拮抗作用，能夠產(chǎn)生抗菌蛋白和脂肽類(lèi)抗生素等多種抗菌物質(zhì)[13]。溫室試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)苗期噴灑TF28菌液能夠提高番茄抗灰霉病能力。筆者以苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶、過(guò)氧化物酶、脂氧合酶、幾丁質(zhì)酶和β-1，3葡聚糖酶以及水楊酸和茉莉酸為指標(biāo)，明確內(nèi)生細(xì)菌TF28處理后番茄葉片6種防御酶活性和2種抗病信號(hào)分子含量變化情況，為闡明內(nèi)生細(xì)菌TF28誘導(dǎo)番茄抗灰霉病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

內(nèi)生細(xì)菌Bacillus amyloliquefaciens TF28分離自大豆根部，是一株具有廣譜抑菌作用的生防菌株。番茄灰霉病菌Botrytis cinerea分離自感病番茄果實(shí)。番茄品種為東農(nóng)713。

1.2 番茄灰霉病菌孢子懸浮液的制備

將活化后的番茄灰霉病菌菌絲塊接種至PDA平板，25 ℃培養(yǎng)7～10 d，用無(wú)菌水洗滌。洗滌液經(jīng)5 000 r/min 離心5 min后，棄沉淀，上清液用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子數(shù)，用無(wú)菌水稀釋至1.5×107cfu/ml的孢子懸液，添加0.02%吐溫80備用。

1.3 TF28菌液制備

挑取一環(huán)-70 ℃保存的TF28菌液劃線(xiàn)接種至NYD平板，30 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日取單菌落轉(zhuǎn)接于5 ml NYD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)18 h，作為種子液。將種子液按2%接種量轉(zhuǎn)接于100 ml NYD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)36 h，活菌計(jì)數(shù)后用無(wú)菌水稀釋至2×108 cfu/ml的菌懸液備用。

1.4 盆栽試驗(yàn)設(shè)計(jì)

挑選飽滿(mǎn)番茄種子，用清水浸泡5 h，催芽后播種，每盆1粒，保持適宜溫度、濕度和栽培管理，用第5片真葉作為研究對(duì)象，設(shè)4個(gè)處理，每個(gè)處理20株。①病菌處理：噴灑灰霉病菌孢子懸液；②內(nèi)生細(xì)菌處理：將TF28菌液添加0.02%吐溫80后噴施番茄葉片；③先接病菌后接內(nèi)生細(xì)菌處理：噴施番茄灰霉病菌孢子1d后再?lài)姙F28菌液；④空白對(duì)照：只噴灑清水。處理后分別在1、2、3、4、5、6、7 d取各處理葉片測(cè)定防御酶活性和抗病分子含量。

1.5 防御酶活性測(cè)定

取0.2 g番茄葉片用于提取粗酶。苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）和過(guò)氧化物酶（POD）活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[14]，幾丁質(zhì)酶（Chitinaes）和β1，3葡聚糖酶（β1，3glucanase）活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[15]，脂氧合酶活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[16]。

1.6 水楊酸和茉莉酸含量測(cè)定

取0.2 g番茄葉片，參照文獻(xiàn)[17]方法提取水楊酸，參照文獻(xiàn)[18]方法提取茉莉酸，用上海裕平生物科技有限公司的酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定水楊酸和茉莉酸含量，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌TF28對(duì)番茄葉片PAL活性的影響

由圖1可知，內(nèi)生細(xì)菌TF28和灰霉病菌單獨(dú)以及共同處理后PAL活性顯著增強(qiáng)。3個(gè)處理酶活性變化規(guī)律相似，均在第2天活性最大，分別為對(duì)照的2.7、2.3和3.6倍，第7天活性最小，分別為對(duì)照的1.6、1.1和1.8倍。TF28和灰霉病菌共同處理PAL活性顯著高于兩者單獨(dú)處理，其最大活性比TF28和灰霉病菌單獨(dú)處理高29.3%和55.2%。TF28單獨(dú)處理PAL活性高于灰霉病菌單獨(dú)處理。表明內(nèi)生細(xì)菌TF28和灰霉病菌均能誘導(dǎo)番茄葉片PAL活性增強(qiáng)，TF28的誘導(dǎo)能力強(qiáng)于灰霉病菌，TF28和灰霉病菌共同誘導(dǎo)具有協(xié)同增效作用。

3 結(jié)論與討論

PAL、POD、PPO、LOX、Chitinase和β-1，3Glucanase是植物誘導(dǎo)抗病反應(yīng)中的主要防御酶，PAL、POD、PPO和LOX參與抗菌物質(zhì)植保素和木質(zhì)素合成，Chitinase和β-1，3Glucanase水解病原真菌細(xì)胞壁[19-20]，研究發(fā)現(xiàn)防御酶活性與植物誘導(dǎo)抗病性呈正相關(guān)性。薛玉瀟等[21]研究發(fā)現(xiàn)香蕉根部接種生防枯草芽孢桿菌后，香蕉葉片PAL、POD和PPO活性顯著提高；王淑霞等研究發(fā)現(xiàn)哈茨木霉Tr-92處理黃瓜根部，黃瓜葉片PAL、POD、PPO、Chitinase和β-1，3Glucanase活性顯著提高[22]。該研究用內(nèi)生細(xì)菌TF28噴灑番茄葉片后，番茄葉片PAL、POD、PPO、LOX、Chitinase和β-1，3Glucanase活性顯著提高，與已有報(bào)道一致，說(shuō)明這些防御酶在內(nèi)生細(xì)菌誘導(dǎo)番茄抗灰霉病過(guò)程中起重要作用。6種防御酶活性變化規(guī)律和最高活性峰出現(xiàn)時(shí)間不同，PPO活性在接種后1 d立即達(dá)到最大，POD活性緩慢升高，在第7天達(dá)到最大，PAL活性在第2天達(dá)到最大，LOX、Chitinase和Glucanase活性均在第5天達(dá)到最大，這些酶活性高峰出現(xiàn)時(shí)間的異同可能與其在抗病反應(yīng)中所起作用早晚有關(guān)。在酶活性增加幅度上，除Chitinase之外，內(nèi)生細(xì)菌TF28處理后其他5種酶活性高于灰霉病菌單獨(dú)接種；內(nèi)生細(xì)菌與灰霉病菌共同處理PAL、PPO和Chitinase活性高于TF28單獨(dú)處理，POD、LOX和Glucanase活性與TF28單獨(dú)處理相當(dāng)，說(shuō)明先接種灰霉病菌可增強(qiáng)內(nèi)生細(xì)菌對(duì)番茄灰霉病誘導(dǎo)抗性。

PAL和LOX除參與抗菌物質(zhì)生成，還參與抗病信號(hào)分子合成，PAL參與SA合成，LOX參與JA合成[23]。內(nèi)生細(xì)菌TF28處理后， PAL活性和SA含量均提高，PAL活性在第2天最大，然后下降，SA含量在第3天最大；LOX活性在第2天活性較高，第5天活性最高，而JA含量在第3天最高，然后下降，推測(cè)噴灑內(nèi)生細(xì)菌1～3 d PAL主要參與SA合成，LOX主要參與JA合成，4～7 d兩者主要參與抗菌物質(zhì)合成。

植物體內(nèi)存在多條抗病信號(hào)傳導(dǎo)途徑，水楊酸和茉莉酸介導(dǎo)途徑是植物誘導(dǎo)抗病信號(hào)傳導(dǎo)2個(gè)主要途徑，不同誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)的植物抗病信號(hào)傳導(dǎo)途徑不同， 2種途徑存在拮抗和協(xié)同現(xiàn)象[24]。水楊酸和茉莉酸是植物抗病信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的2個(gè)重要抗病信號(hào)分子，其含量與植物抗病性呈正相關(guān)。內(nèi)生細(xì)菌TF28誘導(dǎo)后番茄葉片中水楊酸和茉莉酸含量均升高，推測(cè)內(nèi)生細(xì)菌TF28誘導(dǎo)番茄抗灰霉病信號(hào)傳導(dǎo)途徑包括水楊酸和茉莉酸2種途徑，且2種途徑具有協(xié)同作用。

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