分子印跡柱結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬尿中四種β-受體激動劑

宋世文，宋曉儀，唐淑軍，曾定玲，文冠希，梁 幸

（深圳市質(zhì)量安全檢驗檢測研究院，深圳 518101）

克倫特羅通常用于治療支氣管炎，又曾被用作動物養(yǎng)殖的促生長劑，提高動物的瘦肉產(chǎn)率。萊克多巴胺、沙丁胺醇、西馬特羅等β-受體激動劑，與克倫特羅具有類似作用。在利益驅(qū)動下，將β-受體激動劑類藥物用于動物養(yǎng)殖，給食品安全帶來很大隱患［1］。為了確保動物源性食品安全，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部176 號文件明確規(guī)定禁止將克倫特羅等β-受體激動劑用于動物養(yǎng)殖［2］。

β-受體激動劑類藥物的測定主要用精密儀器通過多個過程提取凈化，可以實現(xiàn)高準確率和高靈敏度，如液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，缺點是用時較長，單個樣品成本高，難以實現(xiàn)大量樣品檢測。分子印跡固相萃取通過空間形狀、孔穴大小以及識別位點對目標分析物進行識別，能夠?qū)崿F(xiàn)選擇性萃取和富集目標物克倫特羅的測定，方法具有很高的靈敏度、穩(wěn)定性和可靠性［3］。

研究應用MIT 固相萃取柱凈化和富集豬尿液中的克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、西馬特羅等β-受體激動劑，利用其選擇性強和靈敏度高的特點，采用10 個單樣組成混合樣品先篩選，再對陽性混合樣品進行單個檢測，該方法有較低的檢出限和較高的精密度，能對豬尿液中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、西馬特羅進行準確的定性和定量分析。該方法準確率高、快速，特別適合陽性率較低和檢測量大的情形應用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

5500 QTRAP 串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB Sciex 公司）、ACQUITY UPLC 超高效液相色譜、固相萃取裝置、Oasis TM MCX 固相萃取柱（美國Waters 公司）；3-30K 臺式高速冷凍離心機（德國Sigma 公司）；Supel MIP SPE（β-agonists，25 mg∕10 mL，65 μm，美國Sigma 公 司）；Affinilute MIP-SPE（β-agonist，EUBiotage 公司，25 mg∕10 mL）；J2 全自動固相萃取濃縮儀（美國J2 公司）。

甲醇、乙腈均為色譜純（德國Merck 公司）；甲酸為色譜純（北京迪馬科技有限公司）；乙酸為分析純（上海潤捷化學試劑有限公司）；乙酸銨、氨水（NH3含量25%～28%）均為分析純（上海國藥集團化學試劑有限公司）；克侖特羅（clenbuterol）、萊克多巴胺（ractopamine）、沙丁胺醇（sblbutamol）、西馬特羅（Bambuterol，純度＞98%）等標準物質(zhì)購自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，濃度100 mg∕L；乙二胺-N-丙基硅烷吸附劑（PSA）粒徑40～60 μm、C18粉40 μm（美國Agilent Tech）。

1.2 標準溶液的配制

準確量取100 mg∕L 標準物質(zhì)用甲醇定容稀釋至10 mg∕L 混合標準物質(zhì)，再用甲醇定容稀釋為0.01、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 μg∕L 的混合標準工作液。

1.3 液相色譜-質(zhì)譜條件

1）色譜柱。Acquity LC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，17 μm，美國Waters 公司）；柱溫40 ℃；流速0.3 mL∕min；進樣量5.0～10.0 μL；流動相為甲醇（A）和0.05%（V∕V）甲酸水溶液（B）。梯度洗脫程序：0～2.0 min，10%～40%A，3.0～4.0 min，40%～90%A；4.0～4.1 min，90%A；4.1～4.2 min，10%～90%A；4.2～6.0 min，10%A。

2）離子源。電噴霧離子（ESI）源；正離子模式；檢測方法為多反應監(jiān)測模式（MRM）；電噴霧電壓正離子5 500 V；離子源溫度500 ℃；霧化氣0.41 MPa輔助加熱氣100∶0.31 MPa；輔助加熱氣2∶0.34 MPa；氣簾氣0.21 MPa。

1.4 樣品準備

1）單樣品準備。取豬尿樣品50 mL，用乙酸（5%）和氫氧化鈉（5%）調(diào)節(jié)pH 至7.0，以5 000 r∕min離心5 min ，取上清液備用。單樣品是用于單個樣品的定性定量檢測。

2）混合樣品準備。移取5 mL 待測單樣品上清液，10 個單樣品混合成一個混合樣品?；旌蠘悠酚糜谧疃?0 個樣品同時定性定量檢測，對檢測呈陽性混合樣品，再對單個樣品進行檢測。

1.5 樣品預處理

依次用3 mL乙醇、3 mL去離子水、3 mL 50 mmol∕L乙酸銨（pH 6.7）活化MISPE 柱；移取5 mL 豬尿混合樣品（2 mL 豬尿單樣品），加入50 mg∕mL 的PSA 粉和C18 粉，旋渦3 000 r∕min 混勻3 min 放置5 min，取上清液上樣過柱；依次用3 mL 去離子水、3 mL 乙腈、2 mL 0.5%（V∕V）乙酸∕乙腈溶液淋洗，用洗耳球擠干溶液；用5 mL 10%（V∕V）乙酸∕甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，用洗耳球擠干溶液；于50 ℃水浴下氮氣吹至近干，用0.5 mL 0.1%（V∕V）甲酸水∕乙腈（9∶1，V∕V）復溶，過0.22 μm 濾膜，待測。液相色譜進樣量混合樣品10 μL（5 μL 單樣品）。此過程也可用J2 全自動固相萃取濃縮儀完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

為提高4 種β-受體激動劑檢測的選擇性和靈敏度，優(yōu)化檢測離子對和檢測條件，以達到穩(wěn)定性和靈敏度的統(tǒng)一。4 種β-受體激動劑類藥物的保留時間及離子對優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 4 種β-受體激動劑類藥物的保留時間及離子對質(zhì)譜參數(shù)

2.2 凈化效果比較

尿液組成復雜，含有大量尿酸、尿嘧啶和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)；同時動物個體差異也導致尿液基體組成變化較大；因此，尿液樣品基質(zhì)干擾是影響β-受體激動劑測定的重要因素，進而影響分析檢測的靈敏度和準確性。為了更好的凈化效果，比較了3 種固相柱的凈化效果，即Sigma-MIT、Biotage-MIT 與MCX固相萃取的凈化效果，4 種β-受體激動劑在尿液中的添加濃度為0.1 μg ∕L，用混合樣品法測定，重復6 次，通過固相柱萃取凈化后，應用LC-MS-MS 測定，得到4 種β-受體激動劑的信噪比（表2）。信噪比高，表示凈化效果好，檢出限低。由表2 可知，Sigma-MIT 固相萃取能有效地消除尿液樣品基質(zhì)對4 種β-受體激動劑的影響，信噪比最高，其他2 種固相柱只有接近或不到Sigma-MIT 的50%。用變異系數(shù)代表穩(wěn)定性，變異系數(shù)低，表示穩(wěn)定性高。由表2可知，Sigma-MIT 固相萃取對4 種β-受體激動劑的穩(wěn)定性最優(yōu)，其他2 種都在124%和170%以上，因此選擇Sigma-MIT 凈化（表2）。

表2 3 種固相萃取柱凈化效果的比較

2.3 方法的定量限和線性范圍

單樣品添加濃度為0.1、0.2、1.0、5.0、10.0 μg∕L；多樣品添加濃度為0.01、0.02、0.05、1.00、5.00 μg ∕L；其中最低濃度重復6 次，其他濃度重復3 次。 該方法的特點是較當前國標（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告1063 號）LOQ更低，其中單樣品法比國標降低75%，為0.1 μg∕L，多樣品法比國標降低95%，為0.01 μg∕L（表3），表明該方法可以進行多樣品混合檢測［4，5］。

表3 方法的檢出限和線性范圍

2.4 方法的回收率和精密度

單樣品添加濃度為0.1、0.2、5.0 μg∕L；混合樣品添加濃度為0.01、0.02、1.00 μg∕L；每個梯度重復6次。4 種β-受體激動劑加標回收率和精密度見表4和表5。不同加標濃度下，加標回收率為61.2%～99.6%；精密度為4.9%～18.7%，該方法準確性和穩(wěn)定性良好。

表4 單樣品添加回收率和精密度

表5 混合樣品添加回收率和精密度

2.5 方法應用效率

根據(jù)深圳市市場監(jiān)督管理局2019 年網(wǎng)上公開資料［6］，2019 年畜禽產(chǎn)品1—9 月抽檢3 601 個樣品，檢測β-受體激動劑、磺胺、硝基呋喃3 類20 個項目，發(fā)現(xiàn)超標樣品22 個，超標率為0.61%。其中，β-受體激動劑超標率小于0.1% 。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公開信息［7］，2021 年抽檢畜禽樣品22 127 份，檢測項目18 項，總超標率為1.2%，β-受體激動劑超標率小于0.1%。深圳市寶安區(qū)2018—2021 年4 年共檢測畜禽產(chǎn)品384 個，檢測β-受體激動劑、磺胺、四環(huán)素類、喹諾酮類4 類18 個項目，累計超標樣品15 個，超標率為3.9%；超標樣品主要是四環(huán)素類和喹諾酮類，未見β-受體激動劑類物質(zhì)超標?？梢?，β-受體激動劑超標率較少，不到0.1%。

在實際檢測中，對超標率小于0.1%的情形，1 000 個單樣品可以組成100 個混合樣品，由于陽性率小于0.1% ，只需1 個混合樣品重新檢測，所以相當于檢測1 000 個單樣品，只需要檢測110 次（100 個混合樣和10 個單樣），該方法效率是通常方法檢測的9.1 倍。對超標率小于1%的樣品，100 個單樣品可以組成10 個混合樣品，共需檢測20 個樣品（10 個混合樣品和10 個單樣品），效率是普通檢測的5 倍。該方法適用于超標率不高的大量樣品使用。