氧化應(yīng)激在感音神經(jīng)性耳聾中的作用機(jī)制

王香香 孫建軍 刁明芳

1 活性氧的產(chǎn)生和作用機(jī)制

氧化應(yīng)激是指機(jī)體細(xì)胞內(nèi)氧化與抗氧化失衡的狀態(tài)，傾向于氧化。氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)是一大類基于氧的含有未配對(duì)電子的原子或原子團(tuán)，其化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，易接收或釋放不成對(duì)電子而形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，主要包括氧自由基和含氧非自由基活性物質(zhì)，其生理量可調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)正常功能，但在某些病理情況下，機(jī)體ROS產(chǎn)生過多或抗氧化防御系統(tǒng)受損導(dǎo)致活性氧蓄積，可引起組織細(xì)胞損傷和功能障礙[1]。目前認(rèn)為線粒體是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS的主要部位，因?yàn)榧?xì)胞總耗氧量的90%～95%來自于線粒體，且在還原為H2O的過程中，約有0.1%～2%的氧氣部分還原，誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS[2]。

ROS對(duì)生物大分子有損傷作用，具有極強(qiáng)的氧化能力，過度積累會(huì)導(dǎo)致DNA損傷、蛋白質(zhì)變性和脂質(zhì)過氧化等。①ROS可對(duì)DNA堿基進(jìn)行氧化修飾、破壞DNA脫氧核糖中C-H鍵、分解核苷酸等。與核DNA不同，線粒體DNA（mtDNA）由于缺乏保護(hù)性組蛋白，對(duì)氧化損傷尤其敏感。此外，線粒體電子傳遞系統(tǒng)（ROS產(chǎn)生的位點(diǎn)）與mtDNA的附著位置（線粒體內(nèi)膜側(cè)）接近，造成mtDNA必須在ROS不斷損傷下修復(fù)[3]；②ROS對(duì)蛋白質(zhì)的影響包括氨基酸殘基的修飾、肽鏈的斷裂、蛋白質(zhì)交聯(lián)，從而破壞蛋白質(zhì)的正常功能。在過渡金屬Fe或Cu存在的情況下，H2O2可轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚宰饔酶鼜?qiáng)的自由基·HO，進(jìn)而產(chǎn)生更為劇烈的氧化反應(yīng)；③ROS可直接氧化不飽和脂肪酸，顯著改變膜和其他脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而改變膜的流動(dòng)性、滲透性，干擾物質(zhì)運(yùn)輸，且對(duì)于線粒體膜的損傷可直接干擾細(xì)胞內(nèi)ATP的生成[4]。且脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)生多種化學(xué)性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定的副產(chǎn)物，如丙二醛、壬烯酸、丙烯醛和異前列腺素等[5]，這些氧化產(chǎn)物不僅直接引起細(xì)胞凋亡，還能共價(jià)修改重要的生物大分子，使蛋白質(zhì)和DNA發(fā)生交聯(lián)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或死亡。除此之外，過量的ROS還可進(jìn)一步促使炎性細(xì)胞因子的生成，加劇細(xì)胞損傷[6]。

2 氧化應(yīng)激和內(nèi)耳疾病

2.1 噪聲引起的聽力損失

噪聲性聾（noise-induced hearing loss，NIHL）的其聽力學(xué)特征是4000 Hz處聽閾提高最明顯。噪聲引起的聽力損失的機(jī)制除了毛細(xì)胞表皮板纖毛束的機(jī)械損傷外[7]，更重要的是過量ROS的作用[8]：噪聲過度刺激增加了毛細(xì)胞中機(jī)械感覺立體纖毛的位移速度，從而開放機(jī)械敏感通道，鉀離子大量?jī)?nèi)流，增加了線粒體對(duì)ATP合成的需求。換言之，在強(qiáng)噪聲暴露時(shí)，耳蝸淋巴液振動(dòng)轉(zhuǎn)換成神經(jīng)電沖動(dòng)的過程需要毛細(xì)胞線粒體超負(fù)荷生產(chǎn)ATP，此過程同時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物-ROS；噪聲導(dǎo)致的耳蝸缺血后再灌注，也會(huì)進(jìn)一步增加ROS的產(chǎn)生；此外，過度噪聲刺激引起毛細(xì)胞釋放大量谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)，也可能通過對(duì)初級(jí)感覺神經(jīng)元產(chǎn)生興奮性毒性而導(dǎo)致?lián)p傷。

自由基的產(chǎn)生已通過檢測(cè)活性氧、代謝產(chǎn)物水平以及抗氧化劑在預(yù)防聽力損失中的有效作用得到證明。暴露于強(qiáng)噪聲后，可立即觀察到ROS的生成，遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于檢測(cè)到損傷的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，并在噪聲暴露結(jié)束后持續(xù)7～10天[9]。噪聲暴露后ROS誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物能引起細(xì)胞凋亡，且血管活性脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物（即異丙醇）能使耳蝸血流量減少[10]。另外，嚙齒動(dòng)物模型中通過增加谷胱甘肽水平治療NIHL，與未治療的動(dòng)物相比，治療組動(dòng)物的耳蝸損傷顯著減少[11]。同樣噪聲暴露后給予N-乙酰半胱氨酸可最大限度地減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物毛細(xì)胞的凋亡進(jìn)程，明顯降低中低頻聽覺閾值偏移[12]。一項(xiàng)隨機(jī)雙盲試驗(yàn)[13]發(fā)現(xiàn)，依布硒啉（基于硒的有機(jī)化合物，能夠模擬和增強(qiáng)體內(nèi)谷胱甘肽過氧化酶1的活性）在預(yù)防成人急性噪聲性聽力損失方面是安全有效的。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）是一種應(yīng)激反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子，在氧化應(yīng)激介導(dǎo)的組織損傷中起關(guān)鍵作用。使用STAT3抑制劑可抑制STAT3信號(hào)通路，降低外毛細(xì)胞中ROS水平，防止噪聲暴露引起的耳蝸毛細(xì)胞損傷和聽力損失[14]。

近年來，隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，多組學(xué)技術(shù)被廣泛用于疾病研究。其中相較于基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)，代謝物的種類和數(shù)量少且易獲得，基因和蛋白表達(dá)的有效微小變化也會(huì)在代謝物上得以放大；另外，基因表達(dá)的結(jié)果可能需要數(shù)小時(shí)才能表現(xiàn)出來，而代謝變化能更加迅速的反映出來；且代謝物是各因素效應(yīng)的最終體現(xiàn)，與生物表型變化有直接相關(guān)性。Fujita等[15]研究了強(qiáng)噪聲暴露（126 dB SPL）對(duì)豚鼠耳蝸外淋巴中代謝物水平的影響，發(fā)現(xiàn)暴露于噪聲后，內(nèi)耳外淋巴中的十種代謝物水平發(fā)生顯著變化，而血漿中的代謝物水平?jīng)]有變化。且這10種代謝產(chǎn)物中抗壞血酸的水平差異最大。抗壞血酸在生理上是一種水溶性小分子抗氧化劑，可有效清除超氧物、硫醇、單線態(tài)O2和羥基自由基。之前研究也發(fā)現(xiàn)不能合成抗壞血酸的SMP30/GML基因敲除小鼠內(nèi)耳螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量減少，聽覺腦干反應(yīng)閾值增加[16]。Ji等[17]進(jìn)一步收集小鼠顳骨組織，通過靶向代謝組學(xué)對(duì)220種代謝物進(jìn)行分析，鑒定了40種受噪聲影響的代謝物，檢測(cè)到與氧化應(yīng)激相關(guān)的代謝物和途徑，證實(shí)噪聲暴露和氧化應(yīng)激之間存在一定聯(lián)系。

2.2 耳毒性藥物引起的聽力下降

耳毒性藥物主要包括氨基糖苷類抗生素（aminoglycoside antibiotics，AmAn）和鉑類抗癌藥物，這兩類藥物通過凋亡途徑產(chǎn)生ROS損傷Corti’s器毛細(xì)胞。AmAn是廣譜抗生素，兼有耳毒性和腎毒性[18]。腎毒性通常是可逆的，因?yàn)槟I臟近曲小管的細(xì)胞可以增殖并修復(fù)，而耳毒性造成的耳蝸毛細(xì)胞受損為不可逆性。AmAn可能通過觸發(fā)不同的凋亡信號(hào)損害耳蝸外毛細(xì)胞[19]。此外，與位于耳蝸頂回處理低頻聲音的毛細(xì)胞相比，位于耳蝸底回處理高頻聲音的毛細(xì)胞更易受損[20]。因此，AmAn的使用需要對(duì)適應(yīng)癥進(jìn)行仔細(xì)的臨床評(píng)估。ROS現(xiàn)已被確定為AmAn引起聽力損失的主要因素。AmAn易積聚在毛細(xì)胞的線粒體中，慶大霉素直接抑制線粒體核糖體中蛋白質(zhì)的合成，并觸發(fā)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放[21]。AmAn在全身給藥后，可存在于內(nèi)耳組織中長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月或更久時(shí)間，進(jìn)入外毛細(xì)胞催化不飽和脂肪酸產(chǎn)生ROS[22]。以鏈霉素為例[8]，鏈霉素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與鐵鰲合，形成鏈霉素-鐵復(fù)合物，與電子供體不飽和脂肪酸(如花生四烯酸)發(fā)生反應(yīng)形成大量過氧化物陰離子和羥自由基，損傷線粒體膜性物質(zhì)，線粒體功能障礙又進(jìn)一步導(dǎo)致內(nèi)耳大量氧自由基產(chǎn)生和抗氧化物酶過度消耗，誘導(dǎo)耳蝸毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡或死亡。這也是臨床上使用鐵螯合劑(如去鐵胺和二羥基苯甲酸鹽)治療藥物性耳聾的原因，可減少耳毒性藥物對(duì)鐵的利用，實(shí)現(xiàn)對(duì)耳蝸組織的保護(hù)；此外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明[23]，在AmAn的暴露下，過量表達(dá)超氧化物清除酶的動(dòng)物較對(duì)照組表現(xiàn)出較少耳毒性。在新霉素誘導(dǎo)的耳毒性小鼠中，抗氧化劑芍藥苷通過抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）的激活，緩解線粒體凋亡途徑的失衡，達(dá)到降低細(xì)胞ROS水平，實(shí)現(xiàn)減少細(xì)胞凋亡，減低新霉素對(duì)耳蝸毛細(xì)胞損傷的作用[24]。這些研究證據(jù)直接或間接表明氧化應(yīng)激參與藥物性聾的發(fā)生。

順鉑在腫瘤細(xì)胞中充當(dāng)DNA交聯(lián)劑，其鉑原子與嘌呤堿基結(jié)合并抑制細(xì)胞增殖，從而使細(xì)胞周期失活并導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡[25]。經(jīng)靜脈注射順鉑后，在耳蝸組織中持續(xù)滯留時(shí)間可達(dá)數(shù)月甚至數(shù)年，而在其他組織器官中經(jīng)數(shù)天或數(shù)周即可被清除[26]。順鉑誘導(dǎo)耳蝸ROS的產(chǎn)生，不僅通過增加耳蝸特異性ROS產(chǎn)生酶，如NADPH氧化酶（NADPH oxidases，NOX）、黃嘌呤氧化酶的活性，還通過降低內(nèi)源性抗氧化酶系統(tǒng)的活性[27]，常見的機(jī)制包括[28]：①順鉑共價(jià)結(jié)合抗氧化酶的巰基，導(dǎo)致酶活性喪失；②超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH.Px)活化所必需的金屬輔助因子（如銅和硒等）丟失；③ROS增加需要消耗更多的抗氧化酶；④耳蝸內(nèi)抗氧化物酶GSH.Px和谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）活化必需的輔助因子過度消耗，如谷胱甘肽（glutathione，GSH），NADPH等。ROS增多最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死，抑制ROS可以改善聽力損失。暴露于順鉑的大鼠，其耳蝸顯示GSH耗盡，抗氧化酶（如SOD、GSH.Px、GR等）活性降低及脂質(zhì)過氧化證據(jù)增加[29]。在暴露于順鉑之前用抗氧化劑α-硫辛酸預(yù)處理可以顯著防止耳蝸細(xì)胞中ROS的積累并保護(hù)聽覺功能，且證實(shí)α-硫辛酸發(fā)揮保護(hù)作用是通過激活Nrf2/HO-1通路減輕內(nèi)耳損傷，而核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2正是細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的核心成員，不僅是調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，也是維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的中樞調(diào)節(jié)者[30]。

2.3 年齡相關(guān)性聾

年齡相關(guān)性聾（age-related hearing loss，ARHL）臨床上又稱老年性聾。聽力減退多從高頻聽力開始，并逐漸發(fā)展到中低頻聽力，累及言語(yǔ)頻率，與耳蝸從基底部到頂端的逐漸退變有關(guān)。ARHL的特征是雙耳對(duì)稱性緩慢聽力下降，其特點(diǎn)為聽覺敏感度和語(yǔ)言理解能力降低。受影響的耳蝸結(jié)構(gòu)主要包括血管紋及其脈管系統(tǒng)，螺旋韌帶纖維細(xì)胞，感覺毛細(xì)胞和聽覺神經(jīng)元。

老年性聾的病因是隨著年齡增長(zhǎng)的過程中所有可導(dǎo)致聽敏度下降因素的總和，如聽覺系統(tǒng)自然老化、噪聲暴露、使用耳毒性藥物、外傷、血管損傷、代謝變化、激素、飲食和免疫系統(tǒng)等多方面效應(yīng)的疊加[31]。氧化應(yīng)激在老年性聾發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用[32]。造成機(jī)體氧化和抗氧化失衡的原因?yàn)橹饕獊碜詢蓚€(gè)方面：一是隨著年齡增長(zhǎng)，內(nèi)耳ROS產(chǎn)生增多。線粒體作為ROS的主要來源在老化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[33]。這一理論得到了線粒體抗氧化基因SOD2或線粒體鐵調(diào)節(jié)蛋白Frataxin過度表達(dá)顯著增加果蠅壽命的觀察結(jié)果的支持[34]。衰老應(yīng)激中，線粒體DNA缺失或突變，從而導(dǎo)致ROS過度累積，而過量積累的ROS攻擊靶點(diǎn)線粒體：①影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物的活力，使線粒體氧化磷酸化合成ATP的功能受損；②引起線粒體膜結(jié)構(gòu)上蛋白質(zhì)和脂質(zhì)過氧化，改變生物膜通透性，釋放Ca2+和細(xì)胞損傷因子，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[35]。ROS增多和線粒體損傷互為因果。導(dǎo)致失衡的另一個(gè)原因是隨著年齡增長(zhǎng)，機(jī)體組織清除ROS的能力逐漸下降[36]。內(nèi)源性抗氧化劑GSH隨年齡增長(zhǎng)其合成減少。Jiang等[37]以CAB/J衰老雄性小鼠作為研究對(duì)象，通過對(duì)超氧化物歧化酶和凋亡誘導(dǎo)因子進(jìn)行組織化學(xué)分析和蛋白免疫印跡檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其在Corti’s器和螺旋神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)隨著年齡的增長(zhǎng)而減少。發(fā)現(xiàn)相較于3月齡年輕Fischer344大鼠，24個(gè)月齡的老年大鼠，其聽神經(jīng)細(xì)胞中GSH表達(dá)水平降低了86%[38]。一些研究已經(jīng)在與老年性耳聾相關(guān)的ROS信號(hào)基因中尋找基因變體，但尚未確定[39]。然而，易受氧化應(yīng)激影響的動(dòng)物模型顯示出一系列與衰老相關(guān)的表型：阻斷編碼銅/鋅超氧化物歧化酶1的表達(dá)可加速ARHL的發(fā)病[40]，線粒體過氧化氫酶的過度表達(dá)則可減少DNA氧化損傷和毛細(xì)胞丟失，并防止ARHL[41]。基于耳蝸組織對(duì)ROS的反應(yīng)性，一些研究小組試圖通過添加外源性抗氧化劑預(yù)防或改善ARHL。抗氧化劑包括直接抗氧化劑比如α-硫辛酸、N-乙酰半胱氨酸和輔酶(Co)Q10,可以直接跟ROS反應(yīng)降低氧化應(yīng)激；間接抗氧化劑，如酚類化合物和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),可以激活細(xì)胞氧化還原酶[42]。但治療結(jié)果各不相同，可能是由于抗氧化劑劑量或輸送方式的差異造成。氧化失衡確實(shí)參與了老年性耳聾的發(fā)生發(fā)展。

2.4 突發(fā)性感音神經(jīng)性耳聾

突發(fā)性感音神經(jīng)性耳聾（sudden sensorinural hearing loss，SSNHL）的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，因無法進(jìn)行組織病理學(xué)檢查使其病因?qū)W研究受到限制。近年來，研究者將注意力集中在耳蝸微循環(huán)上，由于供給內(nèi)耳血液的迷路動(dòng)脈是末梢動(dòng)脈，血液黏度增加或者內(nèi)皮功能障礙均會(huì)影響耳蝸血流灌注導(dǎo)致Corti’s器官功能障礙[43]。研究強(qiáng)調(diào)了氧化應(yīng)激作為不同血管疾病中微血管損傷的風(fēng)險(xiǎn)因素。Becatti等[44]首次研究紅細(xì)胞氧化應(yīng)激與SSNHL患者血液粘度增加的相互關(guān)系，發(fā)現(xiàn)SSNHL患者的紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生了顯著改變，膜脂質(zhì)過氧化水平和細(xì)胞內(nèi)ROS生成水平升高，認(rèn)為ROS誘導(dǎo)的紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能改變參與SSNHL病理過程，這可能是一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。另外，氧化應(yīng)激與內(nèi)皮功能障礙之間的關(guān)系也已在多項(xiàng)研究中得到證實(shí)[45]。當(dāng)ROS過量時(shí)，會(huì)耗盡細(xì)胞內(nèi)的NO水平，增加粘附分子（P-選擇素）、脂質(zhì)炎癥介質(zhì)（如血小板活化因子、白三烯B4）和細(xì)胞因子（如IL-8）的表達(dá)，從而導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[46]。2019年，美國(guó)SSNHL臨床實(shí)踐指南中，在建議不使用的干預(yù)措施列表中將抗氧化劑刪除[47]，表明抗氧化劑在治療SSNHL方面可能具有潛在價(jià)值?？寡趸瘎㎞-乙酰半胱氨酸聯(lián)合地塞米松可能通過保護(hù)毛細(xì)胞提高SSNHL患者的聽力恢復(fù)率[48]；同樣，一項(xiàng)臨床試驗(yàn)[49]表明，補(bǔ)鋅可通過降低耳蝸的氧化應(yīng)激促進(jìn)SSNHL患者的聽力恢復(fù)。盡管在SSNHL患者中發(fā)現(xiàn)存在氧化劑-抗氧化劑失衡的證據(jù)，但抗氧化劑作為治療靶點(diǎn)及作用機(jī)制尚難以闡明。

綜上所述，活性氧相關(guān)的組織損傷是導(dǎo)致聽力損失的途徑之一，但目前許多觀點(diǎn)尚不能達(dá)成一致，未來的研究依賴于更精準(zhǔn)的分析，包括代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等，以充分了解聽力損失的發(fā)生機(jī)制。已經(jīng)明確的是，抗氧化治療對(duì)噪聲、機(jī)體老化和耳毒性藥物引起的聽力損失具有一定防治作用。但是全身應(yīng)用抗氧化劑不具備靶向性，且可能干擾其他組織細(xì)胞的正常氧化和抗氧化平衡。故抗氧化治療選擇何種藥物、如何聯(lián)合用藥及探索最佳給藥方式等將成為以后研究的主要方向。