睡蓮研究現(xiàn)狀及展望

劉子毓 楊光穗 奚良 諶振

（1. 海南大學(xué)園藝學(xué)院 海南海口 570208；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室 海南?？?571101；3. 海南省熱帶觀賞植物種質(zhì)創(chuàng)新利用工程技術(shù)研究中心 海南儋州 571737）

睡蓮是研究被子植物起源與演化的重要物種[1]。20世紀以來，睡蓮的組織培養(yǎng)、跨亞屬育種及生理生化的研究加速，世界各國開始大量引種，并對其適應(yīng)性、多樣性進行評估調(diào)查，加強新品種引種、培育和推廣，培育代表性睡蓮品種。當前對睡蓮調(diào)控分子機制的研究更加深入，隨著睡蓮全基因組的相繼報道，有關(guān)學(xué)者深入挖掘睡蓮調(diào)控因子，各類機制逐漸清晰。睡蓮除自身的觀賞價值以外，產(chǎn)物和環(huán)境保護功能日益受到重視，應(yīng)用范圍不斷擴大[1-2]。

1 種質(zhì)資源與多樣性

1.1 睡蓮的資源與分布

睡蓮為睡蓮科（Nymphaeaceae）睡蓮屬（Nymphaea）植物通稱，全屬植物有80余種（包含變種），睡蓮廣泛分布在除南極洲外的各個大陸[3]。澳洲亞屬主要分布于澳洲東北部，花型較大；古熱帶亞屬分布于南亞和東南亞及非洲；新熱帶亞屬主要分布于中美洲；耐寒亞屬廣泛分布于各大洲溫帶，花型較小，香味較淡；廣熱帶亞屬廣泛分布于各大洲，顏色類型眾多，部分品種有獨特的“胎生”繁殖方式。原生種有5種原產(chǎn)于我國，即白睡蓮（N. albaL.）、雪白睡蓮（N.candidaC. Presl）、睡蓮（N. tetragonaL.Georgi）、柔毛齒葉睡蓮（N. lotusL.var. pubescens）和延藥睡蓮(N. stellataL. Burmann)[4-6]。海南省地處熱帶，是重要的睡蓮繁育種植基地[7-8]。

1.2 睡蓮的分類研究

早期研究中的睡蓮物種鑒定分類以形態(tài)特征為基礎(chǔ)。當前睡蓮屬植物分類方法分為2類，一是根據(jù)種群地理演化推論，以地區(qū)生態(tài)型將睡蓮屬植物分為熱帶睡蓮和耐寒睡蓮兩大類，5個亞屬—廣溫帶睡蓮亞屬、廣熱帶睡蓮亞屬、古熱帶睡蓮亞屬、新熱帶睡蓮亞屬、澳大利亞睡蓮亞屬[9]；二是基于形態(tài)特征—心皮的離生或聚合[10]?？筛鶕?jù)心皮排列方式將睡蓮屬植物分為：離生心皮組和合生心皮組[11-12]?；谛螒B(tài)特征的離生合生心皮分類方法，一級分類標準是心皮的離生或聚合，但睡蓮屬植物的雌蕊都是聚合心皮，實際上心皮的離生或聚合是指心皮側(cè)壁是否彼此分離；此標準中花柱為心皮背縫線和腹縫線末端延伸長出的附屬物，并不具備傳粉受精后運輸受精卵的功能，并不能稱之為花柱。

現(xiàn)在研究人員更傾向于用分子手段得到更精確的分子證據(jù)來研究睡蓮的系統(tǒng)發(fā)育。劉艷玲等[13]進行ITS序列分析建樹，張海平[14]基于形態(tài)學(xué)分類，皆將睡蓮屬分成4支；熱帶睡蓮單獨構(gòu)成1支，其內(nèi)部仍可分為2支，1支是以廣熱帶睡蓮為代表的廣熱帶晝開夜閉型睡蓮，另一支為以古熱帶睡蓮為代表的夜開晝閉型睡蓮，這與基于形態(tài)特征對睡蓮屬植物進行的分類結(jié)果一致。同時ITS區(qū)的分析結(jié)果也與二者的地理分布格局較為一致。耐寒睡蓮植物以100%的支持率聚在一起構(gòu)成單系類群。黃祥等[15]基于葉綠體密碼子RSCU構(gòu)樹將20種睡蓮分為3支[15]。Borsch等[16]對睡蓮trnT-trnF的組合分析分為8個亞屬。CORNELIA CORNELIA等[17]基于葉綠體系統(tǒng)發(fā)育將睡蓮分為5個亞屬。毛立彥等[18]對睡蓮葉綠體基因組密碼子構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，支持2支論的觀點。楊亞涵[19]對睡蓮種質(zhì)資源進行ISSR-PCR擴增，證明睡蓮種質(zhì)資源有著廣泛且多樣的演化路徑和遺傳多樣性。

2 睡蓮的無性繁殖

睡蓮屬植物的開花習(xí)性為雌蕊先熟，自然隔離使本屬植物多為異花授粉。睡蓮屬植物無性繁殖能力強，睡蓮塊莖進行繁殖形成無性系，極少部分熱帶睡蓮還能通過花胎生、葉胎生、走莖繁殖形成自己的無性系植株[20]。胎生可使其種群在較短時間內(nèi)快速傳播和擴散，適應(yīng)多變的自然環(huán)境[21]。

目前生產(chǎn)實踐中最普遍使用的是塊莖繁殖。塊莖繁殖，主要是耐寒睡蓮，有Marliac型、Odorata型及Tuherosa型，在生長季進行分株繁殖，大部分品種繁殖系數(shù)高。球莖繁殖，主要是熱帶睡蓮，越冬后春天在菠蘿型球莖的頂端分生出許多小苗，待小苗生根后分株繁殖，有些種類在老球莖的基部生成許多小球莖，將球莖分開種植可形成新植株。走莖繁殖，是指部分夜間開花睡蓮在生長旺季，老莖側(cè)生出水平生長的新根狀莖。這些分生出的小苗可以分離栽植[22]。睡蓮分株通常于早春發(fā)芽前挑選有新芽的根莖，切成7~8 cm的小段，進行栽植。實際生產(chǎn)中將用于種植的睡蓮種苗（球莖/塊莖），種植前清理和清洗干凈，剪除老根；采用0.1%的多菌靈浸泡消毒處理，使生長點與泥面持平，放入水田中，水深保持至生長點以上5~10 cm。

利用外植體進行組織培養(yǎng)可實現(xiàn)睡蓮的快速高效繁殖，相比傳統(tǒng)繁殖方法能更快更優(yōu)地獲得所需植株。外植體的接種是指把經(jīng)過表面消毒處理的材料切割后轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基上的過程。此過程在無菌條件下進行，主要包括修剪切割和接種2個過程。戚華沙等[23]以睡蓮根莖、種子做外植體，成功率均達到75%以上。在此基礎(chǔ)上，孫春青等[24]用幼胚做外植體，獲得了最佳外源激素配比。此外，楊夢飛等[25]以不同試劑處理睡蓮花粉，發(fā)現(xiàn)柱頭液最適合花粉萌發(fā)，萌發(fā)率最高。黃秋偉等[26]發(fā)現(xiàn)，紅色系Lotus亞屬睡蓮色素能夠促進胎生睡蓮芽點萌發(fā)，達到快速繁殖。

3 睡蓮新品種育種

睡蓮育種起源于19世紀，如Conard[27]培育百余種耐寒睡蓮。20世紀以來，美國、泰國[28-29]也培育出眾多新品種，如萬維莎等，仍受到廣大消費者的喜愛。睡蓮育種以傳統(tǒng)雜交育種為主，誘變、基因編輯技術(shù)等也逐漸得以應(yīng)用。

3.1 雜交育種

近些年來我國育種家取得了許多成果，如吳倩等[30]人工雜交選育而成的新品種粉瑪瑙，楊寬等[31]選育出新品種婚紗。我國青年育種家李子俊[32]培育出新品種金平糖、櫻桃轟隆。

熱帶睡蓮與耐寒睡蓮染色體數(shù)目存在差異，跨亞屬雜交難以成功。隨著國內(nèi)外育種人不斷對跨亞屬睡蓮培育進行嘗試，不同睡蓮雜交親和性也逐漸得到驗證[33]。通過大規(guī)模雜交實驗，將廣熱帶睡蓮?fù)秃彶粩噙M行雜交授粉。我國青年育種家李子俊[32]培育出我國首個跨亞屬品種偵探艾麗卡深受消費者喜愛。歐克芳等[34]培育出紫紅色中大型跨亞屬雜交睡蓮紫妍，花型較大，顯著區(qū)別于其他睡蓮 。

3.2 誘變育種

除此之外，誘變育種成果顯著，李淑娟等[35]用秋水仙素處理走莖，獲得倍性變異植株。張啟明等[36]通過輻照得到花量減少花色改變的變異新種；史明偉等[37]用60Co-γ輻照睡蓮獲得了變異植株。劉鵬等[38]以0.25%秋水仙素處理睡蓮種子12 h，成功獲得四倍體植株，誘導(dǎo)率最高為100%，成活率88%。近年來睡蓮轉(zhuǎn)基因育種也取得進展，Yu等[39]通過花粉管通道法構(gòu)建了熱帶睡蓮轉(zhuǎn)基因體系，并通過將CodA基因轉(zhuǎn)入熱帶睡蓮株系，提高了睡蓮的耐寒性，使睡蓮地下莖獲得低溫抗性。

4 睡蓮的分子研究

4.1 揮發(fā)物研究

花朵揮發(fā)物成分作為一類遺傳性狀，反映了物種的遺傳規(guī)律。睡蓮作為基部被子植物類群之一，對揮發(fā)物組成的研究，有助于明確被子植物蟲媒特性演化過程。袁茹玉[40]對睡蓮花的揮發(fā)性釋放部位進行研究發(fā)現(xiàn)，揮發(fā)物釋放量從多到少順序依次為雄蕊、花瓣、雌蕊，雄蕊釋放的揮發(fā)物最多，在熱帶睡蓮中幾乎可達到70%，在耐寒睡蓮中可達到90%，明確了睡蓮揮發(fā)物質(zhì)的產(chǎn)生部位。Zhou等[41]將GC-MS結(jié)果同睡蓮電鏡結(jié)構(gòu)進行比對發(fā)現(xiàn)，不同睡蓮中花香物質(zhì)揮發(fā)部位有所不同。通過鏡下觀察，推測花瓣中的滲透性基質(zhì)顆粒與香氣的形成有一定的關(guān)系，是香氣釋放的物質(zhì)基礎(chǔ)。

睡蓮揮發(fā)物有別于其他常見芳香植物，含帶有玫瑰和果香感的癸酸甲酯[42]。新熱帶亞屬睡蓮有特殊的辛香味揮發(fā)物，主成分是茴香醚[43]。黃秋偉等[44]對睡蓮揮發(fā)油成分進行研究，確定主成分為十五或十七烷。石凝等[45]對睡蓮鮮花精油的成分與含量進行了鑒定和分析，發(fā)現(xiàn)炔烴、烷烴、烯烴、醇和酮類化合物是主要成分，8-十六烯的相對含量最高。熱帶睡蓮和耐寒睡蓮花朵揮發(fā)物中的相對含量及揮發(fā)物種類均存在明顯差異，2種生活型睡蓮共有花香成分13種，其中烯烴類8種[46]。研究結(jié)果明確了睡蓮揮發(fā)物結(jié)構(gòu)功能的對應(yīng)關(guān)系，為睡蓮香氣物質(zhì)的開發(fā)利用提供了基礎(chǔ)資料。

4.2 花色苷研究

近年花瓣花色素苷合成研究進展迅速。睡蓮中花色素苷的合成途徑較明確。在花色素組成、花色素生物合成途徑等方面鑒定出花色素成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，可明確花色形成過程與分子調(diào)控機制。朱滿蘭等[47]以耐寒睡蓮不同花色的119個栽培品種為材料，利用高效液相色譜和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測定了其花瓣中的花青素苷成分，發(fā)現(xiàn)8種獨立于其他物種的花色苷，即Dp3Ga5acetyIGa)、Dp3Rh(1-2)Ga、Cy3Ga(1-2)Ga、Cy3acetylGa(1-2)Ga、Cy39alloylGa、Dp3acetylG、Dp3G和Cy3GaGaGa。田潔[48]也在睡蓮泰國王花瓣中克隆到1個R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子，并對其調(diào)控藍色花形成的功能進行了初步驗證。Wu等[49]使用高通量測序技術(shù)對藍色熱帶睡蓮品種“暹羅王”睡蓮的2個不同著色階段的花瓣進行Transcriptome分析，得出127個Unigene可被鑒定為其他物種顏色相關(guān)基因的推定同源物，其中包括28個上調(diào)的Unigene和5個下調(diào)的Unigene，確定了黃酮類化合物的組成和與藍色形成相關(guān)的代謝途徑，選擇黃酮類化合物代謝途徑的候選物，從而誘導(dǎo)花瓣的顏色形成，提供了關(guān)于睡蓮花色形成過程的研究基礎(chǔ)。目前可通過導(dǎo)入細胞色素基因，促進花色苷合成關(guān)鍵基因大量表達[50-51]，為分子層面調(diào)控花色，提供了理論可行性。

5 睡蓮的基因研究

5.1 基因組研究

無油樟目（Amborellales）、木蘭藤目（Austrobaileyales）以及睡蓮目（Nymphaeales），三者被合稱為被子植物早期分化類群。關(guān)于睡蓮的具體演化定位，Zhang等[42,52]測定睡蓮的全基因組，測得睡蓮演化分支時間晚于無油樟，證實睡蓮并非最早的被子植物分化類群，基因組共線性揭示了睡蓮中全基因組重復(fù)（WGD）事件，通過睡蓮?fù)椿驅(qū)Φ腒s分布，確定睡蓮目古多倍化的可能發(fā)生位置，復(fù)制事件發(fā)生在睡蓮科與莼菜科分化之后。通過鑒定睡蓮的MADS-box基因證實花器官發(fā)育ABCE模型并非嚴格對應(yīng)，睡蓮中AG基因具有2個拷貝AGa和AGb，分別在雄蕊和心皮中高表達，此外AGb同時還在花瓣和萼片中表達，說明睡蓮中的2個AG基因發(fā)生了亞功能化以及新功能化。當下被子植物的嚴格ABCE模型是隨著被子植物不斷演化逐漸交叉形成的[53]。羅火林[54]發(fā)掘出睡蓮花器官發(fā)育的AP2和AGL6基因，原應(yīng)控制花萼與花瓣的基因也能影響雄蕊與心皮的形成，提出睡蓮花器官發(fā)育的假定模型。確定ABC模型在被子植物起源的早期形成并發(fā)揮作用。以上研究證實了睡蓮作為基部被子植物有著獨特的演化類型和演化結(jié)果。

5.2 基因家族研究

在睡蓮抗逆抗病機制研究上。葉方婷等[55]鑒定睡蓮bZIP家族基因，發(fā)現(xiàn)其在莖、葉、花及雄蕊中具有表達特異性。莖葉中存在更多低溫響應(yīng)抗性元件，雄蕊和花瓣中存在更多應(yīng)對生物脅迫和干旱的MeJA響應(yīng)元件及ABA響應(yīng)元件。對bZIP成員啟動子的順式調(diào)控元件進行分析發(fā)現(xiàn)，NcbZIP成員可能受到茉莉酸甲酯和ABA的調(diào)控。

潘鑫峰等[56]鑒定出69個NcWRKY轉(zhuǎn)錄因子，分為3個亞家族。WRKY成員上在14條染色體上均有分布，起到調(diào)控茉莉酸甲酯的功能。對基因家族成員在不同組織中的表達量分析，篩選出在成熟葉柄中高表達的NcWRKY04與NcWRKY18；在花瓣中高表達的NcWRKY05和在雄蕊中高表達的NcWRKY61。在WRKY轉(zhuǎn)錄因子如何在啟動子層面調(diào)控植物的生長和發(fā)育過程，建立一個全面的WRKY信號和轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

莊瀅玉[57]發(fā)現(xiàn)，NBS-LRR基因家族雖然擁有較多的成員，但其表達量卻普遍最低，推測該類基因需在外界刺激或者脅迫作用下才會表達。對上游序列進行了順式作用元件預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其存在著大量和生長素、赤霉素反應(yīng)等相關(guān)的響應(yīng)元件，暗示基因具有效應(yīng)基因啟動子，并能通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而調(diào)控這些功能基因的起始轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄效率，引起一系列生理生化反應(yīng)和響應(yīng)基因的表達。

5.3 結(jié)構(gòu)基因研究

除了對功能基因進行解析之外，也對結(jié)構(gòu)基因展開研究。Chaipanya等[58]發(fā)掘出睡蓮花瓣類黃酮合成途徑中結(jié)構(gòu)基因F3H，其在花瓣和雄蕊中大量表達，影響花朵的花青素積累。吳倩[59]在睡蓮泰國王花瓣中克隆了類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶基因（NnGT6），并對其功能進行了驗證發(fā)現(xiàn)，該酶對花色素等均具有催化活性，促進藍紫色花的形成。Zhang等[42]比較藍色花和白花變種花瓣中存在差異的基因表達，推測花青素合酶基因（NC9G0274510）和類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶基因（NC8G0218160）是其花色形成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因。

陳凱利等[60]從睡蓮葉片和花瓣中克隆了ANS（植物花青素合成酶）的基因序列、啟動子和編碼區(qū)序列，對該基因序列在睡蓮不同花色發(fā)育時期的花瓣和不同組織部位表達進行分析，并針對啟動子序列進行了順式作用元件分析，預(yù)測上游調(diào)控因子，為深入研究該基因的功能和睡蓮的花色形成分子調(diào)控機理奠定基礎(chǔ)。蘇群等[61]對葉胎生睡蓮轉(zhuǎn)錄組進行研究，得到4個葉胎生發(fā)育轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)掘出主要參與到植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙烷類生物合成、氨基酸類代謝的差異表達基因，詮釋了葉胎生的發(fā)育機制。

6 展望

睡蓮作為極具代表性的觀賞型水生花卉，中國睡蓮育種僅有20年的歷史，在種質(zhì)資源收集、育種優(yōu)化、轉(zhuǎn)基因和誘變育種方面取得了一定進展。利用外植體進行組織培養(yǎng)逐步實現(xiàn)睡蓮的快速高效繁殖，逐步理清最佳激素配比，形成一套相對規(guī)范、可操作性強的栽培種植方法。除傳統(tǒng)的雜交育種外，通過轉(zhuǎn)基因和誘變劑獲得多倍體新植株，相比傳統(tǒng)繁殖方法能更快更優(yōu)地獲得所需植株，出現(xiàn)了更多豐富的品種可供研究。在關(guān)鍵性狀上，分子研究明晰了睡蓮花色素組成、花色素生物合成途徑，明確花色形成過程與分子調(diào)控機制，導(dǎo)入色素基因，誘導(dǎo)花色形成。通過揮發(fā)物研究分析了睡蓮香氣的組成，明確了睡蓮揮發(fā)物結(jié)構(gòu)功能的對應(yīng)關(guān)系，探明主要的香氣載體。

睡蓮基因組序列的破譯為研究睡蓮進化與功能基因組學(xué)分析提供了基礎(chǔ)，證實了睡蓮作為基部被子植物有著獨特的演化類型和演化結(jié)果。在睡蓮基因組中鑒定出不同基因家族成員，進一步分析其理化性質(zhì)、系統(tǒng)進化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、染色體定位、基因復(fù)制事件等，在啟動子層面調(diào)控植物。除了對功能基因進行解析之外，也對結(jié)構(gòu)基因展開研究，已經(jīng)發(fā)掘出睡蓮花瓣類黃酮合成途徑中結(jié)構(gòu)基因及植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙烷類生物合成、氨基酸類代謝的差異表達基因。

睡蓮大規(guī)模栽培經(jīng)驗少，在育苗選擇、苗期管理、定植及日常管理方面缺乏清晰明確的操作規(guī)范。當前關(guān)于睡蓮基因家族分析多聚焦于睡蓮抗逆性機制，結(jié)構(gòu)基因研究多集中在花色花香，對于病害機制缺乏深入研究。睡蓮產(chǎn)物開發(fā)前景廣闊，市場潛力巨大。但睡蓮仍未納入國家藥食同源植物名單，制約著后期產(chǎn)品的開發(fā)與推廣。對于睡蓮的開發(fā)應(yīng)落在產(chǎn)物的具體應(yīng)用上，盡早投入社會，實現(xiàn)睡蓮產(chǎn)業(yè)的全面發(fā)展。