TRIML1對肝癌細胞惡性生長的影響①

吳 憲 徐 哲 偏麗麗 趙 敏 李 濤 張紀巖

(安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科,合肥 230022)

肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的惡性腫瘤之一,每年大約都會發(fā)現(xiàn)有超過五十萬名成人死于肝癌。盡管HCC的診斷和治療有一定進展，但由于耐藥和易于復發(fā)，HCC在很大程度上仍然無法治愈[1-3]。肝癌發(fā)生機制多種多樣，具體分子機制尚不完全清楚，其中炎癥是肝癌發(fā)生的關鍵因素[4]。此外，有研究證明，自分泌的IL-6會促進惡性腫瘤細胞生長[5,6]?，F(xiàn)代醫(yī)學主要研究手術切除腫瘤、放化療、血管腫瘤介入綜合治療等手術方法，但治療效果并不理想，年平均生存率僅8%～10%[7,8]。因此研究人類肝癌早期發(fā)生及其發(fā)展的主要分子機制，對于不斷尋求新的肝癌治療療法等也有著深遠的現(xiàn)實意義。

Tripartite motif family-like 1(TRIML1)編碼一種與TRIM家族高度相似的蛋白，區(qū)別在于TRIML1缺少B-box域。TRIML1最初發(fā)現(xiàn)于小鼠胚胎中，在小鼠胚胎發(fā)育的兩個細胞胚胎到囊胚階段均有表達[9]。TRIML1可與USP5相互作用，而USP5可以促進肝癌的發(fā)生發(fā)展[10]。此外，有文獻報道，TRIM家族在許多類型的癌癥中發(fā)揮重要作用[11-13]，其中TRIM11、TRIM31、TRIM52和TRIM59等可以促進肝癌細胞的發(fā)生發(fā)展[14-18]；TRIM16，TRIM26和TRIM50等可以抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展[19-21]。本團隊前期Huh7肝癌細胞基因芯片實驗結果表明，在Huh7細胞中有TRIML1的表達。由此，本次實驗將探究TRIML1在肝癌細胞中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑及動物 胎牛血清，DMEM和F12購自美國HyClone公司；RIPA 蛋白裂解液和MTT細胞增殖分析試劑盒購自碧云天生物公司；LipofectamineTM2000轉染試劑盒購自美國Gibco 公司；LipofectamineTMRNA iMaX Reagent購自美國Invitrogen公司；TRIML1抗體購自美國Proteintech 公司；GFP抗體購自日本MBL公司；GAPDH(glyceralde-hyde-3-phosphate dehydrogenase) 抗體購自美國Santa Cruz 公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠和山羊抗兔IgG二抗購自北京中杉金橋公司；ECL發(fā)光液購自美國Thermo公司；人IL-6(hIL-6)ELISA 試劑盒購自美國Abcam 公司；X光片、顯影液、定影液購自美國Kodak 公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；pEGFP-N1質粒和TRIML1-pEGFP-N1質粒為本實驗室構建存放；Agar購自美國Sigma公司；蛋白Marker購自GenStar公司；G418購自Invitrogen公司；CCK8試劑盒購自美國Biotool公司；siRNAs由GenePharma公司合成；6～8周齡BALB/c雄性裸鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.1.2儀器設備 CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo 公司；低溫高速冷凍離心機購自德國Eppendorf公司；酶標儀購自瑞士Tecan sunrise 公司；紫外分光光度計購自北京普析通用儀器有限責任公司；SDS-PAGE 蛋白電泳及轉印儀購自美國Bio-Rad 公司；游標卡尺購自桂林精宓量具量儀有限責任公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 本次實驗以HepG2和Huh7肝癌細胞為研究對象。肝癌細胞采用含10 %胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基(含100 U/ml青霉素鈉和100 U/ml硫酸鏈霉素)培養(yǎng)，37℃，5%CO2細胞孵箱中培養(yǎng)，待細胞長到80%左右，0.9%生理鹽水洗3次，0.25 %胰酶消化1 min，含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，2 000 r/min離心5 min，棄上清，重懸，計數(shù)，傳代，用于后續(xù)實驗操作。

1.2.2篩選TRIML1過表達細胞株 正常HepG2細胞接種到6孔板上，生長到40%～60%時，分別轉染pEGFP-N1質粒和TRIML1-pEGFP-N1質粒，轉染24 h后加入G418的完全培養(yǎng)基進行篩選，G418工作濃度為600 μg/ml。G418篩選2周后，細胞基本不再死亡，流式分選帶有GFP綠色熒光的細胞，即得到過表達TRIML1和GFP空載的穩(wěn)定細胞株，擴大培養(yǎng)凍存液氮用于后續(xù)試驗。

1.2.3繪制細胞生長曲線 將生長狀態(tài)良好的穩(wěn)定過表達TRIML1的HepG2肝癌細胞和穩(wěn)定表達GFP空載的對照HepG2肝癌細胞的細胞濃度調整為3×104個/ml，96孔板每孔加100 μl，即96孔板每孔種3×103個/ml的細胞，每組細胞設8個復孔。96孔板在37℃、5%CO2細胞孵箱中培養(yǎng)。分別在細胞鋪到96孔板的0、24、48和72 h加入CCK8試劑，每孔10 μl，37℃孵育0.5～4 h，直至培養(yǎng)液變?yōu)殚冱S色，酶標儀檢測450 nm處的OD值，計算平均值，繪制細胞生長曲線。

1.2.4軟瓊脂克隆形成 分別取0.6 g和1.2 g Agar溶解于100 ml雙蒸水中，高壓滅菌制備0.6%Agar和1.2%Agar，4℃冰箱保存，使用前微波爐加熱融化。按照4.5 ml∶4.5 ml∶1 ml的比例將2×DMEM，1.2%Agar和血清混合制備下層膠，混合過程要輕柔，避免產生氣泡，動作要迅速，防止凝膠凝固。6孔板每孔加入1.5 ml混合液，輕搖使其鋪勻，4℃促凝20 min。促凝期間，將生長狀態(tài)良好的穩(wěn)定過表達TRIML1的HepG2肝癌細胞和穩(wěn)定表達GFP空載的對照HepG2肝癌細胞的細胞濃度調整為1×104個/ml備用，再將細胞調整為103個/ml，制備細胞懸液。按照1.4 ml∶1.4 ml∶0.35 ml∶0.35 ml的比例將2×DMEM、0.6 %Agar、血清和細胞懸液混合制備上層膠，混合過程要輕柔，避免產生氣泡。6孔板每孔加入1 ml混合液，輕搖使其鋪勻，4℃促凝20 min。上層膠充分凝固后，6孔板每孔加入1 ml含10 %胎牛血清的1×DMEM完全培養(yǎng)基。37℃、5%CO2細胞孵箱中培養(yǎng)2～3周，棄去上層培養(yǎng)基，每孔加入1 ml MTT，37℃孵育4 h觀察集落形成。

1.2.5裸鼠成瘤實驗 取適應性飼養(yǎng)1周后的裸鼠8只，取生長狀態(tài)良好的穩(wěn)定過表達TRIML1的HepG2肝癌細胞和穩(wěn)定表達GFP空載的對照HepG2肝癌細胞，將細胞密度調整為1×107個/ml，分別皮下接種于裸鼠的左、右前肢腋下，200 μl/只。從細胞注射開始，每天觀察裸鼠生長情況和成瘤狀況，用游標卡尺測量瘤子的長短經，計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。1只死亡，1只未成瘤。第17天處死裸鼠，分離瘤體并稱重。

1.2.6Western blot 蛋白表達 將生長狀態(tài)良好的穩(wěn)定過表達TRIML1的HepG2肝癌細胞和穩(wěn)定表達GFP空載的對照HepG2肝癌細胞按5×105個/孔接種到6孔板中，37℃、5%CO2細胞孵箱中培養(yǎng) 24 h。利用RIPA蛋白裂解液獲得蛋白樣品，用紫外分光光度計調整蛋白濃度，加入4×上樣緩沖液，100℃水浴10 min使蛋白充分變性，-20℃凍存。準備10%聚丙烯酰胺凝膠，上樣，電泳分離后轉印至PVDF膜上。5 %脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗(TRIML1，GFP和GAPDH)4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜 3次，每次15 min，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次15 min。ECL發(fā)光液涂于膜上暗室顯影。

1.2.7ELISA 法檢測細胞因子 將生長狀態(tài)良好的穩(wěn)定過表達TRIML1的HepG2肝癌細胞和穩(wěn)定表達GFP空載的對照HepG2肝癌細胞接種于24孔板中，2×105個/孔，每組設2個復孔，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，在實驗組細胞中加入鼠TNF-α，刺激8 h，對照組不加TNF-α，收細胞上清于-80℃冰箱凍存，用于后續(xù)ELISA檢測。按照ELISA試劑盒說明書操作，在酶標儀450 nm和570 nm 波長處讀取吸光度值，使用Prism軟件分析計算。

1.2.8小干擾RNA(siRNA)敲低TRIML1 Huh7肝癌細胞按2×105個/孔接種至12孔板中，培養(yǎng)24 h后，用LipofectamineTMRNA iMaX Reagent 轉染siRNAs。TRIML1 siRNA序列為：siRNA-806#5′-GCACAGATTGAGTCCTCAA-3′，siRNA-1071#5′-CCGACAACCCGGAAAGATT-3′與siRNA-1287#5′-GGGTCTCGTCACCTTTGAA-3′，以非靶點對照RNA(siRNA NC)為對照。轉染48 h后，收細胞上清用于ELISA，收蛋白用于Western blot驗證。

1.2.9懸浮培養(yǎng)spheres形成 Huh7細胞轉染48 h后，胰酶消化，計數(shù)，用DMEM/F12培養(yǎng)基(含20 ng/ml 表皮生長因子，10 ng/ml肝細胞生長因子，20 ng/ml成纖維細胞生長因子和1×B27)重懸細胞，調整濃度為1×103個/ml，再加入1%的甲基纖維素，防止細胞聚集，保證形成的spheres是來自單個的細胞。按照100個/孔將細胞接種至96孔低附板，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～14 d后，取出低附板計數(shù)直徑大于75 μm的spheres數(shù)，spheres形成能力用計得的spheres數(shù)/種的細胞數(shù)×100%表示。

2 結果

2.1過表達TRIML1穩(wěn)定株Western blot鑒定 分選帶綠色熒光的HepG2細胞后，利用Western blot鑒定。Western blot中，綜合內參GAPDH和TRIML1和GFP，認為分選得到的細胞為過表達TRIML1穩(wěn)定株(圖1)。

2.2過表達TRIML1對細胞生長曲線的影響 兩組生長曲線均呈S型(圖2)，符合體外細胞培養(yǎng)的生長特點。培養(yǎng)24 h后，過表達TRIML1組的細胞數(shù)明顯高于對照組，并且持續(xù)到72 h，表明過表達TRIML1能促進HepG2細胞的體外生長。

2.3過表達TRIML1對HepG2細胞軟瓊脂克隆形成的影響 穩(wěn)定表達pEGFP-N1和TRIML1-pEGFR-N1的HepG2細胞在種入Agar瓊脂14 d后用MTT染色4 h可以觀察到，兩組均有集落形成，克隆數(shù)如圖3。過表達TRIML1的HepG2細胞集落形成數(shù)量明顯高于對照組。

圖1 過表達TRIML1 的HepG2混合穩(wěn)定株的鑒定Fig.1 Identification of HepG2 stable mixed-clones over-expressing TRIML1Note:1.Control cells;2.TRIML1 over-expressing cells.

2.4過表達TRIML1對HepG2細胞裸鼠成瘤能力的影響 成瘤過程中，1只裸鼠對照細胞未成瘤，1只裸鼠死亡。注射8 d后有明顯瘤塊形成，第17天實驗結束時，如圖4，過表達TRIML1組平均瘤體體積(3.655 0±0.156 3)cm3，明顯大于對照組瘤體體積(2.618 0±0.130 6)cm3。同時，過表達TRIML1組平均瘤體質量為(2.226 0±0.179 5)g，明顯大于對照組瘤體質量(1.106 0±0.205 8)g，證明過表達TRIML1能促進HepG2細胞的成瘤能力。

2.5過表達TRIML1對HepG2細胞分泌IL-6的影響 在穩(wěn)定表達pEGFP-N1和TRIML1-pEGFR-N1的HepG2細胞中加入小鼠TNF-α刺激8 h，設立未處理組。取細胞上清ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，過表達TRIML1細胞的人IL-6本底分泌量明顯高于對照組；TNF-α刺激8 h后，過表達TRIML1細胞的IL-6分泌量仍高于對照組(圖5)。

2.6TRIML1敲低對Huh7細胞生長及IL-6分泌的影響 為反向驗證TRIML1對于肝癌細胞分泌IL-6的影響，在Huh7細胞中利用siRNAs敲低TRIML1。Western blot驗證3種siRNAs均可敲低TRIML1(圖6)。收集細胞上清用于ELISA，顯示TRIML1敲低后，Huh7細胞IL-6的分泌量顯著下降(圖7)。懸浮培養(yǎng)spheres形成實驗中，敲低TRIML1也會抑制Huh7細胞的spheres形成(圖8)。

圖2 過表達TRIML1對HepG2細胞生長曲線的影響Fig.2 Effect of TRIML1 over-expression on growth curve of HepG2 cellsNote:

圖3 過表達TRIML1對HepG2細胞軟瓊脂克隆形成的影響Fig.3 Effect of TRIML1 over-expression on anchorage-independent growth of HepG2 cellsNote:

圖4 過表達TRIML1對HepG2細胞裸鼠成瘤能力的影響Fig.4 Effect of TRIML1 over-expression on in vivo tumor growth of HepG2 cells in nude miceNote:

圖5 過表達TRIML1對HepG2細胞分泌IL-6的影響Fig.5 Effect of TRIML1 over-expression on secretion of IL-6 in HepG2 cellsNote:

圖6 Huh7肝癌細胞敲低TRIML1的鑒定Fig.6 Identification of TRIML1 knockdown in Huh7 cells

圖7 敲低TRIML1對Huh7細胞分泌IL-6的影響Fig.7 Effect of TRIML1 knockdown on secretion of IL-6 in Huh7 cellsNote:

圖8 敲低TRIML1對Huh7細胞spheres形成能力的影響Fig.8 Effect of TRIML1 knockdown on sphere formation ability of Huh7 cellsNote:

3 討論

肝癌是最常見的惡性瘤之一，其預后差、易復發(fā)、致死率高和發(fā)病率高嚴重威脅人類的生活與健康。目前已知USP5是肝癌的促癌基因，可以促進肝癌的發(fā)生發(fā)展，而TRIML1可與USP5相互作用，其作用尚不清楚，而且TRIM家族與肝癌的關系極為密切。因此，通過探討TRIML1對肝癌細胞惡性增長的影響，希望為肝癌的防治提供新的依據(jù)。

在HepG2肝癌細胞中篩選過表達TRIML1穩(wěn)定株為后續(xù)實驗提供更好的研究對象。通過CCK8檢測到過表達TRIML1穩(wěn)定株的細胞生長增殖能力明顯高于對照組(P<0.01)；軟瓊脂集落形成情況可觀察到過表達TRIML1穩(wěn)定株的集落形成數(shù)明顯高于對照組(P<0.01)，證明TRIML1可以促進HepG2肝癌細胞的體外生長增殖。裸鼠成瘤實驗可觀察到，過表達TRIML1穩(wěn)定株組的裸鼠瘤體體積和重量明顯高于對照組，進一步證明TRIML1可促進HepG2肝癌細胞的體內生長增殖。有文獻報道，HepG2肝癌細胞自分泌IL-6，而自分泌的IL-6則會促進HepG2肝癌細胞惡性生長。因此，在肝癌細胞中分別過表達和敲低TRIML1，探究TRIML1對肝癌細胞分泌IL-6的影響。過表達TRIML1會促進HepG2細胞IL-6本底水平和TNF-α誘導的分泌均上升。而且，在Huh7肝癌細胞中敲低TRIML1，可以抑制Huh7細胞的spheres形成和IL-6的分泌，說明TRIML1促進HepG2細胞惡性生長可能與IL-6分泌量上升有關。

本研究表明TRIML1促進肝癌細胞惡性生長。TRIML1在肝癌細胞的遷移，侵襲以及藥物抗性中的作用還有待進一步研究。TRIML1作為一種最新發(fā)現(xiàn)的信號分子，其作用也還有待后期實驗。