金黃色葡萄球菌耐藥機制研究進展

李萍，許紅霞，孟葆林，曹旭東

金黃色葡萄球菌(簡稱金葡菌，staphylococcus aureus,SA)是一種廣泛存在于自然界、人體的化膿性病原菌，也是常見的與社區(qū)、醫(yī)院獲得性疾病相關的病原體。金葡菌侵入機體后產(chǎn)生多種毒素和毒力因子，逃避機體免疫系統(tǒng)的防御，引起局部和全身的浸潤性感染[1]。β-內(nèi)酰胺、大環(huán)內(nèi)酯類等藥物是治療金葡菌感染的常用抗生素，金葡菌對這些抗生素的耐藥性迅速增加，多種耐藥基因在金葡菌分離株中被頻繁報道，已被WHO確定為全球關注的重要問題。金葡菌的耐藥性除與相關的結(jié)合蛋白、基因表達調(diào)控等有關外，還與其黏附能力有關，由金葡菌引起的慢性生物膜相關感染通常會導致感染率和病死率顯著增加[2]。金葡菌對不同種類的抗生素有不同耐藥機制，使抗感染的治療復雜化。本文通過探討金葡菌耐藥機制，以期為金葡菌的致病性研究及治療提供參考。

1 青霉素結(jié)合蛋白(PBP)

1.1 PBP2a 傳統(tǒng)的β-內(nèi)酰胺類抗生素如青霉素、甲氧西林等在金葡菌感染中廣泛存在耐藥性。β-內(nèi)酰胺類抗生素中含有β-內(nèi)酰胺酶，能使青霉素或結(jié)構(gòu)相似的藥物失活，介導的耐藥性通常是窄譜的，該酶由blaZ基因編碼，blaZ基因維持在質(zhì)粒中[3]。β-內(nèi)酰胺類抗生素的抗菌活性還能通過與青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)共價結(jié)合，抑制PBP介導的細菌細胞壁合成的轉(zhuǎn)肽酶活性。PBPs是β-內(nèi)酰胺類抗生素的主要靶點，也是細菌細胞壁生物合成的重要物質(zhì)，在細菌的分裂期通過調(diào)節(jié)細胞壁合成發(fā)揮關鍵作用，確保細菌從母代向子代的分離[4]。每個金葡菌菌株均有4個核心基因組編碼的PBPs(PBP1～4)，PBP1在金葡菌中主要起轉(zhuǎn)肽酶的作用，PBP3與金葡菌的自溶有關，PBP4與金葡球菌β-內(nèi)酰胺類耐藥有關[5]。PBP2a因其對所有β-內(nèi)酰胺類藥物產(chǎn)生高水平和廣譜耐藥性而備受關注。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)對β-內(nèi)酰胺類耐藥是由PBP2a或PBP2′低親和力介導所致，其允許細菌在高濃度藥物存在下合成細胞壁，PBP2a和PBP2′分別由mecA和mecC基因編碼[6]。PBP2a的合成受轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子MecI和信號轉(zhuǎn)導蛋白MecR1的調(diào)控，MecI和MecR1基因編碼于葡萄球菌染色體盒元件SCCmec/mecA中[7]。MecI和MecR1分別與BlaI和BlaR1具有很高的蛋白序列相似性，可調(diào)節(jié)PBP2a表達的功能。因此，在MRSA的許多臨床分離株中，攜帶blaI和blaR1基因的質(zhì)?？删幋a調(diào)節(jié)PBP2a表達的蛋白質(zhì)[8]。不同金葡菌菌株中出現(xiàn)的耐β-內(nèi)酰胺類藥物模式表明，其潛在的耐藥機制是一種普遍的耐藥機制[9]。

1.2 PBP4 PBP4是金葡菌中的一種非必需的、低分子量青霉素結(jié)合蛋白，研究表明PBP4可介導金葡菌的高水平和廣譜β-內(nèi)酰胺耐藥，PBP4可在部分交聯(lián)的肽聚糖上進行酶活化，以非從頭開始的方式修復細菌肽聚糖缺陷，促進細胞壁的穩(wěn)定性[10]。Basuino等[11]研究顯示，在金葡菌菌株中，檢測到高頻率PBP4啟動子突變和圍繞PBP4活性位點的錯義突變，PBP4啟動子突變導致PBP4產(chǎn)生過量，進而促進細菌細胞壁的交聯(lián)；PBP4的活性是表現(xiàn)高水平β-內(nèi)酰胺耐藥的關鍵，而PBP4的錯義突變及其啟動子突變共同促進了β-內(nèi)酰胺的耐藥。Greninger等[12]學者對9種金葡菌子代菌株進行全基因組測序，以確定與第五代頭孢菌素類抗生素高度、mecA無關的耐藥相關的突變，其中5株來自5個不同親本菌株的頭孢他林耐藥株均產(chǎn)生了PBP4啟動子突變，而其中4個(80%)與編碼PBP4 Asn138殘基突變的PBP4單核苷酸多態(tài)性相關，結(jié)果顯示PBP4基因的錯義或其啟動子的突變與第五代頭孢菌素的耐藥性密切相關。研究表明，PBP4基因和啟動子突變共同對β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥性產(chǎn)生協(xié)同作用，PBP4與PBP2/2a的相互作用促進了對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性[13]。

2 mecA基因

mecA基因與β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性有關，mecA基因廣泛分布于多種葡萄球菌中，mecA基因表達受DNA結(jié)合蛋白MecI和信號轉(zhuǎn)導子MecR1調(diào)控，編碼青霉素結(jié)合蛋白PBP2a或PBP2′，對許多半合成青霉素(包括甲氧西林、萘菲林和苯唑西林)及大多數(shù)頭孢烯類藥物具有低親和力，與青霉素酶介導的耐藥性不同，mecA引起的耐藥性是廣譜的[14]。與天然PBPs相比，mecA基因產(chǎn)物通過降低β-內(nèi)酰胺介導的酶?；俾屎蛯Ζ?內(nèi)酰胺的親和力而產(chǎn)生耐藥性。在不同種類的葡萄球菌中已鑒定出mecA1和mecA2兩種mecA基因同源型[15]。mecA攜帶一種可移動的遺傳元件SCCmec，SCCmec高度多樣，迄今為止已識別出11種類型(I至XI)，它們在大小(從21 kb到67 kb)上存在差異，其抗藥性因SCCmec類型而異。該元件在葡萄球菌之間轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生廣譜β-內(nèi)酰胺耐藥。目前已知的SCCmec元件攜帶以下常見的基因復合物：orfX(便于SCCmec整合到金葡菌基因組的attB位點序列中)；5類mec盒基因(包括MecA、MecC、MecB及其位于MecA上游的調(diào)控蛋白MecR和MecI)；側(cè)翼插入序列元件(IS431和IS1272)；重組酶ccrA、ccrB和ccrC 3個同素型，ccr同素型之間的序列相似性<50%，負責SCCmec的切除和整合；SCCmec還可能包含其他基因結(jié)構(gòu)，如pT181和pUB110，這些結(jié)構(gòu)導致對其他非β-內(nèi)酰胺類藥物產(chǎn)生耐藥性；其他重金屬和抗生素抗性基因，如ars和blaZ等[16-17]。Greninger等[12]研究表明缺乏mecA基因的金葡菌菌株能發(fā)展成高水平的β-內(nèi)酰胺類抗藥性。

3 erm基因

以紅霉素為代表的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，通過與50S核糖體亞基的肽基轉(zhuǎn)移酶活性位點結(jié)合而抑制蛋白質(zhì)合成。金葡菌已對長期使用紅霉素者產(chǎn)生高度耐藥性。金葡菌對紅霉素耐藥的機制有兩點：一是通過erm(紅霉素抗性甲基化酶)基因編碼介導核糖體靶位點的修飾，二是由msrA/B(大環(huán)內(nèi)酯類特異性耐藥基因)和ereA/B(紅霉素酯酶)基因編碼的依賴ATP的外排泵，其中依賴erm基因編碼的甲基轉(zhuǎn)移酶介導核糖體靶點的修飾是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的主要機制[18]。erm基因編碼的蛋白質(zhì)使23S rRNA結(jié)構(gòu)域肽基轉(zhuǎn)移酶區(qū)的腺嘌呤殘基A2058/2059甲基化，并導致大環(huán)內(nèi)酯、林可酰胺和鏈球菌素B(MLSB)等抗生素耐藥性[19]。erm基因介導的耐藥菌株表現(xiàn)出兩種表型：組成型MLSB(cMLSB)和誘導型MLSB(iMLSB)，不同表型與不同的分子調(diào)控機制有關。在iMLSB株中erm的翻譯起始受到抑制，其mRNA核糖體結(jié)合位點被紅霉素與先導肽結(jié)合后隔離，促使mRNA核糖體結(jié)合位點釋放，限制erm的作用。cMLSB菌株允許誘導轉(zhuǎn)錄物的獨立翻譯，因其先導肽基因序列的變異會消除翻譯[20]。Jarajreh等[21]研究發(fā)現(xiàn)，金葡菌對紅霉素、克林霉素的耐藥性主要是由ermA或ermC基因引起的。ermA是MRSA菌株中最常見的基因，位于轉(zhuǎn)座子Tn554上，能插入金葡菌染色體的不同區(qū)域；ermC是導致金葡菌菌株中大環(huán)內(nèi)酯類耐藥的最常見基因，由質(zhì)粒攜帶。在金葡菌中還發(fā)現(xiàn)了ermB、ermF、ermY和lunA等對大環(huán)內(nèi)酯類林可酰胺類和鏈霉素耐藥的基因[22]，表明大環(huán)內(nèi)酯類的一種或幾種新的耐藥機制可能在金葡菌中廣泛存在。

4 tetM和tetK基因

四環(huán)素類藥物主要通過阻止氨基酰tRNA進入核糖體而抑制細菌蛋白質(zhì)合成。金葡菌對四環(huán)素類藥物的耐藥機制主要有兩種：由質(zhì)粒編碼的tetK和tetL基因介導的主動外排和由染色體或轉(zhuǎn)座子tetM或tetO基因編碼的核糖體保護蛋白，保護核糖體免受藥物作用[23]。大多數(shù)攜帶tetL的菌株也攜帶其他四環(huán)素抗性基因，如tetM和tetK。tetM和tetK的基因通常位于染色體上的DNA，tetM的耐藥性可能與整合和結(jié)合轉(zhuǎn)座子相關，促進基因之間水平轉(zhuǎn)移，該元件也可攜帶編碼氯霉素抗性的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(cat)基因；tetL基因通常是通過質(zhì)粒傳播的，相應的質(zhì)粒大小不同，可能攜帶額外的抗性基因；四環(huán)素抗藥性基因tetM和tetK與可移動基因元件的結(jié)合可能促進抗藥性性狀在MRSA中的傳播[24]。De Vries等[25]研究表明人類來源的金葡菌含有不同的tetM基因，位于Tn916和Tn5801樣的結(jié)合轉(zhuǎn)座子上；不同動物來源的金葡菌含有一種特定類型的tetM，位于Tn916類元素上，并首次報道Tn5801、Tn6014可在金葡菌分離株之間轉(zhuǎn)移。

5 生物膜的形成

細菌的生物膜基質(zhì)和表型特征賦予宿主免疫反應和抗菌藥物作用的抵抗力，并受多方面和重疊的調(diào)控網(wǎng)絡的調(diào)節(jié)，不同的金葡菌菌株的生物膜組成不同，出現(xiàn)具有不同生理特性的藥物難治性細胞亞群，并導致難治性細菌感染患者的治療失敗[26]。在金葡菌中，生物膜分離受輔助基因調(diào)節(jié)器Agr(accessory gene regulator)，被認為是一個在浮游和生物膜狀態(tài)之間的重要調(diào)節(jié)開關[27]。其可下調(diào)細胞表面相關蛋白的表達，并上調(diào)胞外毒素(溶血素、腸毒素)胞外蛋白酶等的表達。Agr介導的生物膜擴散與SspA、SspB、Aur和Scp等胞外蛋白酶的分泌相關[28]。研究發(fā)現(xiàn)Agr功能失調(diào)的菌株比功能正常的菌株更具耐藥性[29]。金葡菌還能以icaADBC編碼的多糖細胞間黏附作為生物膜形成的機制，攜帶ica位點是大多數(shù)臨床金葡菌菌株的特征，Agr系統(tǒng)的缺失增強了臨床MRSA菌株的生物膜形成，Agr位點編碼分別由P2和P3啟動子驅(qū)動的RNAⅡ和RNAⅢ轉(zhuǎn)錄體。在人類MRSA分離株中，纖維連接蛋白結(jié)合蛋白(FnBPs)被證明是獨立于ica的生物膜形成因素，F(xiàn)nBP是一種多功能表面蛋白，由參與纖維粘連蛋白結(jié)合的串聯(lián)重復序列分離。FnBP蛋白FnBPA和FnBPB均參與了醫(yī)院和社區(qū)分離株在靜態(tài)和流動條件下MRSA生物膜形成的累積階段[30]。此外，SasG通過SasG蛋白的同質(zhì)均可促進細胞間聚集，SasG蛋白的重復B結(jié)構(gòu)域促進生物膜形成，B結(jié)構(gòu)域通過在細胞表面形成伸展的纖維，以Zn2+依賴的方式促進獨立于ica的生物膜的形成[31]。

6 小 結(jié)

金葡菌是臨床上常見的病原菌之一，感染后過度、不合理地使用抗生素導致耐藥菌株的增加和治療失敗率的增高，對不同種類的抗生素有不同耐藥機制，金葡菌菌株中抗生素耐藥基因的出現(xiàn)和快速傳播給全球公共衛(wèi)生帶來了嚴重挑戰(zhàn)。金葡菌的耐藥性與相關的結(jié)合蛋白、特異性耐藥基因表達調(diào)控、抗生素結(jié)合位點改變、產(chǎn)生降解或改變抗生素結(jié)構(gòu)的、編碼轉(zhuǎn)運蛋白的基因突變、黏附能力等有關，還可能與出現(xiàn)新抵抗力的菌株流行、菌株基因突變、細菌免疫逃逸有關。金葡菌的分子特征因區(qū)域而異，其多樣的耐藥機制使金葡球耐藥嚴重，臨床感染治療復雜化。抗菌藥物敏感性和耐藥基因分布的研究對醫(yī)院感染控制具有重要意義。應加強對其耐藥性監(jiān)測，同時根據(jù)藥敏結(jié)果合理選用抗菌藥物。此外，結(jié)合分子生物學技術鑒定金葡菌毒力因子、克隆復合物和序列類型判斷耐藥，靶向篩選其抗性表型和相關的抗性基因型可作為評價金葡菌抗性的重要參考。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。