基于蛋白質(zhì)組學的中醫(yī)藥防治腦卒中應用研究進展

馬春玉 牛萍 王新娜 于子喬 于俊超 王旭 董富香 趙德喜

腦卒中是世界范圍的公共衛(wèi)生問題，位列全球死亡原因的第2位[1]。我國的形勢更為嚴峻，腦卒中死亡人數(shù)約占年總死亡人數(shù)的1/4[2,3]。蛋白組測序是研究基因表達調(diào)控機制的一個重要工具[4]。近年來，研究人員在進行疾病機制闡釋和新藥研發(fā)的過程中，廣泛應用蛋白質(zhì)組學技術(shù)。在疾病研究方面，該技術(shù)對闡明腫瘤、糖尿病和呼吸系統(tǒng)疾病的病理過程具有重要意義[5-8]。在藥物研究方面，蛋白質(zhì)組學的應用為藥物作用機制[9]及中藥新藥的研發(fā)[10]提供了新思路。在中醫(yī)藥防治重大疾病的研究中，越來越多科研工作者認識到應用蛋白質(zhì)組學技術(shù)的重要性。通過對疾病及新藥的研究，以期得到預測、治療疾病及預測預后的生物學標志物，在此基礎(chǔ)上開發(fā)新藥物，以推進精準醫(yī)學的發(fā)展和人民健康水平的提高。中醫(yī)早在《內(nèi)經(jīng)》一書中就對腦卒中有了相關(guān)闡述，后世醫(yī)書中也不乏對這一疾病的記載。總結(jié)各代醫(yī)家對本病認識的相關(guān)論述，并基于現(xiàn)代人體質(zhì)、發(fā)病特點等因素，現(xiàn)代中醫(yī)學家們已總結(jié)出本病的病因病機，而基于病因病機而發(fā)展出來的治則、治法、方劑，指導了很多中醫(yī)人的臨床應用，且治療效果顯著。研究發(fā)現(xiàn)，腦血管病可歸因于單基因遺傳病的人群極少，故腦卒中損傷人體的途徑并不是單一的，而是多種因素共同影響的結(jié)果[11]，如通過興奮性氨基酸[12]、谷氨酸[13]等代謝產(chǎn)物的毒性作用、凋亡細胞的激活[14]、小膠質(zhì)細胞活化[15]等共同作用。另外，本病伴發(fā)疾病較多，是一系列疾病共同作用的結(jié)果[16]。腦梗死、腦出血等既是國際上的重大疾病，又是疑難、復雜疾病的病種,是中西醫(yī)臨床與基礎(chǔ)研究的熱點。中醫(yī)藥療法在治療疾病時能夠多靶點、多途徑的干預疾病病理過程的發(fā)生發(fā)展，中醫(yī)藥在防治本病上優(yōu)勢顯著。應用蛋白質(zhì)組學技術(shù)闡釋中醫(yī)藥防治腦卒中的研究已取得了很大的進展。本文將近10年基于蛋白質(zhì)組學的中醫(yī)藥防治腦卒中的研究作如下綜述。

1 蛋白質(zhì)組學在揭示腦卒中發(fā)病機制、診斷中的應用

蛋白質(zhì)組學是通過各種技術(shù)手段對蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)的表達進行多層次評估，從而掌握復雜的生理病理過程[17]，即獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生、細胞代謝等過程的整體而全面的認識。近年來，蛋白質(zhì)組學技術(shù)為腦卒中發(fā)病機制的研究提供了新思路，如幫助研究人員從蛋白質(zhì)水平上更好地認識復雜的顱內(nèi)、顱外腦血管體系損傷的可能原因，認識卒中發(fā)生相關(guān)的生物學通路[18]。越來越多的學者開始研究腦卒中發(fā)病機制及病程中的特異性標志物。

1.1 發(fā)病機制 蛋白質(zhì)聚集嚴重影響神經(jīng)退行性疾病中的細胞活力[19]，但這是否也發(fā)生在缺血性腦損傷中仍無定論，故Anja等[20]采用蛋白質(zhì)組學的方法來確定腦缺血后聚集的蛋白質(zhì)組，并對選定的聚集蛋白進行了驗證。缺血/再灌注會誘導RNA結(jié)合蛋白和熱休克蛋白、泛素、類泛素蛋白修飾分子和其他參與細胞信號轉(zhuǎn)導的蛋白質(zhì)的聚集。其中RNA結(jié)合蛋白構(gòu)成了缺血中最大的聚集蛋白組。

大多數(shù)自發(fā)性腦出血患者并未從外科手術(shù)中獲益[21]，因此，明確腦出血的發(fā)病機制，以靶向治療本病，對ICH的治療意義重大，而應用蛋白質(zhì)組學的方法可以為腦卒中發(fā)病機制尋找特異性標志物提供新思路。

目前，神經(jīng)成像和動物模型的研究提高了在分子水平上對腦出血病理、生理學的認知，并提出了神經(jīng)損傷的2個階段：早期機械損傷期和亞急性期，其共同特征是炎癥和水腫。蛋白質(zhì)組學有助于分析在急性腦出血患者中不同表達的血漿蛋白。Li等[22]運用血漿蛋白質(zhì)組的方法研究了急性ICH的病理機制，以尋找新的生物標志物和治療靶標，結(jié)果顯示，ICH發(fā)病急性期反應信號轉(zhuǎn)導以巨噬細胞途徑中一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)的產(chǎn)生為主。脂多糖(LPS)、人載脂蛋白A4(APOA4)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2(IGFBP2)、重組蛋白(LBP)、溶菌酶(LYZ)和O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)是ICH發(fā)展中新的潛在生物標志物。篩選出的蛋白質(zhì)和通路為ICH潛在的病理機制和治療靶點提供了新的視角。本研究提供了一些參與腦出血的新途徑，如LXR/RXR激活、急性期反應信號轉(zhuǎn)導以及巨噬細胞通路中NO和ROS的產(chǎn)生。在網(wǎng)絡(luò)分析中，得出p38MAPK和NFκB與腦出血繼發(fā)性損傷期的進展和惡化有關(guān)。

Rajaneekar等[23]應用定量蛋白質(zhì)組學結(jié)合生物信息學，對腦出血后繼發(fā)腦損傷的可能靶點及信號通路進行了研究，結(jié)果表明，細胞周期蛋白依賴性激酶5(CKI-5)、E3泛素蛋白連接酶、蛋白磷酸酶2A-α、蛋白磷酸酶2A-β、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、鈣蛋白酶-8(calpain-8)、軸蛋白-1(axin-1)、隔蛋白-4(septin-4)等可能對ICH后繼發(fā)的腦損傷產(chǎn)生作用。值得注意的是，本研究中研究人員分離了腦組織的單細胞懸液，這使得在蛋白質(zhì)組學分析中能夠觀察到出血性腦損傷后細胞水平發(fā)生的變化，限制細胞外蛋白介導的信號掩蔽；同時，研究人員采用蛋白質(zhì)組學方法結(jié)合生物信息學來分析腦出血后細胞水平上同側(cè)腦區(qū)的分子變化。利用該方法，鑒定出假手術(shù)組和腦出血組之間的差異表達蛋白與凝血作用、纖溶酶原激活級聯(lián)反應、p53通路、EGF受體信號通路、FGF信號通路等13條顯著的相關(guān)信號通路。

Chen等[24]通過蛋白質(zhì)組學方法探索ICH患者血腫周圍組織的整體蛋白質(zhì)表達譜，并確定潛在的病理生理學通路和蛋白質(zhì)標志物，使用iTRAQ標記定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)，分析了4個ICH腦組織樣本和4個非ICH腦組織樣本，經(jīng)過生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)差異表達的蛋白質(zhì)主要參與止血過程、營養(yǎng)代謝信號通路和抗氧化通路，這是對ICH誘導的繼發(fā)性腦損傷機制的新發(fā)現(xiàn)；使用臨床前或臨床樣本對ICH誘導的繼發(fā)性腦損傷的蛋白質(zhì)組學研究有揭示損傷機制的潛力，使用一個二維的iTRAQ-液體采用基于色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(iTRAQ-2D-LC-MS/MS)的定量蛋白質(zhì)組學方法，對ICH患者的血腫周圍腦組織和年齡匹配的非腦出血對照組進行分析對ICH的潛在分子病理學可提供新的研究視角。此外，纖維連接蛋白位于PPI網(wǎng)絡(luò)的中心，并與各種蛋白質(zhì)進行通信。

1.2 預防與早期診斷 對于腦卒中預防及診斷生物標志物的研究，主要集中在提高對本病的診斷效率，優(yōu)化診斷指標的時效性與速度；改善臨床決策，提高藥物的有效性，降低不良反應，并促進藥物的個性化使用，實現(xiàn)精準醫(yī)療，這與中醫(yī)理論中“因人制宜”相對應。目前，腦卒中的診斷主要是通過臨床評估(癥狀、體征)和神經(jīng)影像學檢查實現(xiàn)的。故發(fā)現(xiàn)一種更快、更準確的診斷技術(shù)，如血液檢測，對實現(xiàn)早期診斷、早期治療至關(guān)重要。在先前的一些研究中，單一生物標志物或多種生物標志物的效用已經(jīng)被評估，但所達到的準確性遠遠低于臨床實踐中的要求[25]。研究發(fā)現(xiàn)，利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)檢測腦卒中的生物學標志物，有利于本病的預防及早期診斷[26]。

動脈粥樣硬化的病因可歸結(jié)到免疫系統(tǒng)。在免疫系統(tǒng)發(fā)生內(nèi)環(huán)境改變時，會對循環(huán)內(nèi)和血管病灶部位產(chǎn)生多方面影響，從而導致動脈粥樣硬化的產(chǎn)生。然而，目前對導致腦梗死等臨床事件的動脈粥樣硬化病變內(nèi)失調(diào)的免疫細胞的具體特征知之甚少。Dawn等[27]使用單細胞蛋白質(zhì)組學技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了與近期無卒中相比，近期有卒中或短暫性腦缺血發(fā)作的患者頸動脈斑塊中T細胞和巨噬細胞的不同特征，具體表現(xiàn)為：CD4+T細胞的不同亞群以及被激活和分化的T細胞，來自有卒中或短暫性腦缺血發(fā)作患者的斑塊中的一些T細胞亞群呈現(xiàn)出T細胞耗竭的標志物。來自這些斑塊的巨噬細胞包含交替激活的表型，包括與斑塊易損性相關(guān)的亞群。在無卒中患者的斑塊中，T細胞和巨噬細胞被激活并顯示出白介素1β(IL-1β)信號轉(zhuǎn)導。識別與腦血管事件相關(guān)的斑塊中先天性和適應性免疫細胞的特定特征，對研制出更精確的免疫療法具有重要意義。

筆者目前尚未發(fā)現(xiàn)用于早期診斷缺血性腦卒中的血液生物標志物。Lee等[28]試圖通過識別與潛在凝血機制相關(guān)的蛋白質(zhì)來檢測腦卒中特異性血液生物標志物。使用來自16名健康對照和18名缺血性腦卒中患者的血液樣本進行蛋白質(zhì)組學分析。運用納米液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，確定了相應水平上相對于健康對照組，腦卒中患者上調(diào)蛋白質(zhì)理論質(zhì)譜圖，以提高候選蛋白質(zhì)的一致性和準確性。通路分析證實，上調(diào)的蛋白質(zhì)主要參與血液凝固。其中，選擇凝血酶原、纖溶酶原、纖維蛋白原α-鏈和富含組氨酸的糖蛋白作為候選生物標志物。對61份血清樣本(31 名健康對照和30名缺血性腦卒中患者)進行反向監(jiān)測分析，以評估候選生物標志物的診斷價值。結(jié)果顯示，這4種蛋白質(zhì)在中風患者中的表達水平都高于健康對照組，即這4種凝血蛋白對于快速而準確地診斷缺血性腦卒中具有重要臨床意義。

趙新玲等[29]應用蛋白質(zhì)組學技術(shù)檢測和鑒定了對急性缺血性腦卒中患者有診斷和預后評估作用的潛在生物標志物血小板反應蛋白1(THBS-1)。結(jié)果表明，THBS-1在急性缺血性腦卒中患者的血漿中呈高表達，且THBS-1的表達水平與患者預后呈負相關(guān)。

2 蛋白質(zhì)組學在腦卒中中醫(yī)藥治療中的應用

通過蛋白質(zhì)組學技術(shù)對中醫(yī)藥治療腦卒中進行深入研究，可發(fā)現(xiàn)多種蛋白質(zhì)、多靶標、多信號通路共同調(diào)節(jié)腦卒中的分子機制，這可為中醫(yī)藥起效機制的研究帶來全新的思路，對臨床治療腦卒中具有重大意義[30-32]。

有研究表明，大黃及大黃為君的復方能針對“痰瘀交結(jié)，氣血逆亂，腑氣不通”這一缺血性中風與出血性中風在急性期的相同病機，有效治療缺血性中風與出血性中風急性期[33]。Wang等[34]對生大黃和酒大黃治療ICH大鼠模型的機制進行了蛋白質(zhì)組學和代謝組學實驗研究。結(jié)果顯示，兩種大黃治療都能有效改善氧化應激和炎性反應。富集分析結(jié)果表明，與生大黃治療的腦出血大鼠相比，酒大黃治療可能調(diào)節(jié)氨基酸新陳代謝。生大黃治療后的差異代謝產(chǎn)物分析和酒大黃治療的大鼠相比結(jié)果顯示，兩種大黃治療均抑制苯丙氨酸代謝，顯示出神經(jīng)保護作用。酒大黃與谷氨酰胺的代謝有關(guān)，這可能是它對ICH的治療效果更好的可能機制之一。本研究為進一步探討不同加工技術(shù)下大黃的治療機制提供了基礎(chǔ)，并促進了大黃作為一種治療ICH藥物的應用。

在我國，一些中藥湯劑已被臨床用于急性期ICH的臨床治療，其中大承氣湯(DCQ)尤為重要。盡管DCQ已經(jīng)使用了1800多年，但人們對它的神經(jīng)保護機制知之甚少。揭示DCQ的治療機制將有助于找到治療ICH的關(guān)鍵因素。大黃是DCQ的君藥。大黃素作為大黃中的一種天然活性化合物，已被證明具有腦保護作用。然而，大黃素的作用并不能完全代表DCQ的作用。因此，有必要系統(tǒng)地檢測DCQ的作用，以探索其作用機制。Zeng等[35]的研究觀察了DCQ和大黃素對ICH的保護作用及其可能的作用機制。結(jié)果顯示，DCQ和大黃素均顯著增加了M2小膠質(zhì)細胞的數(shù)量，并對腦卒中后海馬SND有保護作用。因此，抑制NR2B/MAPK和激活M2小膠質(zhì)細胞是DCQ和大黃素提供保護作用的兩個重要方面，在腦出血治療中也尤為重要。與大黃素相比，DCQ顯著改善了腦出血大鼠的神經(jīng)功能缺損，增加了膠原酶-VⅡ注射后第7天開始的出血性病灶中小膠質(zhì)細胞的數(shù)量。DCQ的特定活性成分及其特異性保護機制有待進一步研究。

3 多組學聯(lián)合分析在腦卒中機制及治療中的應用

目前，如何通過多組學聯(lián)合分析的方式探討疾病機制、預防、診斷，及藥物治療靶點的研究，是當前醫(yī)學領(lǐng)域研究的熱點，這對疾病的診斷、預防具有重要意義，也可為當前機制并不明確疾病治療藥物的開發(fā)提供新方向。在基于組學的研究方法中，蛋白質(zhì)組學是發(fā)現(xiàn)新的生物標記物的最常用工具。然而，基因組學，轉(zhuǎn)錄組學和代謝組學分析的結(jié)果也是有益的，多組學方法可以實現(xiàn)優(yōu)勢互補，特別是多種組學方法應用于同一患者時。應用不同的組學技術(shù)進行多個數(shù)據(jù)集的聯(lián)合分析對于闡明不同分子成分之間的關(guān)系至關(guān)重要。因此，通過整合分析多組學技術(shù)結(jié)合的結(jié)果，有望提高對腦卒中背后的分子動力學的理解。如因為不同的患者對靜脈溶栓和再灌注的反應不同，預測治療預后的生物標志物越來越重要，具體來說，預測出血性轉(zhuǎn)化或識別有機會再次發(fā)生卒中的患者的生物標記物是有價值的。目前，多組學聯(lián)合分析已經(jīng)證明了出血性轉(zhuǎn)化和基質(zhì)金屬蛋白蛋白水平增加之間的聯(lián)系，且在微血管和血腦屏障的完整性中起著關(guān)鍵作用[36]。

4 小結(jié)與展望

隨著醫(yī)療技術(shù)水平的不斷提高、對腦卒中診治認識的不斷深入及百姓對本病防治觀念的提升，我國腦卒中的死亡率已經(jīng)大幅度下降。但仍有很多患者在急性期的救治(溶栓、抗血小板、控制血脂血糖等)后會遺留后遺癥，如不同程度的言語不利、飲水嗆咳。因此，如何早期識別、診斷并有效救治腦卒中具有重要意義。

4.1 中醫(yī)藥在防治腦卒中研究的展望 中醫(yī)藥在防治腦卒中方面具有獨特優(yōu)勢，且隨著現(xiàn)代中醫(yī)的發(fā)展，干預方法逐漸豐富，基礎(chǔ)研究日漸深入。腦卒中的診治是一項需要多學科交叉配合協(xié)調(diào)的系統(tǒng)工程。國內(nèi)中醫(yī)藥工作者對中風病的系統(tǒng)研究開展了三十余年，形成了《中風病診斷與療效評定標準》，使其診斷及治療走向規(guī)范，對腦卒中的科研及臨床都起到了巨大的推動作用。雖然中醫(yī)藥在我國大規(guī)模用于治療本病已有多年，但仍缺少高質(zhì)量的臨床試驗說明其科學性，需要進一步開展高質(zhì)量的臨床及基礎(chǔ)研究對其有效性、安全性進行驗證。與此同時，新方法、新技術(shù)的參與對于本病早期預防與診治也具有重要意義。對于中藥干預原本因出血或缺血產(chǎn)生紊亂的差異蛋白的研究，可為其病因病機和中藥療效提供物質(zhì)解釋。

4.2 蛋白質(zhì)組學在中醫(yī)藥領(lǐng)域研究中的展望 目前，蛋白質(zhì)組學作為系統(tǒng)生物學的主要組成部分，在醫(yī)學診斷、藥物開發(fā)和機制研究等領(lǐng)域得到了廣泛的關(guān)注，在疾病的預防、診斷和預后中正發(fā)揮著越來越重要的作用。蛋白質(zhì)組學技術(shù)是闡明外周體液、細胞、組織、血液和尿液樣本中蛋白質(zhì)差異表達的重要研究工具。血液和尿液因它們的分子組成會隨著身體的動態(tài)生理和病理條件而波動，成為蛋白質(zhì)組學使用最廣泛的標本。由于蛋白質(zhì)是生物信息的主要執(zhí)行者，蛋白質(zhì)組學分析便直接反映了基因表達情況。利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)能讓我們在蛋白質(zhì)水平更深入地了解疾病；除了已知的危險因素之外，在組學水平上研究疾病新的危險因素和發(fā)病前患者的臨床癥狀、體征、理化檢查情況，對臨床診治和遠期療效具有重大的指導意義，這也與中醫(yī)的“治未病”思想相契合，值得深入研究；此外，中藥方劑由多種藥物組成，每種藥物還由多種化學成分組成。而一種化合物可以調(diào)節(jié)多種蛋白質(zhì)。因此，蛋白質(zhì)組學可能是最有效的確定有效蛋白質(zhì)和解釋潛在的藥理機制的方法。如今，蛋白質(zhì)組學也成為中醫(yī)與現(xiàn)代生命科學的橋梁，極大地促進了中醫(yī)的質(zhì)量評價和標準化，促進了中醫(yī)的現(xiàn)代化和國際化。但蛋白質(zhì)組學在中藥研究中的應用充滿了挑戰(zhàn)，蛋白質(zhì)組學技術(shù)仍有待進一步完善。目前，與來自基因組學和轉(zhuǎn)錄組學的數(shù)據(jù)相比，從蛋白質(zhì)組學技術(shù)中鑒定出的蛋白質(zhì)相對較少；蛋白質(zhì)組學的結(jié)果通常是不穩(wěn)定的變量，這意味著蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性較差。為了獲得理想的結(jié)果，需要結(jié)合其他的組學技術(shù)進行分析。

中醫(yī)已在中國和其他亞洲國家被應用于疾病的診斷、治療和預防3 000多年。由于中醫(yī)診療概念的復雜性、技術(shù)的局限性，使中醫(yī)診療缺乏客觀的評價，中醫(yī)理論的本質(zhì)和作用機制尚不清楚。且中醫(yī)的診斷和治療主要依賴于中醫(yī)醫(yī)生的直覺和經(jīng)驗。與生物分子科學和西醫(yī)相比，中醫(yī)顯得不客觀及缺乏識別的準確性和可重復性。蛋白質(zhì)組學有助于探索中醫(yī)的科學內(nèi)涵與中藥現(xiàn)代化。首先，蛋白質(zhì)組學可以用來識別不同的健康個體與不同中醫(yī)證候患者的基因表達；其次，蛋白質(zhì)組學可以幫助發(fā)現(xiàn)分子靶點，開發(fā)新的生物活性化合物，闡明中藥治療的潛在機制。因此，不僅是在腦卒中領(lǐng)域，從方劑的組成到中醫(yī)基本概念(氣、血等)的生物學基礎(chǔ)，從病理到藥理機制，蛋白質(zhì)組學在中醫(yī)學科很多方面的研究中都發(fā)揮了重要的作用。蛋白質(zhì)組學分析確定的差異蛋白不僅為診斷提供了潛在的生物標志物，而且為更好地理解中醫(yī)治療提供了線索。更重要的是，這些發(fā)現(xiàn)有助于我們分析從古代文獻中的抽象詞中提取到的大量、重要信息，為新藥的開發(fā)提供有價值的思路。但目前基于蛋白質(zhì)組學研究的中醫(yī)的大多數(shù)問題仍然很模糊，需要更多的研究來解決這些問題。例如，對中醫(yī)證候的研究需要更多的臨床數(shù)據(jù)，不同疾病之間相同的中醫(yī)證候的概念有待于更直接的驗證；需要對更多的穴位進行更多的臨床研究來探求針灸的起效的機制；需要更深入、更系統(tǒng)的研究，以揭示中藥處方活性成分之間的協(xié)同作用。此外，蛋白質(zhì)組學與其他技術(shù)(其他組學、網(wǎng)絡(luò)藥理學等)之間的聯(lián)用，對于全面了解目標問題至關(guān)重要。

蛋白質(zhì)組學自身的發(fā)展也為中醫(yī)藥的發(fā)展帶來了機遇。一方面，蛋白質(zhì)組學作為一個獨立的學科仍在發(fā)展中，如蛋白質(zhì)基因組學的研究持續(xù)進展；另一方面，蛋白質(zhì)組學技術(shù)在中醫(yī)研究中的應用會不斷上升和擴展，不僅在藥理學研究領(lǐng)域，而且在不良反應和療效評估等領(lǐng)域也大放異彩。同時，由于蛋白質(zhì)組學技術(shù)的固有局限性，將蛋白質(zhì)組學與其他組學和生物信息學進行整合聯(lián)用也將成為研究趨勢。