一測多評法同時測定艾葉配方顆粒中6個酚酸類成分

王瑜婷，鄺敏，何榮榮，潘玲，黎桃敏，鐘志奎，孫冬梅（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244）

艾葉為菊科植物艾Artemisia argyiLevl. et Vant.的干燥葉，性溫，味辛、苦，具有溫經(jīng)止血、散寒止痛的功效，內(nèi)服治療吐血、衄血、崩漏、月經(jīng)過多、胎濡下血、少腹冷痛、經(jīng)寒不調(diào)、宮冷不孕等疾病，外用可治療皮膚痛癢[1-3]?，F(xiàn)代研究表明，艾葉的主要化學成分為揮發(fā)油、酚酸類、黃酮類、萜類等，具有抗菌、抗病毒、平喘鎮(zhèn)咳祛痰、止血、抗凝血、抗過敏、鎮(zhèn)靜、護肝利膽及補體激活等作用[4]。

酚酸類成分具有清除自由基、抗菌、消炎、抗病毒、保肝利膽、降血壓、降血脂等作用，是艾葉重要的藥效物質(zhì)。植物中廣泛存在的綠原酸異構(gòu)體有綠原酸（3-咖啡?？崴幔?、隱綠原酸（4-咖啡?？崴幔⑿戮G原酸（5-咖啡?？崴幔惥G原酸A（3，5-二咖啡酰奎尼酸）、異綠原酸B（3，4-二咖啡酰奎尼酸）、異綠原酸C（4，5-二咖啡?？崴幔┑萚5]。一測多評（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）法是選定一個成分作內(nèi)參物，同時實現(xiàn)多個同類型化合物的含量測定方法，回避了多對照品、高配置檢測儀器的檢測條件，適合中藥質(zhì)量評價檢測特點[6]。因此，本文以綠原酸作為內(nèi)參物，建立艾葉配方顆粒的QAMS法，同時測定新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的含量，不僅節(jié)約了檢測成本，同時為進一步提高艾葉配方顆粒整體質(zhì)量控制水平提供了科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters H-Class型超高效液相色譜儀（Waters公司）；Agilent 1290型超高效液相色譜儀（Agilent公司）；Shimadzu LC-40型超高效液相色譜儀（島津公司）；XP26型百萬分之一天平、ME204E型萬分之一天平（METTLER TOLEDO公司）；Milli-Q Direct型超純水系統(tǒng)（Merck公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

綠原酸（批號：110753-202018，純度：96.1%，中國食品藥品檢定研究院）；新綠原酸（批號：DSTDX001503，純度：99.58%）、隱綠原酸（批號：DST220104-035，純度：99.3%）、異綠原酸C（批號：DSTDY003802，純度：99.58%）（德思特生物技術(shù)有限公司）；異綠原酸B（批號：wkq210222206，純度：99.85%）、異綠原酸A（批號：wkq21020306，純度：99.45%）（四川省維克奇生物科技有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，Merck股份有限公司），甲酸（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；水為超純水，其他試劑均為分析純。13批艾葉配方顆粒（編號：S1～S13，廣東一方制藥有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～2 min，8%A；2～4 min，8%～10%A；4～8 min，10%～15%A；8～12 min，15%～18%A；12～18 min，18%～19%A；18～22 min，19%～21%A；22～25 min，21%～37%A；25～28 min，37%～100%A；28～32 min，100%A；32～35 min，100%～8%A；35～45 min，8%A）；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：30℃；檢測波長：325 nm；進樣量：1 μL。

2.2 對照品溶液的制備

分別取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為55.140、68.189、56.138、121.078、71.121、135.035 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取艾葉配方顆粒適量，研細，取約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，取出，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性試驗 分別精密吸取空白溶劑、混合對照品溶液及供試品溶液（S12）進樣測定，結(jié)果見圖1?？梢?，供試品溶液色譜在與對照品溶液色譜相應的保留時間處具有相同的色譜峰，且空白溶劑無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 專屬性試驗UPLC色譜圖Fig 1 UPLC diagram of specific test

2.4.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2”項下混合對照品儲備液0.5、1.0、3.0、5.0、8.0、10 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成系列質(zhì)量濃度的混合對照溶液。按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以對照品溶液質(zhì)量濃度（μg·mL-1）為橫坐標（X），以峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，結(jié)果見表1?？芍?個成分在相應質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

表1 6個成分的線性關(guān)系考察結(jié)果Tab 1 Linearity of 6 components

2.4.3 精密度考察 精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，計算得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C峰面積的RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取艾葉配方顆粒（S12），精密稱定，按“2.3”項下方法制備，分別在0、4、8、12、24、48 h進樣測定，計算得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C峰面積的RSD均小于2.0%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復性試驗 取艾葉配方顆粒（S12），精密稱定，平行稱定6份，按“2.3”項下方法制備，進樣測定。計算得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C含量的RSD均小于2.0%，表明該方法重復性良好。

2.4.6 加樣回收試驗 取已知含量的艾葉配方顆粒（S12），精密稱取9份，每份約0.1 g，置具塞錐形瓶中，均分為3組，每組分別精密加入相當于含有量50%、100%、150%的混合對照品溶液，按“2.3”項下方法制備，進樣測定，計算加樣回收率及RSD，結(jié)果見表2。新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的平均加樣回收率在90.6%～102.0%，RSD均小于5.0%，表明該方法準確性良好。

表2 6個成分的加樣回收試驗結(jié)果(n＝3)Tab 2 Recovery of the 6 components (n＝3)

2.5 QAMS法的建立

2.5.1 相對校正因子（?）的確定 取“2.2”項下混合對照品溶液，以綠原酸作為內(nèi)參物，考察不同進樣量（0.2、0.5、0.8、1.0、1.5 μL）下新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的?。公式為?s/i＝?i/?s＝（Ci/Ai）/（Cs/As）＝（Ci×As）/（Cs×Ai），式中As為內(nèi)參物峰面積，Cs為內(nèi)參物濃度，Ai為某待測成分峰面積，Ci為待測成分濃度[7]。計算得?分別為1.00、0.94、1.20、1.25、1.16，RSD分別為0.00%、0.48%、0.95%、1.0%、1.7%，結(jié)果見表3。

表3 5個成分的相對校正因子(n＝5)Tab 3 Relative correction factors of 5 components (n＝5)

2.5.2 色譜儀及色譜柱對?的影響 以綠原酸為內(nèi)標物，考察其他成分在不同超高效液相色譜儀Waters H-Class型、Agilent 1290型、Shimadzu LC-40型，以及不同色譜柱ZORBAX RRHD SB C18（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）、ACQUITY UPLC HSS T3（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）、CORTECS UPLC T3（150 mm×2.1 mm，1.6 μm）下的?，結(jié)果見表4，各成分的?的RSD均小于2.0%，表明不同色譜系統(tǒng)和色譜柱對各成分的?無顯著影響。

表4 不同色譜儀和色譜柱對相對校正因子的影響(n＝3)Tab 4 Effect of instrument and column on relative correction factor (n＝3)

2.5.3 流速對?的影響 以綠原酸為內(nèi)標物，考察不同流速（0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mL·min-1）下的?，結(jié)果見表5，各成分的?的RSD均小于1.0%，表明不同流速對各成分的?無顯著影響。

表5 不同流速對相對校正因子的影響(n＝3)Tab 5 Effect of flow velocity on relative correction factor (n＝3)

2.5.4 柱溫對?的影響 以綠原酸為內(nèi)標物，考察不同柱溫（25、28、30、35℃）下的?，結(jié)果見表6，各成分的?的RSD均小于1.0%，表明不同柱溫對各成分的?無顯著影響。

表6 不同柱溫對相對校正因子的影響(n＝3)Tab 6 Effect of column temperature on relative correction factor (n＝3)

2.5.5 檢測波長對?的影響 以綠原酸為內(nèi)標物，考察不同檢測波長（320、323、325、327、330 nm）下的?，結(jié)果見表7，各成分的?的RSD均小于2.0%，表明不同檢測波長對各成分的?無顯著影響。

表7 不同檢測波長對相對校正因子的影響(n＝3)Tab 7 Effect of detectionwavelength on relative correction factor (n＝3)

2.5.6 梯度程序?qū)?的影響 以綠原酸為內(nèi)標物，考察“2.1”項下梯度程序波動（-5%～+5%）下的?，結(jié)果見表8，各成分的?的RSD均小于5.0%，表明不同梯度程序?qū)?無顯著影響。

表8 不同梯度程序?qū)ο鄬πＵ蜃拥挠绊?n＝3)Tab 8 Effect of gradient program on relative correction factor (n＝3)

2.6 待測成分色譜峰的定位

目前，常用的色譜峰定位方法有相對保留值法、保留時間差法、時間校正法、對照提取物法等。保留時間差法計算公式為Δti/s＝ti-ts；相對保留值法計算公式為ti/＝ti/ts

[8]。本文采用相對保留值法，以綠原酸為內(nèi)參物，考察其他成分在不同超高效液相色譜儀以及色譜柱下的相對保留值，結(jié)果見表9，各成分相對保留值的RSD均小于2.0%，表明不同色譜系統(tǒng)和色譜柱對各成分相對保留值無顯著影響。

表9 不同色譜儀和色譜柱對相對保留值的影響(n＝3)Tab 9 Effect of instrument and column on relative retention time (n＝3)

2.7 外標法（ESM）和QAMS法結(jié)果對比

取13批艾葉配方顆粒適量（S1～S13），精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，分別采用ESM和QAMS法測定各成分含量，利用SPSS 26.0軟件對結(jié)果進行Pearson相關(guān)系數(shù)（r）分析，結(jié)果見表10，兩種方法的r均為1.000，具有高相關(guān)性（P＞0.05）。驗證ESM和QAMS法測定艾葉配方顆粒中新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C的含量，計算2種測定方法下的相對誤差，相對誤差（%）＝（QAMS含量-ESM含量）/QAMS含量×100%[9]，結(jié)果顯示新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C的測定相對誤差范圍分別為0.85%～1.10%、0.00%～0.24%、0.44%～0.59%、0.14%～0.39%、0.65%～0.79%，均小于1.2%，表明建立的艾葉配方顆粒QAMS法測定結(jié)果準確可靠。

表10 6個成分的含量測定結(jié)果(n＝3，%)Tab 10 Content determination of 6 components (n＝3，%)

3 討論

3.1 待測組分的選擇

艾葉配方顆粒為艾葉飲片經(jīng)水提、分離、濃縮、干燥、制粒而成的顆粒，在中醫(yī)藥理論指導下，按照中醫(yī)臨床處方調(diào)配后，沖服使用。目前有關(guān)艾葉藥材或飲片的多指標含量測定報道較多[10-13]，對相關(guān)制劑定量分析的報道較少。艾葉中含量較高的藥效成分有酚酸類、揮發(fā)油等，其中酚酸類成分為水溶性成分，易于檢測，因此本研究將6個酚酸類成分作為艾葉配方顆粒質(zhì)量控制的指標[14-15]，其中，綠原酸含量、保留時間適中，易于對其他成分進行定位，且綠原酸對照品來源充足，化學性質(zhì)較穩(wěn)定，選其作為內(nèi)參物能夠充分體現(xiàn)QAMS法低成本的優(yōu)勢。

3.2 提取方法及色譜條件的選擇

本研究對供試品溶液的提取方式（超聲法、回流法），提取溶劑（50%乙醇、80%乙醇、無水乙醇、50%甲醇、80%甲醇、甲醇），提取時間（30、45、60 min）和稀釋倍數(shù)（25、50、100 倍）進行考察。結(jié)果表明，按“2.3”項下方法制備供試品溶液時色譜峰分離度較好。采用PDA檢測器在210～400 nm內(nèi)對供試品溶液進行掃描，發(fā)現(xiàn)在325 nm時色譜圖基線平穩(wěn)、噪聲小，各組分的響應值較高，因此，選擇325 nm作為檢測波長。

3.3 QAMS法的建立

正確定位各待測成分的色譜峰是評價QAMS法可行性的重要步驟，本研究應用不同高效液相色譜儀和品牌色譜柱，分別考察保留時間差和相對保留時間的可靠性，最終發(fā)現(xiàn)相對保留時間更能準確定位各待測成分色譜峰。常用來計算?的方法有多點校正法和斜率校正法，而采用斜率校正法，要求標準曲線線性關(guān)系較好，斜率與截距之比大于100，計算得到的校正因子才具有較好的重復性和準確性[16]，故本研究采用多點校正法計算?，方法學耐用性考察中RSD均小于5.0%，表明該方法穩(wěn)定可行，可為艾葉配方顆粒的質(zhì)量控制提供參考。