菥蓂配方顆粒特征圖譜及含量測定研究

李英哲，李佳東，黃夢龍，周明哲，吳 弢

（上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，上海 201203）

菥蓂為十字花科植物菥蓂Thlaspi arvenseL.的干燥地上部分，又名析目（陜西）、蘇敗醬（江蘇）、南敗醬（湖北）、大薺、遏藍菜、爪子草等，原產(chǎn)地為歐洲，現(xiàn)廣泛分布于我國各地［1］。菥蓂始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，其味辛、性微寒，歸肝、胃、大腸經(jīng)［2］，具有清肝明目、和中利濕、解毒消腫等功效，臨床多用于目赤腫痛、脘腹脹痛、脅痛、腸癰、水腫、帶下和瘡癤癰腫等癥的治療［3］。菥蓂含黃酮類、有機酸類等化學(xué)成分［4］。目前，關(guān)于其質(zhì)量控制的報道較少，2020 年版《中國藥典（一部）》僅收錄其薄層色譜（TLC）鑒別等項［3］。宋文靜等［5］采用高效液相色譜（HPLC）法測定了菥蓂子藥材中異牡荊素、當(dāng)藥黃素、黑芥子苷的含量。過立農(nóng)等［6］、程麗媛等［7］分別建立了菥蓂藥材飲片中7 種黃酮類成分的含量測定方法，而關(guān)于菥蓂配方顆粒的指紋圖譜及含量測定尚未見報道。異牡荊素具有抑菌、抗炎、抗病毒、抗肝纖維化、抗腫瘤、抗氧化及保護心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等作用［8-11］，與該制劑中的解毒消腫等功效相關(guān)。因此，本研究中以異牡荊素為指標(biāo)成分，建立測定其含量的超高效液相色譜（UPLC）法，并采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC - MS/MS）法對制劑中的化合物進行指認，確定特征峰；在此基礎(chǔ)上，建立其特征圖譜，以為其質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290 Infinity Ⅱ液相色譜系統(tǒng)、Agilent 6546液相色譜四極桿飛行時間質(zhì)譜儀（美國Agilent 公司）；Waters Acquity UPLC 超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；KQ250DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BP211D型萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）；Milli - Q Academic 型純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

菥蓂配方顆粒（編號為S1-S10，S12-S13，分別購自W 公司、S 公司、J 公司）；原兒茶酸對照品（批號為ST04100120）、檸檬酸對照品（批號為RS08641020）、丹參素對照品（批號為ST78460120），均購自上海詩丹德生物技術(shù)有限公司（含量≥98%）；當(dāng)藥黃素對照品（批號為DST200817 - 084）、大波斯菊苷對照品（批號為DSTDQ006301）、異葒草苷對照品（批號為DST200815-121）、木犀草素對照品（批號為DSTDM003201），均購于成都德思特生物技術(shù)有限公司（含量≥98%）；異牡荊素對照品（上海源葉生物有限公司，批號為B21544，含量≥98%）；葒草苷、芹菜素對照品（實驗室自制，含量≥90%）；甲醇為分析純，甲酸、乙腈為色譜純，水為超純水；菥蓂藥材飲片（編號為S11，購自W 公司），由上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化中心吳立宏研究員鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗條件

色譜條件：色譜柱為Agilent InfinityLab Poroshell 120 SB - C18柱（100 mm × 4.6 mm，2.7 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～12 min 時10%A→40%A，12～12.5 min 時40%A→60%A）；流速為0.80 mL/ min；檢測波長為336 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為10μL。

質(zhì)譜條件：正、負離子模式。干燥氣溫度320 ℃、流速8 L/min；霧化氣壓力35 psi；毛細管電壓±3 500 V；碰撞電壓175 V。一級質(zhì)譜選用MS 1模式，質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 700。二級質(zhì)譜分別選用Target-MS/MS 和Auto - MS/ MS 模式，碰撞電壓20，30，40 eV。采用Agilent MassHunter軟件采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

2.2 溶液制備

取檸檬酸、丹參素、原兒茶酸、葒草苷、異葒草苷、異牡荊素、當(dāng)藥黃素、大波斯菊苷、木犀草素及芹菜素對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含各成分0.05 mg 的混合對照品溶液。取異牡荊素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含異牡荊素2.45 mg的對照品溶液。取顆粒樣品約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率40 kHz；下同）處理30 min，放冷，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，即得顆粒供試品溶液。取藥材飲片樣品約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70% 甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷至室溫，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得藥材飲片供試品溶液。取麥芽糊精適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含糊精1.00 mg 的陰性對照品溶液。

2.3 菥蓂化合物指認

取2.2 項下藥材飲片供試品溶液適量，按2.1 項下色譜條件調(diào)整流動相梯度比例（調(diào)整為0～10 min 時10%A→50%A）后進行分析。主要采用負離子模式（該模式更易識別黃酮類成分［11-12］）對菥蓂藥材中的化學(xué)成分進行表征。共表征出14 個化合物（見表1），為排除同分異構(gòu)體對質(zhì)譜表征結(jié)果的影響，對其中10 個化合物（檸檬酸、丹參素、原兒茶酸、葒草苷、異葒草苷、異牡荊苷、當(dāng)藥黃素、大波斯菊苷、木犀草素及芹菜素）經(jīng)對照品驗證（見圖1）。其中檸檬酸、丹參素、原兒茶酸及葒草苷為首次從菥蓂藥材中檢出。

表1 藥材飲片樣品主要化合物鑒定Tab.1 Identification of main compounds in Thlaspi Herba Formula Granules

2.4 UPLC 指紋圖譜建立

2.4.1 方法學(xué)考察

專屬性試驗：取2.2 項下混合對照品溶液、顆粒供試品溶液、陰性對照品溶液各適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。

精密度試驗：取同一批顆粒供試品溶液適量，按2.1 項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄峰面積。以異牡荊素峰（s）為參照峰（下同），計算得其他特征峰［異肥皂草苷峰（峰1）、異葒草苷峰（峰2）、木犀草素峰（峰4），下同］相對保留時間的RSD為0～0.15%，相對峰面積的RSD為0～1.04%，均小于3.0%（n=6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一顆粒供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，18，24，36，48，72 h時，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。其他特征峰相對保留時間的RSD為0.06%～0.22%，相對峰面積的RSD為0.35%～1.38%，均小于3.0%（n= 10），表明供試品溶液在室溫下放置72 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取同一批顆粒樣品（編號S3）適量，共6 份，按2.2 項下方法制備顆粒供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。其他特征峰相對保留時間的RSD為0.03%～0.11%，相對峰面積的RSD為0.10%～1.00%，均小于3.0%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.4.2 圖譜建立及相似度評價

取10 批顆粒樣品（W 公司）各適量，按2.2 項下方法制備顆粒供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，將10批顆粒樣品色譜圖結(jié)果依次導(dǎo)入中藥色譜特征圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）進行分析，記錄疊加特征圖譜（圖2）。采用中位數(shù)法，時間寬度設(shè)定為0.1 min，進行多點校正和自動匹配，生成特征圖譜共有模式（圖3），峰1 在336 nm 波長處明顯，可清晰辨別，峰2，3，4 經(jīng)對照品二次比對可確認。結(jié)果W 公司的10 批顆粒樣品相似度為0.998～1.000，表明相似度良好，說明不同批次間顆粒樣品差異較小，質(zhì)量較穩(wěn)定。

圖2 10批顆粒樣品超高效液相色譜疊加特征圖譜Fig.2 HPLC superimposed characteristic chromatograms of 10 batches of granule samples

圖3 顆粒樣品超高效液相色譜對照特征圖譜1.Isosaponin 2.Isoorientin 3.Isovitexin 4.LuteolinFig.3 UPLC reference characteristic chromatograms of the granule sample

10 批顆粒樣品的各特征峰（峰1、峰2、峰4）與s 峰（相對保留時間規(guī)定值為1.00 min）的平均相對保留時間為0.59，0.84，1.65 min，相對保留時間的RSD為0～0.55%。

取顆粒樣品（S1 - S10，S12 - S13）、藥材飲片樣品（S11），按2.2項下方法制備顆粒供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定。結(jié)果見圖4，S1 - S10，S12 - S13的色譜圖差異明顯，W 公司顆粒樣品色譜圖與飲片（S11）相似度高。

圖4 顆粒樣品、飲片樣品指紋圖譜比對Fig.4 Comparison of characteristic chromatograms of granule samples and decoction piece samples

2.5 異牡荊素含量測定

2.5.1 方法學(xué)考察

專屬性試驗：取2.2 項下異牡荊素對照品溶液、陰性對照品溶液各適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。詳見圖5。

圖5 超高效液相色譜圖1.Isovitexin A.Reference solution B.Negative reference solutionFig.5 UPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：取2.2項下異牡荊素對照品溶液適量，倍比稀釋，制成系列對照品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以異牡荊素質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，得回歸方程Y=28.79X+7.722（R2=0.999 6），結(jié)果表明，異牡荊素質(zhì)量濃度在2.54～254.00μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

精密度試驗：取高、中、低質(zhì)量濃度的異牡荊素對照品溶液各適量，按2.1 項下色譜條件進樣分析，每個質(zhì)量濃度連續(xù)進樣測定3 次，連續(xù)測定3 d。結(jié)果日內(nèi)精密度的RSD為0.31%～1.00%（n= 3），日間精密度的RSD為0.94%～1.38%（n=3），RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一批顆粒供試品溶液適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，24，36，48，72 h 時進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果異牡荊素峰面積的RSD小于2%（n=9），表明供試品溶液室溫下放置72 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取顆粒樣品（編號為S3），按2.2 項下方法制備顆粒供試品溶液，共6 份，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算異牡荊素含量。結(jié)果異牡荊素含量的RSD小于2%（n= 6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取顆粒樣品（編號為S3）0.25 g，精密稱定，分別加入150%，100%，50%3 個質(zhì)量濃度的異牡荊素對照品溶液，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率。結(jié)果加樣回收率為96.24%～104.22%，平均加樣回收率為99.62%，RSD為0.11%～2.61%（n=9）。

2.5.2 含量測定

取各顆粒樣品適量，按2.2項下方法制備顆粒供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，結(jié)果見表2（其中-為未測出）。W 公司10批顆粒樣品中異牡荊素含量在5.40～5.54 mg/g，平均5.49 mg/g。故規(guī)定以異牡荊素含量的70%為下限設(shè)定含量限，即每1 g 菥蓂配方顆粒中異牡荊素含量不得少于3.85 mg。

表2 樣品中異牡荊素含量測定結(jié)果（n=3）Tab.2 Results of the content determination of isovitexin in samples（n=3）

3 討論

3.1 液相色譜條件

本研究中首先采用全波長掃描，通過色譜峰數(shù)目和響應(yīng)值大小篩選檢測波長。發(fā)現(xiàn)在336 nm 波長條件下，菥蓂配方顆粒的特征圖譜基線較平穩(wěn)，峰容量較大且具有較高響應(yīng)值，故選擇336 nm 為檢測波長；以峰容量、各峰間的分離度、峰對稱性為指標(biāo)，考察流動相的組成（乙腈- 水、乙腈- 0.1%醋酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液），最終確定乙腈-0.1%甲酸溶液為流動相，并對洗脫時間、比例進行優(yōu)化；以特征峰保留時間、色譜峰分離度及對稱性為指標(biāo)，考察了柱溫（25，30，35 ℃）、流速（0.75～0.85 mL/ min）對特征峰分離效果的影響，結(jié)果表明，流速對分離度及色譜峰峰形影響較大，當(dāng)柱溫為30 ℃、流速為0.80 mL/ min 時特征峰分離良好。

比較使用相同規(guī)格（100 mm×4.6 mm，2.7μm）不同廠家的色譜柱（Agilent InfinityLab Poroshell 120 SB -C18柱，月旭Boltimate LP-C18柱，迪馬Navigatorsil C18柱），結(jié)果表明，迪馬和月旭色譜柱在同一色譜條件下，除色譜峰峰對稱性稍劣于安捷倫色譜柱外，其他色譜行為均與后者相同。在不同的超高效液相儀器（Waters 和Agilent）上進行考察，該色譜條件在兩個廠家的儀器上均能得到一致的色譜圖，表明本研究所建立的色譜條件耐用性良好。

3.2 質(zhì)譜解析

目前已有文獻報道通過化學(xué)成分分離、質(zhì)譜鑒定等方法對菥蓂所含化合物進行鑒定，結(jié)果表明其主要含有黃酮苷類［11］成分。本研究在已有研究的基礎(chǔ)上，采用UPLC - MS/ MS 技術(shù)分析藥材樣品中的化學(xué)成分，共表征了14 個化合物，其中檸檬酸、丹參素、原兒茶酸及葒草苷4個化合物為首次從菥蓂藥材中檢出。

3.3 提取條件優(yōu)化

在供試品溶液制備過程中，分別考察了提取方法（超聲、加熱回流、冷浸），5 種不同提取溶劑（甲醇、70%甲醇、50%甲醇、70%乙醇、水），提取時間（15，30，45 min），液料比（1∶25，1∶50，1∶100）對顆粒樣品有效成分提取率的影響?？紤]到配方顆粒在實際應(yīng)用中主要以熱水沖服，本研究中對水和有機溶劑的提取結(jié)果進行了比較，發(fā)現(xiàn)二者在提取化合物的數(shù)量上無明顯差異，但峰面積有差異，其中水提物的特征峰平均單位峰面積為3 352.766 ± 56.95，而70%甲醇提取物為4 073.72 ±65.87。因此綜合峰容量、總峰面積/稱樣量、實驗操作簡便易行等因素，選擇液料比1∶50，70%甲醇超聲提取30 min作為顆粒樣品供試品溶液的制備方法。

3.4 特征圖譜研究

本研究中在生成對照圖譜時采用中位數(shù)法，可避免用平均數(shù)法易受個別超常樣本影響的缺點，使圖譜更具代表性［13］。對來源于不同公司的顆粒樣品圖譜的相似度進行評估，來源于W 公司的10 批樣品相似度為0.998～1.000，結(jié)果表明W 公司的配方顆粒生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，批次間差異較?。籗12和S13樣品的譜圖相似度較高，但與W 公司差距較大，這可能與不同廠家所使用飲片來源不同或制劑工藝不同有關(guān)。有文獻報道，菥蓂藥材地上部分與來源于白花敗醬的敗醬草相似，導(dǎo)致二者常出現(xiàn)混用的情況［20-21］，因此不排除藥材基源不同的可能。W 公司菥蓂配方顆粒的原料飲片經(jīng)鑒定為十字花科植物菥蓂的干燥地上部分，且發(fā)現(xiàn)在同一試驗條件下，菥蓂藥材飲片液相色譜圖與W 公司生產(chǎn)的配方顆粒色譜圖相似性較高。由于配方顆粒喪失藥材性狀特征及顯微特征鑒定，研究出準(zhǔn)確且具有代表性的特征圖譜對配方顆粒鑒定尤為重要，因此收集市面上常見廠家所生產(chǎn)的菥蓂配方顆粒相比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同廠家產(chǎn)品的色譜圖差異較大。

綜上所述，本研究首次通過高分辨質(zhì)譜檢出菥蓂藥材中檸檬酸、丹參素、原兒茶酸及葒草苷4個化合物，同時建立了以異肥皂草苷、異葒草苷、異牡荊素、木犀草素4個黃酮類成分為特征峰的UPLC特征圖譜和異牡荊素含量測定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為菥蓂配方顆粒質(zhì)量控制提供了參考。