伊班膦酸鈉注射液的過敏性、溶血性和刺激性比較試驗

顧蕾蕾 何若琦 張逸民

（江蘇省藥物安全性評價中心，江蘇 南京 211800）

雙膦酸鹽是一類人工合成的焦磷酸鹽類藥物，此類有機化合物由一個碳原子連接2個磷原子形成“P-C-P”結(jié)構(gòu)，碳原子上的2個側(cè)鏈取代基（R1和R2）決定其藥物效應(yīng)。R1常常是羥基、氯基、氫基或烷烴基等化學(xué)集團。伊班磷酸鈉是第3代雙膦酸鹽，R2取代基中具有雜環(huán)，稱為異環(huán)型含氮雙膦酸鹽[1]。伊班膦酸鈉可以有效地抑制破骨細胞活性并誘導(dǎo)破骨細胞凋亡從而用于腫瘤骨轉(zhuǎn)移疾病的治療[2]。本文通過主動過敏試驗，被動皮膚過敏試驗，體外溶血試驗和血管刺激性試驗來評價伊班膦酸鈉（南京恒生制藥有限公司）的過敏性，溶血性和刺激性，并與參比制劑伊班膦酸鈉（Roche Pharma（Schweiz）Ltd）比較。

1 材料與方法

1.1 受試物 伊班膦酸鈉注射液（南京恒生制藥有限公司，批號191205），伊班膦酸鈉注射液（Roche Pharma(Schweiz)Ltd，批號H1101H03）

1.2 實驗動物 豚鼠（Hartley，SPF級）70只，來源北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，（合格證號1100112011017489、1100112011017490），雌雄各半。豚鼠46只，雌雄各半，來源南京市浦口區(qū)萊芙養(yǎng)殖場（合格證號202003586、202003587）。新西蘭兔11只，6雌5雄，南京市浦口區(qū)萊芙養(yǎng)殖場，（合格證號202001461）。飼養(yǎng)房間溫濕度控制范圍：溫度18～26 ℃；相對濕度40%～70%。換氣次數(shù)≥8次/h。工作照明＞200 Lux；動物照明15～20 Lux（照明時間12 h/d，6:00開燈～18:00關(guān)燈）。本研究中涉及內(nèi)容經(jīng)過本研究所倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 儀器 9903WOW電子計重秤（上海英展機電企業(yè)有限公司），BS124S分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），DNP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏試驗設(shè)備有限公司），ALH-30電子秤（上海英展機電企業(yè)有限公司），DL-5低速大容量離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠），ST4040自動染色機（Leica），RM2245半自動切片機（Leica），ASP200全自動真空脫水機（Leica），BMJ-1B生物組織包埋機（天津愛華），BX41光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS）。

1.4 方法

1.4.1 全身主動過敏試驗方法 實驗用健康豚鼠36只（Hartley,SPF級），每組6只，雌雄各半，致敏給藥3次，隔日分別腹腔注射給予受試物高劑量和低劑量、對照品高劑量和低劑量、陽性對照組（雞蛋清白蛋白）和陰性對照組（0.9%氯化鈉注射液）。在末次注射后的第14 d和21 d各激發(fā)一半動物。所有激發(fā)的動物在激發(fā)注射到注射后約3 h詳細觀察并記錄過敏反應(yīng)情況、癥狀的起止時間。致敏階段高劑量組采用臨床原液，劑量為1.67 mg/kg，低劑量組劑量為0.5 mg/kg，陰性對照組采用0.9%氯化鈉注射液，陽性對照組采用5 mg/只雞蛋清白蛋白，給藥體積均為0.5 mL/只。激發(fā)階段每組劑量為致敏階段的2倍，給藥體積均為1.0 mL/只[3]。過敏反應(yīng)癥狀見表1，全身致敏性評價標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表1 過敏反應(yīng)癥狀

表2 全身致敏性評價標(biāo)準(zhǔn)

1.4.2 被動皮膚過敏試驗方法 本實驗分為抗血清制備階段和皮內(nèi)致敏激發(fā)階段共2個階段[3]。①階段1：抗血清制備階段。實驗用健康豚鼠24只（Hartley，SPF級），雌雄各半，分為6組，分別為對照品高劑量組和低劑量組、受試物高劑量組和低劑量組、陽性對照組和陰性對照組，每組4只，各組分別腹腔給予受試物和對照品高劑量（劑量為1.67 mg/kg），低劑量（劑量為0.5 mg/kg），0.9%氯化鈉注射液及雞蛋清白蛋白5 mg/只，給藥體積均為0.5 mL/只，隔日1次，共3次。末次致敏后14 d，心臟取血，3 000 r/min離心10 min，制備血清，每組動物血清合并，制成混合抗血清。②階段2：皮內(nèi)致敏激發(fā)階段。實驗用健康豚鼠36只，雌雄各半，分為6組，分別為對照品高劑量組和低劑量組、受試物高劑量組和低劑量組、陽性對照組和陰性對照組，每組6只。皮內(nèi)致敏時在脊柱左側(cè)選取1個點，右側(cè)選取2個點。取各組含IgE的抗血清，用0.9%氯化鈉注射液等倍稀釋抗血清至3個梯度，分別為原濃度的1/2、1/4、1/8，依次在上述各點皮內(nèi)注射體積為0.1 mL/點的抗血清。24 h后，各組豚鼠靜脈注射與致敏相同劑量的抗原和0.5 mL的0.5%伊文思藍混合液進行激發(fā)。給藥約30 min后所有動物麻醉后處死。剪取動物背部皮膚以觀察藍斑，測量皮膚內(nèi)層的藍斑直徑。藍斑直徑＞5 mm為陽性，過敏反應(yīng)表示成出現(xiàn)陽性反應(yīng)的最大稀釋倍數(shù)。

1.4.3 溶血試驗方法 取試管14支，受試物和對照品各7支，按下表依次加入2%的紅細胞混懸液和0.9%氯化鈉注射液，混勻后按下表加入不同量的藥液，第6、7分別為陰性、陽性對照管。在搖勻后，置37 ℃恒溫箱中。開始每隔15 min觀察1次，1 h后，每隔1 h觀察1次，觀察3 h，判斷溶液是否出現(xiàn)溶血。最后1 h觀察結(jié)束后對所有試管進行拍照，拍照后輕輕搖晃試管使之混懸，觀察是否有紅細胞凝聚發(fā)生[4]。

表3 溶血試驗加樣表

1.4.4 血管刺激性試驗 取10只新西蘭兔（6雌4雄），受試物組新西蘭兔（3雌2雄）、對照品組新西蘭兔（3雌2雄），采用自身對照。受試物組左耳給受試物，濃度為1 mg/mL，給藥容積為1 mL/kg，右耳給等量的0.9%氯化鈉注射液，對照品組左耳給對照品，濃度為1 mg/mL，給藥體積1 mL/kg，右耳給等量的0.9%氯化鈉注射液，給藥1次，觀察左右耳的刺激反應(yīng)來考察伊班膦酸鈉注射液的血管刺激情況。首次給藥后及每次給藥前、給藥后詳細觀察給藥部位的刺激反應(yīng)，末次給藥72 h后受試物組3只（2雌1雄）、對照品組3只（2雌1雄），麻醉后處死，剩余4只（2雌2雄）動物恢復(fù)期觀察14 d后處死。動物處死后進行常規(guī)取材，剖取包括進針部位及耳緣靜脈的整個耳組織固定于12%乙醛中，從耳尖到耳根取近、中、遠三段。最后脫水、包埋、染色和光鏡檢查。肉眼觀察血管注射部位和周圍組織的刺激性反應(yīng)情況，刺激性癥狀如下：0表示無明顯刺激性、1表示紅斑、2表示水腫、3表示潰瘍；嚴(yán)重程度：+表示輕微、++表示明顯、+++表示嚴(yán)重。根據(jù)肉眼觀察結(jié)果與組織病理學(xué)檢查結(jié)果綜合判定動物的血管刺激性[3]。

2 結(jié)果

2.1 全身主動過敏試驗 本實驗陰性對照組動物在2次激發(fā)注射后均無過敏癥狀。陽性對照組動物在2次激發(fā)注射后均出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)、跳躍、死亡等過敏反應(yīng)癥狀。受試物和對照品低劑量組、受試物和對照品高劑量組動物在2次激發(fā)注射后均無過敏反應(yīng)癥狀。在本中心GLP實驗室條件下，受試物伊班膦酸鈉注射液（批號：191205）無過敏反應(yīng)。對照品伊班膦酸鈉注射液（批號：H1101H03）無過敏反應(yīng)，全身主動過敏反應(yīng)為陰性。結(jié)果見表4～5。

表4 過敏反應(yīng)匯總表

表5 各組個體過敏反應(yīng)記錄表

2.2 被動皮膚過敏試驗 陽性對照組豚鼠背部皮膚1﹕8稀釋點藍色反應(yīng)斑的直徑均值為15.7 mm，1﹕4稀釋點藍色反應(yīng)斑的直徑均值為16.2 mm，在1﹕2稀釋點藍色反應(yīng)斑的直徑均值為28.5 mm，受試物高、低劑量組和對照品高、低劑量組動物激發(fā)注射后，豚鼠背部皮膚未見藍色反應(yīng)斑點。陰性對照組動物激發(fā)注射后，豚鼠背部皮膚未見藍色反應(yīng)斑點。在本中心GLP實驗室條件下，受試物伊班膦酸鈉注射液（批號：191205）和對照品伊班膦酸鈉注射液（批號：H1101H03）在高劑量1.67 mg/kg和低劑量0.5 mg/kg下，被動皮膚過敏反應(yīng)均為陰性。結(jié)果見表6。

表6 藍斑直徑匯總

2.3 溶血試驗 陰性對照未見溶血或紅細胞凝聚，陽性對照可見溶血，表明本實驗中實驗系統(tǒng)可靠有效。受試物1～5號管（藥物濃度1 mg/mL，試管中濃度依次0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.1 mg/mL）在3 h觀察時間內(nèi)，受試物1～5號管未見有溶血現(xiàn)象，拍照后輕輕搖晃試管，各管管底紅細胞能分散，未見紅細胞凝聚現(xiàn)象。對照品1～5號管（藥物濃度1 mg/mL，試管中濃度依次0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.1 mg/mL）在3 h觀察時間內(nèi)，對照品1～5號管未見有溶血現(xiàn)象，拍照后輕輕搖晃試管，各管管底紅細胞能分散，未見紅細胞凝聚現(xiàn)象，受試物和對照品無溶血現(xiàn)象。具體結(jié)果見表7～8。

表7 伊班膦酸鈉注射液溶血試驗結(jié)果-受試物

表8 伊班膦酸鈉注射液溶血試驗結(jié)果-對照品

2.4 血管刺激性試驗 在給藥期和恢復(fù)期肉眼觀察血管，受試物組和對照品組各例兔耳均無明顯刺激性。病理檢查顯示給藥末期，受試物組（受試物）見1例兔耳血管近段內(nèi)皮細胞輕微腫脹，少量中性粒細胞邊集，其余各組各例兔耳血管均未見明顯病變?；謴?fù)期，受試物組（受試物）及對照品組（溶媒對照品）各見1例兔耳血管中段內(nèi)皮細胞輕微腫脹。受試物與對照品均未引起注射局部血管明顯的病理改變。結(jié)果表明，受試物和對照品對兔耳血管無刺激性。圖片見圖1～12。

圖1 受試物組左側(cè)T3451 號近段 HE ×200未見明顯病變。

圖2 受試物組右側(cè)T3451 號近段 HE ×200未見明顯病變。

圖3 受試物組左側(cè)T3451 號中段 HE ×200 未見明顯病變。

圖4 受試物組右側(cè)T3451 號中段 HE ×200未見明顯病變。

圖5 受試物組左側(cè)T3451 號遠段 HE ×200未見明顯病變。

圖6 受試物組右側(cè)T3451 號遠段 HE ×200未見明顯病變。

圖7 對照品組左側(cè)T3453 號近段 HE ×200未見明顯病變。

圖8 對照品組右側(cè)T3453 號近段 HE ×200未見明顯病變。

圖9 對照品組左側(cè)T3453 號中段 HE ×200未見明顯病變。

圖10 對照品組右側(cè)T3453 號中段 HE ×200未見明顯病變。

圖11 對照品組左側(cè)T3453 號遠段 HE ×200未見明顯病變。

圖12 對照品組右側(cè)T3453 號遠段 HE ×200未見明顯病變。

3 討論

伊班膦酸鈉注射液臨床用于治療骨質(zhì)疏松癥，肺癌并骨轉(zhuǎn)移，肝癌并骨轉(zhuǎn)移，乳腺癌并骨轉(zhuǎn)移等惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移疾病，耐受性及效果良好[5-16]。也有實驗表明，伊班膦酸鈉可減輕牙根吸收程度，預(yù)防牙根吸收，減緩正畸牙齒移動。伊班膦酸鈉抑制破骨細胞的活性從而抑制骨吸收的特性在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用[17]。本實驗從過敏性、溶血性及局部刺激性方面比較了制劑（南京恒生制藥有限公司）和參比制劑（Roche Pharma(Schweiz)Ltd）的毒性。結(jié)果表明兩種制劑均無過敏性，溶血性和刺激性，毒性反應(yīng)一致。