通竅活血湯對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠HMGB1、IL-6的影響*

張曉寧，張高煉，高玉廣，梁煒斌，郭建輝，曾敬，陳銳，陳云鵬

廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023

創(chuàng)傷性腦外傷(traumatic brain injury，TBI)是神經(jīng)外科常見的急危重癥[1]，是導(dǎo)致死亡和永久性殘疾的主要原因之一。目前，創(chuàng)傷性腦外傷的治療主要以手術(shù)為主，經(jīng)過治療后，患者的生命得以救治，但是大多數(shù)患者都會留下后遺癥，如偏癱、繼發(fā)性癲癇、頭痛等，甚至生活不能自理，因此，研究其發(fā)病機制和治療靶點對新藥開發(fā)、針對性治療、提高患者生存率至關(guān)重要。高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)是一種新型促炎性細胞因子，為真核細胞核內(nèi)的一種高度保守的非組蛋白，具有調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、穩(wěn)固胞核結(jié)構(gòu)、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)等生物學(xué)功能，為炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控分子。研究表明，HMGB1通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)調(diào)控炎性因子白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)[2-3]，影響創(chuàng)傷性腦損傷的發(fā)生發(fā)展過程?；诖?，本文擬通過動物實驗觀察通竅活血湯對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠HMGB1、IL-6的影響，以期為創(chuàng)傷性腦損傷的治療靶點和新藥開發(fā)提供思路。

1 材料

1.1 動物90只18周齡健康雄性無特定病原體(specific pathogen free，SPF)的SD大鼠自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司購買，許可證號：SCXK(湘)2019-001。動物飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，相對濕度50%～65%，12 h光照、12 h黑暗晝夜變化周期。動物實驗經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準，倫理批號：DW20201011-7。實驗過程符合國家和單位有關(guān)實驗動物的管理和使用規(guī)定。

1.2 藥物及試劑依達拉奉注射液(規(guī)格：20 mL：30 mg，國藥集團國瑞藥業(yè)有限公司，國藥準字：H20080056)。TUNEL試劑盒(瑞士ROCHE公司，貨號：116848202010)；HMGB1 ELISA試劑盒(Arigo Biolaboratories公司，貨號：ARG81351)；IL-6 ELISA試劑盒(武漢賽培生物科技有限公司，貨號：SP12279)。

1.3 儀器腦立體定位儀(成都儀器廠，型號：ST-4ND)；電子分析天平(奧豪斯儀器常州有限公司，型號：AR224CN)；高速低溫組織研磨儀(武漢賽維爾生物科技有限公司，型號：KZ-III-F)。

2 方法

2.1 藥物制備通竅活血湯組方中藥(丹參 30 g，紅花、川芎、生姜、菊花、牛膝、天麻各10 g，生地黃、赤芍、桃仁、柴胡、枳殼、郁金各15 g，甘草6 g，蔥白、大棗各5 g，石菖蒲20 g)由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房代煎，每劑煎得藥液150 mL。藥物根據(jù)《現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實驗動物學(xué)》進行換算，通竅活血湯低、中、高劑量組大鼠灌胃濃度分別相當(dāng)于成人等效劑量的1倍、2倍、4倍，根據(jù)大鼠灌胃體積 10 mL·kg-1將通竅活血湯配成濃度為2.25 g·mL-1、4.5 g·mL-1、9 g·mL-1(生藥量)的溶液。

2.2 創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型制備采用改良的Feeney′s重物自由落體撞擊法建立創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型[4]，具體如下：大鼠于術(shù)前禁食禁水8 h后，以2 mL·kg-1的體積腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液進行麻醉后，對大鼠頭部進行剃毛，并固定于立體定位儀上，用碘伏消毒大鼠頭部，沿頭頂中線縱行切開皮膚全層(長度為2.0～3.0 cm)。將顱骨表面皮下組織與骨膜推向兩側(cè)后，在大鼠人字縫與冠狀縫連線的中線及矢狀縫右側(cè)磨開骨質(zhì)缺損區(qū)(直徑 5 mm)，操作中注意保持硬腦膜的完整性，調(diào)整50 g打擊砝碼的下落位置，使其與大鼠頭部骨質(zhì)缺損區(qū)重合，并升高至20 cm處后，打擊砝碼沿外周導(dǎo)管自由墜落，打擊撞桿從而撞擊大腦硬膜，使大鼠右側(cè)頂葉重度挫裂傷。最后將大鼠轉(zhuǎn)移至恒溫板上，使用明膠海綿及骨蠟封閉顱骨缺損及手術(shù)區(qū)，用線縫合頭皮并使用碘伏消毒。

2.3 動物分組及給藥采用SPSS 23.0產(chǎn)生的隨機序列對實驗動物進行分組，首先將大鼠隨機分為空白組(n=15)和造模組(n=75)，空白組大鼠不予任何處理，而造模組大鼠按2.2項所述方法制備創(chuàng)傷性腦損傷模型。造模完成后，采用SPSS 23.0產(chǎn)生的隨機序列將造模組大鼠分為模型組、通竅活血湯高劑量組、通竅活血湯中劑量組、通竅活血湯低劑量組及依達拉奉組，每組15只。分組完成以后進行藥物干預(yù)，通竅活血湯低劑量組、通竅活血湯中劑量組、通竅活血湯高劑量組大鼠的灌胃濃度分別為2.25 g·mL-1、4.5 g·mL-1、9.0 g·mL-1(生藥量)，依達拉奉組灌胃給予依達拉奉注射液，空白組和模型組灌胃給予生理鹽水，每日2次，灌胃體積為 10 mL·kg-1，連續(xù)干預(yù)7 d。

2.4 大鼠神經(jīng)功能評分本研究使用 改良的Garcia JH(mGarcia JH)評分來反映創(chuàng)傷性腦損傷后大鼠的行為變化及神經(jīng)功能損傷程度。mGarcia JH評分從大鼠自主運動、體態(tài)對稱性、前肢伸展功能、攀爬運動、身體雙側(cè)觸覺、雙側(cè)胡須碰觸反應(yīng)6個方面進行評估，分值為3～18分，數(shù)值越大，神經(jīng)功能損傷越輕，18分為正常。選取3次重復(fù)檢測而得的平均分，每次檢測應(yīng)間隔至少5 min。

2.5 ELISA法檢測腦組織HMGB1、IL-6的水平取部分腦組織勻漿后根據(jù)ELISA試劑盒說明書進行操作，于波長490 nm處分別測定各孔的吸光度值，采用GraphPad Prism4.0軟件計算HMGB1、IL-6的水平。

2.6 TUNEL染色檢測大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞凋亡情況根據(jù)TUNEL染色試劑盒說明書的程序完成操作步驟，切片準備完畢后，隨機選取大鼠受傷腦組織部位，顯微鏡觀察細胞凋亡情況，同時計算細胞凋亡率。

2.7 HE染色觀察腦組織病理變化從儲存冰箱中取出大鼠的腦組織標(biāo)本，在分析天平上分別稱取100 mg，采用甲醛進行固定，然后修剪、脫水、透明，采用石蠟對組織進行包埋，制成5μm厚度的切片，然后展片、脫蠟至水、染色，在熒光顯微鏡下對比觀察大鼠大腦組織病變情況。

2.8 濕干比法測定腦水腫含量麻醉并處死大鼠后，打開顱骨，取各只大鼠相同部位的部分腦組織，用濾紙吸干表面水分后，立即稱其質(zhì)量即為腦組織濕質(zhì)量。將稱量過的腦組織標(biāo)本放置在70 ℃烘干箱中高溫72 h直至恒質(zhì)量，稱其質(zhì)量得到干質(zhì)量，計算濕干比評估大鼠腦組織含水量。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較與空白組比較，模型組大鼠的 mGarcia JH評分顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組大鼠的mGarcia JH評分顯著升高(P<0.05)；與通竅活血湯低劑量組比較，通竅活血湯高、中劑量組及依達拉奉組大鼠的mGarcia JH評分顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較

3.2 各組大鼠腦組織HMGB1、IL-6水平比較與空白組比較，模型組大鼠腦組織HMGB1、IL-6水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組大鼠腦組織HMGB1、IL-6水平顯著降低(P<0.05)；與通竅活血湯低劑量組比較，通竅活血湯高、中劑量組及依達拉奉組大鼠腦組織HMGB1、IL-6 水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腦組織HMGB1、IL-6水平比較

3.3 各組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞凋亡水平比較與空白組比較，模型組大鼠神經(jīng)凋亡細胞數(shù)量顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組大鼠神經(jīng)凋亡細胞數(shù)量顯著降低(P<0.05)；與通竅活血湯低劑量組比較，通竅活血湯高、中劑量組及依達拉奉組大鼠神經(jīng)凋亡細胞數(shù)量顯著降低(P<0.05)。見表3，圖1。

表3 各組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞凋亡水平比較

注：A：空白組；B：模型組；C：通竅活血湯高劑量組；D：通竅活血湯中劑量組；E：通竅活血湯低劑量組；F：依達拉奉組圖1 各組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞凋亡水平比較(TUNEL染色，×100)

3.4 各組大鼠腦組織病理變化比較HE染色顯示：空白組可見清晰的細胞膜和細胞核，未見明顯細胞壞死及增生等情況發(fā)生；模型組腦組織的血腫周圍呈充血腫脹，出血，細胞壞死，有膠質(zhì)細胞增生；通竅活血湯中劑量和依達拉奉組腦組織血腫、出血的范圍及膠質(zhì)細胞增生數(shù)量等明顯減少。見圖2。

注：A：空白組；B：模型組；C：通竅活血湯高劑量組；D：通竅活血湯中劑量組；E：通竅活血湯低劑量組；F：依達拉奉組圖2 各組大鼠腦組織病理變化比較(HE染色，×100)

3.5 各組大鼠腦組織含水量比較與空白組比較，模型組大鼠腦組織含水量顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組大鼠腦組織含水量顯著降低(P<0.05)；與通竅活血湯低劑量組比較，通竅活血湯高、中劑量組及依達拉奉組大鼠腦組織含水量顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠腦組織含水量比較

4 討論

TBI的特征是損傷部位的持續(xù)性神經(jīng)炎性反應(yīng)，最終導(dǎo)致廣泛的神經(jīng)元死亡[5]。HMGB1是創(chuàng)傷性腦損傷后釋放的最早的促炎細胞因子之一，是神經(jīng)炎癥的主開關(guān)[6]。HMGB1是一種位于細胞核中的染色質(zhì)相關(guān)蛋白，是高度保守的非組蛋白DNA結(jié)合蛋白，可在生理條件下穩(wěn)定染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、控制轉(zhuǎn)錄和DNA 修復(fù)[7]。但是，在病理條件下，HMGB1可損傷相關(guān)分子蛋白。HMGB1由壞死神經(jīng)元和募集到損傷部位的其他免疫細胞在細胞外釋放，然后與相應(yīng)的靶受體結(jié)合，從而上調(diào)包括HMGB1在內(nèi)的其他促炎細胞因子的釋放[8]。一旦HMGB1被釋放到細胞外，它就會成為一種重要的促炎因子[9]。鑒于HMGB1在介導(dǎo)神經(jīng)炎癥和神經(jīng)發(fā)生中的雙重作用，它有望成為治療TBI的潛在靶點。Gao等[10]通過腦損傷大鼠實驗發(fā)現(xiàn)，甘草素通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞的激活來減輕TBI，該作用至少部分是通過抑制HMGB1實現(xiàn)的。因此，靶向HMGB1以調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞極化應(yīng)該是TBI 的一種潛在治療方法。Yang等[11]研究了HMGB1 A-box片段(一種與全長HMGB1競爭受體結(jié)合的拮抗劑)對抗TBI的治療效果發(fā)現(xiàn)，HMGB1 A-box可逆轉(zhuǎn)TBI后小鼠的腦損傷，還可通過保護血腦屏障的完整性，改善細胞變性，減少TBI后受損腦組織促炎細胞因子的釋放，顯著減輕腦水腫，因此，HMGB1 A-box片段可能具有治療TBI繼發(fā)性腦損傷的潛力。從中藥甘草中分離得到的甘草甜素治療TBI模型小鼠發(fā)現(xiàn)，其可抑制TBI小鼠中HMGB1的水平，從而降低腦水腫[12]。

腦外傷患者的腦脊液中存在高水平的IL-6 和可溶性IL-6 受體。為應(yīng)對損傷，IL-6 充當(dāng)創(chuàng)傷后炎癥發(fā)生和發(fā)展的重要介質(zhì)，進一步導(dǎo)致細胞死亡和神經(jīng)功能障礙。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中IL-6 的過度產(chǎn)生會增加炎性細胞因子的產(chǎn)生，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)時，IL-6 可能具有促炎作用，因此IL-6可能是治療干預(yù)腦損傷的靶點[13]。吡格列酮是過氧化物酶體增殖物激活的受體-γ的激活劑，可改善TBI后大鼠的神經(jīng)損傷，減輕腦水腫，并且吡格列酮的保護作用是通過調(diào)控PPARγ/NF-κB/IL-6信號通路來實現(xiàn)的[14]。Hergenroeder 等[15]對比健康志愿者和嚴重 TBI 患者血清中炎性細胞因子的水平發(fā)現(xiàn)，血清IL-6可用于TBI中升高的顱內(nèi)壓的鑒別診斷。Aisiku 等[16]發(fā)現(xiàn)，血漿細胞因子IL-6與嚴重顱腦外傷患者的急性呼吸窘迫綜合征有關(guān)。去甲腎上腺素可通過阻斷ERK、MAPK和IL-6對幼豬的腦損傷發(fā)揮腦部自動調(diào)節(jié)功能改善的作用，并減少海馬壞死[17-18]。

中醫(yī)古籍中沒有對創(chuàng)傷性腦損傷的明確描述，大部分醫(yī)家根據(jù)創(chuàng)傷性腦損傷后出現(xiàn)的學(xué)習(xí)認知能力、記憶能力、情感障礙等把其歸屬于中醫(yī)的“頭痛”“頭部內(nèi)傷”等范疇。臨床上病人頭部外傷后多呈現(xiàn)明顯頭痛，故而醫(yī)者認為本病病機主要為跌撲閃挫、頭部外傷，氣血滯澀，瘀血阻于腦絡(luò)，其代表性方藥常選用通竅活血湯，此方活血化瘀、通竅止痛，臨床效果確切。

通竅活血湯由清代醫(yī)家王清任所創(chuàng)，原記載于《醫(yī)林改錯》，是活血化瘀的名方、驗方，其方選丹參、赤芍、川芎行血活血，桃仁、紅花活血化瘀，生地黃、當(dāng)歸生血養(yǎng)血，蔥白、生姜通陽散結(jié)，牛膝活血且可導(dǎo)瘀下行，柴胡疏肝解郁，枳殼行氣，菊花清熱且可載藥上達，甘草、大棗益氣和中。通竅活血湯治療腦組織及腦血管疾病方面的臨床及實驗研究廣泛，為創(chuàng)傷性腦損傷的臨床治療及動物實驗提供了良好的基礎(chǔ)。劉昌亞等[19]研究通竅活血湯對動脈瘤破裂蛛網(wǎng)膜下腔出血的患者早期腦損傷的作用發(fā)現(xiàn)，加用通竅活血湯患者比單純動脈瘤栓塞治療的患者血清細胞內(nèi)黏附分子-1、IL-1β的水平更低。安聰[20]發(fā)現(xiàn)，通竅活血湯對重型顱腦損傷大鼠急性期的神經(jīng)損傷有一定的治療效果，其作用可能是通過降低IL-6的含量，從而減輕繼發(fā)性炎癥反應(yīng)實現(xiàn)的。金正龍等[21]發(fā)現(xiàn)，采用通竅活血湯聯(lián)合丁苯酞治療的老年慢性腦缺血患者的HMGB1水平顯著低于單純丁苯酞治療患者。以上研究從炎癥反應(yīng)角度說明了通竅活血湯對腦損傷相關(guān)性疾病的作用。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)，通竅活血湯能降低腦缺血再灌注損傷小鼠腦中伊文思藍的含量，提高腦損傷后單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的水平，對腦缺血再灌注模型小鼠神經(jīng)功能有一定的保護作用[22]。通竅活血湯還可通過激活PI3K/AKt/mTOR通路抑制腦缺血損傷后大鼠的神經(jīng)細胞自噬，發(fā)揮神經(jīng)保護的作用[23]。薛廣團等[24]對中重度創(chuàng)傷性腦損傷患者在對癥治療基礎(chǔ)上增加針灸和通竅活血湯加味治療，為期8周，用格拉斯哥昏迷評分、殘疾分級評分、日常生活能力評分和格拉斯哥預(yù)后評分比較臨床療效發(fā)現(xiàn)，增加針灸和通竅活血湯加味組患者的相關(guān)評分和有效率更佳。本研究采用通竅活血湯治療腦外傷大鼠發(fā)現(xiàn)，通竅活血湯組大鼠的神經(jīng)功能評分顯著升高，HMGB1、IL-6含量、神經(jīng)細胞凋亡數(shù)量、腦組織含水量顯著降低，提示通竅活血湯可通過降低HMGB1、IL-6的含量，減少神經(jīng)細胞凋亡和腦組織含水量，促進創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)恢復(fù)。

綜上所述，通竅活血湯可以降低HMGB1、IL-6的含量，減少神經(jīng)細胞凋亡和腦組織含水量，促進創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)恢復(fù)。本研究存在一定的局限性，尚缺乏相關(guān)機制研究，后續(xù)需要通過細胞學(xué)、動物學(xué)方面的實驗研究闡明相關(guān)機制。