cGAS-STING信號通路與膿毒癥腸屏障功能障礙相關性的研究進展

高薇薇， 王 梟， 關 鵬(綜述)， 高萬朋(審校)

膿毒癥是指因感染引起的宿主反應失調導致的危及生命的器官功能障礙[1]。而腸道被描述為膿毒癥和器官衰竭的“發(fā)動機”[2]。雖然膿毒癥的發(fā)病機制復雜，但許多研究表明腸上皮細胞(intestinal epithelial cells，IECs)凋亡增加由促炎細胞因子和干擾素[3]的分泌增強所致，并最終導致腸屏障功能障礙，造成腸道菌群失調可引起腸道黏膜屏障受損，內毒素及致病菌可入血，引起機體產生炎性介質釋放誘發(fā)人體一系列炎癥和免疫反應[4]。近年來，研究發(fā)現了一種新的胞質DNA傳感器環(huán)鳥苷酸腺苷酸合酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthetase,cGAS)以及干擾素基因的刺激因子(stimulator of interferon genes,STING)。越來越多的研究表明，該信號通路的激活對于宿主抵御病毒、細菌感染以及癌癥至關重要，特別是與腸道穩(wěn)態(tài)有關，過度激活可以導致腸屏障功能障礙[5]。因此，深入了解膿毒癥發(fā)生時cGAS-STING信號通路激活及作用機制，對于改善膿毒癥腸屏障功能障礙具有重要意義。本文就cGAS-STING信號通路的激活、cGAS-STING信號通路與膿毒癥腸道炎癥反應和cGAS-STING信號通路對腸屏障功能的影響作一綜述。

1 cGAS-STING信號通路的激活

STING是一種參與對細菌產物先天免疫應答的適配器蛋白，存在于各種細胞類型中的內質網中，包括上皮細胞、內皮細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞。在膿毒癥期間，病原體相關分子模式蛋白(pathogen-associated molecular pattern molecules,PAMPs)和損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)表達在入侵的組織器官上，并且以受體識別模式(pattern recognition receptors,PRRs)的方式被腸道識別并激活STING信號，將微生物的胞質傳感與宿主細胞的效應功能聯系起來。除了微生物感應之外，STING也能被宿主自身脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)激活[6]。刺激STING信號環(huán)二核苷酸(cyclic dinucleotides,CDNs)是重要的細菌代謝產物，而DNA存在于大多數微生物中，在核DNA(nuclear DNA,nDNA)損傷或線粒體斷裂后，nDNA或線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)被釋放到細胞質中，這兩種微生物被cGAS及其第二信使環(huán)鳥苷酸腺苷酸(cyclic GMP-AMP,cGAMP)識別[7-8]。cGAMP可通過體積調節(jié)的陰離子通道或縫隙連接易位到鄰近細胞，導致鄰近細胞的STING激活[9]。在與cGAMP結合后，STING通過高爾基體和內質網高爾基中間室運輸，最終轉移到核周區(qū)域的囊泡中。激活的STING隨后招募TANK結合激酶1(TANK- binding kinase 1,TBK1)，并磷酸化干擾素調節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3)和核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)。這些轉錄因子能夠從細胞質易位到細胞核，誘導先天免疫基因轉錄，有助于最終產生Ⅰ型干擾素(interferon-Ⅰ,IFN-Ⅰ)和其他炎性細胞因子，如白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)。cGAS-STING介導的炎癥、IFN-Ⅰ反應和細胞死亡可能導致或加重膿毒癥和膿毒性休克的發(fā)病[10]。

2 cGAS-STING信號通路與膿毒癥腸道炎癥反應

膿毒癥的急性期表現為對感染的炎癥反應以及過度釋放促炎介質。因此，抑制免疫反應的關鍵炎癥調節(jié)因子可能有助于治療膿毒癥。cGAS-STING途徑的不當激活或過度激活可產生大量IFN-Ⅰ，釋放至細胞外的IFN-Ⅰ能夠以自分泌或旁分泌的方式，結合自身或者周圍細胞上的IFN-Ⅰ受體(IFN α receptor,IFNAR)，進一步激活其下游JAK-STAT通路，誘導數百個干擾素刺激基因(IFN- stimulated genes,ISGs)的表達，導致自身炎癥和自身免疫性疾病[11-12]。Aden等[13]表明，IECs中激活的STING信號可誘導強烈的TNF-α和ISGs反應，從而導致過度的回腸炎癥和廣泛的上皮細胞壞死。有研究認為，由cGAS觸發(fā)的IFN-Ⅰ也可以通過干擾素受體信號再次誘導cGAS的表達，IFN-Ⅰ過度激活導致免疫系統(tǒng)紊亂[14]。而STING激動劑可以激活STING，加重了膿毒癥大鼠的腸黏膜損傷，證明了STING信號的激活加重了膿毒癥腸道損傷和腸道屏障紊亂[12]。此外，研究證實NF-κB具有調控復雜的炎癥細胞因子網絡的重要作用，NF-κB由STING激活后，進入細胞核，調控TNF-α和IL-1等炎癥介質的基因表達，進一步作用于巨噬細胞等產生大量IL-6、IL-8等繼發(fā)性細胞因子和介質。與此同時，STING可以誘發(fā)釋放IL-10等抗炎細胞因子[15]，進一步激活NF-κB，從而形成正反饋的級聯放大效應，產生過度的炎癥反應，加重組織和細胞的損害。因此，需要表達免疫負調控因子準確、適時地調整胞內信號通路的激活，避免發(fā)生過強的免疫反應，從而保證機體免疫平衡。對cGAS-STING通路的負向調控還可減少其他炎癥因子如IL-6、TNF-α表達，減輕細胞因子風暴及組織損傷程度[16]，這為治療膿毒癥腸道炎癥損傷提供了新的思路。

3 cGAS-STING信號通路對腸屏障功能的影響

3.1cGAS-STING信號通路對腸道通透性的影響 腸道的內部是由IECs構成，IECs可以起到隔絕內部組織與外界接觸的作用，并且可以吸收食物中的營養(yǎng)物質，與腸道內的微生物接觸，并且清除病原體、內毒素和抗原物質。當這個過程受到干擾，腸道的穩(wěn)態(tài)被破壞繼而引發(fā)疾病。相鄰的IECs通過緊密連接(tight junctions,TJs)銜接，形成細胞旁密封以防止親水分子的混合物進入并能夠通過PRRs的方式識別細菌，通過分泌趨化因子將這些信息傳遞給免疫系統(tǒng)的細胞[17]。TJs是由完整的膜蛋白，包括閉鎖蛋白(claudins)、胞質附著蛋白(occludin)、連接黏附分子(junctional adhesion molecules,JAMs)和閉鎖小帶蛋白-1(zonula occluden-1,ZO-1)組成的多蛋白復合物連接到肌動蛋白細胞骨架。TJs在調節(jié)上皮細胞通透性中發(fā)揮著重要作用。STING的激活啟動IRF3和NF-κB，導致IFN-Ⅰ和炎癥細胞因子的表達增強[11]。其中TNF-α是膿毒癥最重要的炎癥因子，而IECs是其攻擊的主要靶細胞。TNF-α通過與IECs上表達的TNF受體2結合，誘導炎癥過程中的肌球輕鏈激酶(myosin light chain kinase，MLCK)上調，可以使肌球蛋白鉛磷酸化導致細胞骨架收縮和中斷，上調ZO-1、occludin受阻，并且導致黏液層的破壞，TJs改變，使得上皮通透性增加，導致細菌易位[18]。在Hu等[12]的研究中，膿毒癥大鼠模型，STING敲除組相對于膿毒癥組的ZO-1和claudins水平顯著升高，并且發(fā)現了TJs改善，證明了cGAS-STING信號可以造成TJs改變，導致腸道通透性增加，最終造成腸道菌群易位。

3.2細胞死亡 在膿毒癥急性期，不受控制的程序性細胞死亡導致多器官衰竭或免疫抑制的發(fā)展[19]。細胞死亡(包括凋亡、焦亡和壞死性凋亡)，是調節(jié)細菌感染的膿毒癥反應的關鍵。細胞死亡是組織發(fā)育和平衡的關鍵過程，以消除多余的、損傷的或老化的細胞，是急性或慢性損傷后穩(wěn)態(tài)重建的關鍵，限制炎癥刺激的傳播，以防止組織功能的喪失，這對胃腸道特別重要。因此，上皮細胞的更新和細胞死亡需要被嚴格調控，不適當的細胞死亡反應會導致疾病發(fā)展。這種穩(wěn)態(tài)功能反映了受損或衰老細胞的消除以及死亡細胞暴露或釋放激活免疫反應的DAMPs的能力[20]。有研究表明，STING不僅介導細胞死亡，而且在識別和放大死亡細胞誘導的免疫反應中發(fā)揮作用[21]。

3.2.1 凋亡 細胞凋亡被定義為依賴半胱氨酸蛋白酶(caspase)激活的程序性死亡過程。IECs凋亡被認為是腸道屏障功能障礙的關鍵加速劑之一。最近的研究評估了STING信號通路在凋亡激活中的新作用。Diner等[22]證明cGAS依賴的免疫信號進一步誘導caspase-3的激活，通過激活STING-TBK1-IRF3通路導致細胞凋亡。mtDNA尤其可能通過STING信號在介導細胞凋亡中發(fā)揮關鍵作用。mtDNA的釋放，從而激活cGAS-STING通路，促進IFNs的產生，繼而介導細胞凋亡[23]。在膿毒癥小鼠模型中，mtDNA水平的升高可誘導腸上皮細胞中STING依賴性的凋亡[12]。STING介導的細胞凋亡的機制主要與內質網應激后產生的標志物以及內質網鈣信號通路增強了細胞對凋亡的敏感性相關[24]。綜上，STING1-IRF3通路既參與凋亡來源的免疫反應，也參與凋亡誘導。該通路可被caspase調控，而STING、內質網應激與凋亡之間的相互作用和反饋機制肯定是復雜的。

3.2.2 焦亡 焦亡是一種主要依賴caspase-11激活的程序性細胞死亡類型[25]，在炎癥和免疫中起核心作用。過度激活的焦亡可能導致膿毒癥、膿毒性休克以及器官功能障礙。免疫細胞內的炎癥小體為促炎因子(IL-1β和IL-18)的成熟和產生提供了分子平臺。特別是炎癥小體招募caspase-1的過程有助于caspase-1的激活以及炎癥細胞因子的產生和焦亡的啟動[26]。在其機制方面，可能有3種途徑參與了STING依賴的炎癥小體的激活和焦亡：(1)炎癥小體的轉錄上調需要STING介導的IRF3；(2)STING可以直接結合并促進炎癥小體在內質網中的定位，從而抑制炎癥小體的泛素降解[27]；(3)在對人髓系細胞中胞質DNA的反應中，cGAS-STING通路通過STING介導的溶酶體細胞死亡激活鉀外排介導的炎癥小體。這些表明cGAS-STING通路觸發(fā)與細胞質DNA相關的焦亡和促炎反應。

3.2.3 壞死性凋亡 壞死性凋亡是一種受調控的程序性細胞死亡機制，由多種死亡受體、模式識別受體和細胞因子共同驅動，在許多炎癥和疾病狀態(tài)中發(fā)揮重要作用。這種凋亡最初被報道與受體相互作用蛋白激酶(receptor interacting protein kinase,RIPK)1和RIPK3有關。刺激后，RIPK1和RIPK3被壞死體復合體中的自身磷酸化激活。隨后，混合譜系激酶結構域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)被招募并被RIPK3磷酸化，導致MLKL寡聚。寡聚MLKL轉運到細胞膜上，促進質膜通透性，從而引發(fā)壞死性凋亡。RIPK3和MLKL目前被認為是介導這種形式死亡的主要靶點，表明STING-IRF3-RIPK3-MLKL通路通過磷酸化機制驅動壞死性凋亡。此外，TNF-α的產生也參與了STING介導的壞死。Li等[16]的研究發(fā)現IFN-Ⅰ控制細胞凋亡、壞死和壞死性凋亡信號的關鍵介質的轉錄。Zhang等[5]的研究揭示mtDNA介導的STING信號通過IFN-Ⅰ和TNF-α信號的協(xié)同作用觸發(fā)腸道細胞壞死性凋亡。cGAS-STING的激活可導致RIPK3介導的壞死性凋亡，這需要STING依賴的IFN-Ⅰ和TNF-α的產生?？傊?，這些數據表明，STING信號通路通過至少兩種機制觸發(fā)壞死，即誘導MLKL表達或MLKL磷酸化。此外，壞死性凋亡誘導的RIPK3釋放可能作為腸道損傷的生物標志物[28]。

3.3自噬機制 自噬是抵御微生物侵襲的天然免疫防御機制，可通過抑制促炎復合物或增強受損細胞器的清除來保護IECs免受過度的炎癥刺激[29]，在細胞和組織的動態(tài)平衡中起重要作用，是一種有益的生命過程。自噬異?？蓪е履c道內穩(wěn)態(tài)失衡和慢性腸道炎性疾病的發(fā)生。有研究表明，STING激活伴隨著明顯促進的脂質過氧化損傷，這也表明在這一時期發(fā)生了自噬的抑制[30]。隨著膿毒癥的發(fā)展，自噬活性逐漸下降[31]。因此，STING激活介導的自噬變化是臨床預后不良的關鍵轉折點。STING激活以IFN-Ⅰ依賴的方式干擾溶酶體酸化，而不影響自噬小體的生物發(fā)生或融合。然而，過度STING激活引起的副作用的機制仍有待進一步研究。循環(huán)中的mtDNA被巨噬細胞的STING途徑識別，導致溶酶體酸化功能障礙，并阻礙自噬是膿毒癥中遠處器官損傷的另一種機制，與致病菌引起的感染性損傷同時發(fā)生[32]。beclin-1自噬蛋白與cGAS的直接相互作用不僅抑制STING信號，減少胞質DNA刺激下的IFNs分泌，而且促進自噬介導的胞質DNA降解，以防止cGAS過度激活。同樣，參與自噬機制的關鍵基因可以抑制STING-TBK1-IRF3通路，有效抑制持續(xù)免疫反應和過度炎癥[11]。這些發(fā)現為通過誘導自噬或抑制STING途徑減輕膿毒癥腸道損傷，改善腸屏障功能提供了新的見解。

3.4NLRP3炎癥小體 NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)炎癥小體是先天免疫系統(tǒng)的重要中介途徑。NLRP3炎癥小體成分主要包括3個成員：凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)、NLRP3和凋亡細胞蛋白酶原(procaspase)-1[33]。硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)是一種內源性活性氧(reactive oxygen species,ROS)抑制劑清除蛋白，當細胞受到PAMPs和DAMPs誘導的ROS挑戰(zhàn)時，它將與TXNIP-硫氧還蛋白(TXNIP-thioredoxin,Trx)復合物分離，并與NLRP3結合。隨后，NLRP3/TXNIP復合物招募其他2個成員(ASC和procaspase-1)，形成NLRP3炎癥小體，促進caspase-1的激活，IL-18和IL-1β的產生，以及炎癥和細胞焦亡的啟動[34]。然而，STING在膿毒癥腸屏障功能障礙中的作用及其對NLRP3的潛在調控作用至今尚未得到很好的研究。NLRP3的表達可以通過STING-IRF3依賴的方式被激活，Li等[35]研究了STING通過激活NLRP3信號通路導致脂多糖誘導的組織功能障礙、炎癥、凋亡和焦亡。此外，抑制cGAS也阻斷了STING和NLRP3炎癥小體的激活。膿毒癥狀態(tài)下，機體NLRP3炎癥小體及下游分子高表達，通過增加促炎因子的成熟釋放及誘導凋亡反應，參與調控膿毒癥免疫反應，與器官功能障礙及不良預后密切相關。

4 結語

cGAS-STING信號通路在腸道穩(wěn)態(tài)中具有重要作用。在膿毒癥中，CDNs和mtDNA激活cGAS-STING通路誘導的過度炎癥反應，造成TJs破壞、IECs死亡、阻斷自噬以及誘導炎癥小體形成，導致腸屏障完整性損傷，腸道通透性增加以及菌群易位，最終造成腸屏障功能障礙。這些過程不僅放大了STING信號通路的激活，還可以誘導嚴重的全身炎癥反應，兩者都可能導致細胞因子風暴和加重膿毒癥多臟器功能障礙。因此，阻斷cGAS-STING信號通路可能是調節(jié)膿毒癥過度炎癥反應和腸道屏障功能障礙的潛在治療方法和作用靶點。這可能為膿毒癥的發(fā)病機制及治療提供新的思路。