基于DNA甲基化測(cè)序技術(shù)研究青蒿琥酯干預(yù)腦膠質(zhì)瘤的分子機(jī)制

閆向英，毛 霞#，李 濤，Koji Mizuno，Katsuki Okuyama，林 娜，張彥瓊*，Takashi Sato*

? 藥理與臨床 ?

基于DNA甲基化測(cè)序技術(shù)研究青蒿琥酯干預(yù)腦膠質(zhì)瘤的分子機(jī)制

閆向英1，毛 霞1#，李 濤1，Koji Mizuno2，Katsuki Okuyama2，林 娜1，張彥瓊1*，Takashi Sato2*

1. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700 2. 東京藥科大學(xué) 生物化學(xué)系，東京 192-0392

探究青蒿琥酯干預(yù)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）的藥效及其潛在分子機(jī)制。采用Cell Titer-Blue檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)U87和U251 2種人源膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞活性和增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)2種細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)作用；采用qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)2種細(xì)胞自噬水平的影響。采用DNA甲基化聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從表觀遺傳學(xué)層面研究青蒿琥酯干預(yù)GBM的靶標(biāo)基因，并建立蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣髦?，篩選出青蒿琥酯干預(yù)GBM的核心靶點(diǎn)并進(jìn)行生物功能富集分析；采用AutoDock v4.2.6和AutoDock Vina v1.2.0軟件開(kāi)展分子對(duì)接虛擬計(jì)算，考察青蒿琥酯與其候選關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合能力，并采用Western blotting驗(yàn)證青蒿琥酯對(duì)2種腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中關(guān)鍵靶點(diǎn)表達(dá)的影響。青蒿琥酯可顯著抑制U87細(xì)胞的活性和增殖（＜0.05、0.01、0.001），而對(duì)U251細(xì)胞的藥效不顯著；高劑量青蒿琥酯可影響2種細(xì)胞周期分布；高劑量青蒿琥酯可顯著提高U87細(xì)胞中3種自噬標(biāo)志分子[自噬關(guān)鍵分子酵母Atg6同系物（ATG6 autophagy related 6 homolog，）、泛素結(jié)合蛋白（ubiquitin-binding protein，）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，）]的mRNA表達(dá)水平（＜0.001），而僅高劑量青蒿琥酯升高U251細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平（＜0.05）；低、中、高劑量青蒿琥酯可顯著提高U87細(xì)胞中Beclin1、p62、LC3B蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01），僅中、高劑量青蒿琥酯可以影響U251細(xì)胞中Beclin1、p62、LC3B蛋白表達(dá)。利用給藥前后的U87與U251細(xì)胞進(jìn)行DNA甲基化測(cè)序與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整合分析，在獲得青蒿琥酯敏感型和耐藥型腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的差異基因集，以及青蒿琥酯干預(yù)2種細(xì)胞效應(yīng)基因集的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)其干預(yù)2類(lèi)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)共同參與GBM惡性進(jìn)展密切相關(guān)的血小板衍生生長(zhǎng)因子受體α（platelet derived growth factor receptor α，PDGFRA）-大鼠肉瘤基因（rat sarcoma viral oncogene homolog，RAS）-B-Raf原癌基因（B-Raf proto-oncogene，BRAF）-絲裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）-細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）通路，且青蒿琥酯與其直接靶標(biāo)（PDGFRA、BRAF）具有較強(qiáng)的親和力。Western blotting實(shí)驗(yàn)證實(shí)青蒿琥酯可以抑制U87和U251細(xì)胞中關(guān)鍵靶點(diǎn)PDGFRA和BRAF蛋白的表達(dá)（＜0.05、0.01、0.001）。青蒿琥酯可能通過(guò)靶向調(diào)控PDGFRA-RAS-BRAF-MEK-ERK信號(hào)通路，從而抑制GBM細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散，為青蒿琥酯治療GBM提供了體外實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為解決臨床抗腫瘤藥物的耐藥問(wèn)題提供了新思路和新方法。

青蒿琥酯；膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；DNA甲基化分析；耐藥；PDGFRA-RAS-BRAF-MEK-ERK信號(hào)通路

膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的惡性原發(fā)性腦腫瘤，其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）是最普遍及侵襲性最強(qiáng)的一類(lèi)形式。研究表明，全球每10萬(wàn)人就有0.59～3.69人患病[1]，中位生存期僅有15個(gè)月[2]。目前標(biāo)準(zhǔn)治療方式主要是手術(shù)及放療或化療，同時(shí)口服替莫唑胺。然而替莫唑胺治療受到獲得性化學(xué)抗性的限制，并不能很好地控制腦膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移，5年生存率低于5.5%[3]。因此，開(kāi)發(fā)GBM的新療法成為現(xiàn)代神經(jīng)科學(xué)和腫瘤學(xué)最首要的任務(wù)之一。

青蒿琥酯是青蒿素的衍生物，可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[4]。已有研究證實(shí)，青蒿琥酯具有治療GBM的潛能[5-6]，但對(duì)于抗GBM的機(jī)制研究尚不充分。隨著對(duì)表觀遺傳學(xué)的深入研究，DNA甲基化測(cè)序技術(shù)也逐漸成熟并被運(yùn)用到研究多種疾病進(jìn)展的分析中。研究表明，DNA甲基化在維持細(xì)胞功能、遺傳印記、胚胎發(fā)育以及人類(lèi)腫瘤的發(fā)生中起著重要作用。截至目前，大多數(shù)關(guān)于GBM表觀遺傳改變的研究都指出了DNA甲基化的作用，如全基因組低甲基化、基因特異性低甲基化和高甲基化[7]。此外，關(guān)于GBM的表觀遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳學(xué)修飾與其生物學(xué)特征和治療靶點(diǎn)相關(guān)[8]?；騿?dòng)子甲基化等遺傳生物標(biāo)志物是GBM患者重要的預(yù)后影響因素，被認(rèn)為是患者治療和預(yù)后的重要靶點(diǎn)[9]。因此，本研究基于給予青蒿琥酯前后人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87細(xì)胞和人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞2種細(xì)胞模型，進(jìn)行藥效觀察和細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，結(jié)合DNA甲基化和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，從表觀遺傳學(xué)層面探討青蒿琥酯干預(yù)GBM的分子機(jī)制，為GBM的治療提供新思路。

1 材料

1.1 細(xì)胞

U87細(xì)胞（批號(hào)CL-0238）、U251細(xì)胞（批號(hào)CL-0237）購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥品與試劑

青蒿琥酯（批號(hào)1042850）；替莫唑胺（批號(hào)PHR1437-1G）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；CellTiter-Blue?試劑（批號(hào)G8080）購(gòu)自美國(guó)Promega公司；PBS（批號(hào)SH30256.01）、DMEM高糖培養(yǎng)基（批號(hào)8122292）、雙抗（批號(hào)SV30010）購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，批號(hào)16000-044）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；DNA含量檢測(cè)試劑盒（批號(hào)CA1510）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Trizol試劑（批號(hào)10296028）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)K1691）購(gòu)自Invitrogen公司；自噬關(guān)鍵分子酵母Atg6同系物（ATG6 autophagy related 6 homolog，Beclin1）兔單克隆抗體（批號(hào)A21191）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B（microtubule-associated protein 1 light chain 3B，LC3B）兔單克隆抗體（批號(hào)A19665）、泛素結(jié)合蛋白（ubiquitin-binding protein，p62）兔單克隆抗體（批號(hào)A19700）、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體α（platelet derived growth factor receptor α，PDGFRA）兔單克隆抗體（批號(hào)A2103）、B-Raf原癌基因（B-Raf proto-oncogene，BRAF）兔單克隆抗體（批號(hào)A21612）購(gòu)自ABclonal公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號(hào)60004-1-IG）、山羊抗小鼠IgG多克隆抗體（批號(hào)SA00001-1）購(gòu)自Proteintech公司；山羊抗兔IgG多克隆抗體（批號(hào)7074S）購(gòu)自美國(guó)CST公司；DNeasy組織試劑盒（批號(hào)69506）購(gòu)自Qiagen公司；EZ DNA甲基化試劑盒（批號(hào)D5001/D5003）購(gòu)自Zymo Research。

1.3 儀器

5840R型低溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；Multiskan GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、ND-2000型Nanodrop超微量分光光度計(jì)、3.0 Quibt Fluorometer熒光定量?jī)x（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；NovoCyte流式細(xì)胞儀（美國(guó)Agilent公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

U87細(xì)胞和U251細(xì)胞用含10% FBS、1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期傳代備用。

2.2 Cell Titer-Blue檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)細(xì)胞活性和增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，給藥組加入200 μL含藥培養(yǎng)基（分別含0.000 018、0.000 18、0.001 8、0.018、0.18、1.8、18、180 μg/mL青蒿琥酯），對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)基，并設(shè)置不含細(xì)胞的空白孔，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL Cell Titer-Blue試劑，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，于560 nm/590 nm處測(cè)定吸光度（）值，計(jì)算細(xì)胞存活率，探索藥物的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）。

細(xì)胞存活率＝(給藥－空白)/(對(duì)照－空白)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，U87細(xì)胞給藥組加入200 μL含藥培養(yǎng)基（分別含0.18、1.8、18 μg/mL青蒿琥酯），對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)基，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)3、6、10、20、24 h后，每孔加入20 μL Cell Titer-Blue試劑，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，于560 nm/590 nm處測(cè)定值。U251細(xì)胞給藥組加入200 μL含藥培養(yǎng)基（分別含1.8、18、180 μg/mL青蒿琥酯），對(duì)照組加入等量培養(yǎng)基，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)3、6、10、20、24、48 h后測(cè)定值。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)細(xì)胞周期的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后，對(duì)照組加入完全培養(yǎng)基，U87細(xì)胞給藥組加入22.69 μg/mL青蒿琥酯，U251細(xì)胞給藥組加入180 μg/mL青蒿琥酯。處理細(xì)胞24 h后，棄去培養(yǎng)基，用胰酶消化細(xì)胞，離心棄去上清。PBS清洗細(xì)胞2遍，加入70%乙醇固定細(xì)胞，4 ℃過(guò)夜；離心并棄去上清，加入1 mL PBS重懸細(xì)胞，1000 r/min離心5 min，PBS清洗細(xì)胞，加入細(xì)胞周期染色工作液，37 ℃避光孵育30 min后，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)，結(jié)果用Flow jo v9軟件進(jìn)行分析。

2.4 qRT-PCR檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)細(xì)胞自噬相關(guān)基因表達(dá)的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后，對(duì)照組加入完全培養(yǎng)基，U87細(xì)胞和U251細(xì)胞給藥組加入180 μg/mL青蒿琥酯。處理細(xì)胞24 h后，用Trizol試劑提取U87和U251細(xì)胞的總RNA，對(duì)其定量，并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將適量RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行qRT-PCR分析，引物序列見(jiàn)表1。

2.5 Western blotting檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)細(xì)胞自噬及通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后，對(duì)照組加入完全培養(yǎng)基，U87細(xì)胞給藥組分別加入11.35、22.69、45.38 μg/mL青蒿琥酯，陽(yáng)性對(duì)照組加入100 μg/mL替莫唑胺；U251細(xì)胞給藥組分別加入90、180、360 μg/mL青蒿琥酯，陽(yáng)性對(duì)照組加入250 μg/mL替莫唑胺。處理細(xì)胞24 h后，置于冰上裂解提取蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，蛋白變性后，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉后分別加入Beclin1（1∶2000）、LC3B（1∶2000）、p62（1∶2000）、PDGFRA（1∶2000）、BRAF（1∶2000）和GAPDH（1∶5000）抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；洗滌后加入二抗（1∶5000），室溫孵育30 min，洗滌后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光和成像，檢測(cè)目標(biāo)條帶，采用Image J軟件對(duì)蛋白進(jìn)行定量分析。

表1 引物序列

2.6 甲基化測(cè)序與分析

采用DNeasy組織試劑盒從細(xì)胞中分離DNA。采用Nanodrop超微量分光光度計(jì)和Quibt Fluorometer熒光定量?jī)x測(cè)定DNA的純度和濃度。使用EZ DNA甲基化試劑盒將每個(gè)樣品的500 ng DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換，委托北京致美伊諾生物科技有限公司測(cè)序。原始數(shù)據(jù)在R v3.5.2軟件中使用ChAMP v2.16.0包進(jìn)行分析，用β值表示DNA甲基化水平和各CpG位點(diǎn)的甲基化比例。使BMIQ對(duì)β值矩陣進(jìn)行歸一化，調(diào)整I型和II型探針偏置；使用SVA v3.34.0分析芯片間和芯片上樣本位置不同產(chǎn)生的批間差，使用Combat算法對(duì)批間差進(jìn)行校正。非配對(duì)樣本使用ChAMP v2.16.0包的champ. DMP函數(shù)進(jìn)行差異甲基化位點(diǎn)DMP分析，配對(duì)樣本使用等方差雙尾配對(duì)檢驗(yàn)。對(duì)于計(jì)算結(jié)果的值，使用Benjamini & Hochberg法進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)，減少假陽(yáng)性。差異分析結(jié)果（adj.＜0.05、|?β|≥0.2或adj.＜0.01、|?β|≥0.06）以火山圖和熱圖展示。差異基因功能富集分析通過(guò)京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行。

2.7 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與核心靶點(diǎn)的篩選

選取啟動(dòng)子區(qū)域甲基化數(shù)據(jù)，根據(jù)＜0.05篩選U87（青蒿琥酯敏感型）和U251（青蒿琥酯耐藥型）膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的差異甲基化基因；根據(jù)adj.＜0.01、|?β|≥0.81篩選U87和U251膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞給予青蒿琥酯前后的差異甲基化基因。運(yùn)用STRING v10.0軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用Cyto Hubba v0.1計(jì)算PPI網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣髦蛋ǘ戎怠⒆畲蠹瘓F(tuán)中心、介數(shù)中心性和接近中心性，篩選4者均大于相應(yīng)中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)為核心靶點(diǎn)。

2.8 核心靶點(diǎn)的功能富集分析

利用DAVID v6.8對(duì)關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）生物過(guò)程和KEGG信號(hào)通路富集分析（＜0.05），研究關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)參與的生物過(guò)程并篩選青蒿琥酯干預(yù)腦膠質(zhì)瘤相關(guān)的信號(hào)通路。

2.9 分子對(duì)接

從PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取PDGFRA（ID：5K5X）和BRAF（ID：7MOX）的pdb格式文件，使用AutoDock v4.2.6對(duì)2個(gè)蛋白進(jìn)行去水、加氫處理。從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)下載青蒿琥酯的mol2格式文件，利用AutoDock v4.2.6和AutoDock Vina v1.2.0進(jìn)行對(duì)接，計(jì)算結(jié)合能。使用Pymol v2.5進(jìn)行結(jié)果可視化。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 青蒿琥酯對(duì)U87細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于U251細(xì)胞

如圖1所示，給藥24 h后，青蒿琥酯對(duì)U87細(xì)胞的IC50為22.69 μg/mL，而對(duì)U251細(xì)胞的IC50則大于180 μg/mL。與對(duì)照組比較，18 μg/mL的青蒿琥酯在給藥10～24 h后，對(duì)U87細(xì)胞增殖有顯著抑制作用（＜0.01、0.001）；而180 μg/mL的青蒿琥酯在給藥10 h后，可抑制U251細(xì)胞增殖（＜0.001）。細(xì)胞活性和增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，青蒿琥酯可抑制2種GBM細(xì)胞，與U251細(xì)胞相比，青蒿琥酯對(duì)U87細(xì)胞更為敏感。

3.2 青蒿琥酯可阻滯U87和U251細(xì)胞周期

如圖2所示，與對(duì)照組比較，22.69 μg/mL青蒿琥酯處理后，U87細(xì)胞的G2/M期的細(xì)胞數(shù)量增加6.2%；180 μg/mL青蒿琥酯處理后，U251細(xì)胞的S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)量均增加，且S期細(xì)胞數(shù)量增加具有顯著性差異（＜0.05）。表明青蒿琥酯可抑制U87細(xì)胞的G2/M期，以及U251細(xì)胞的S期和G2/M期。相比于U251細(xì)胞，較低劑量的青蒿琥酯更能將U87細(xì)胞阻滯在G2/M期，通過(guò)阻止細(xì)胞快速增長(zhǎng)來(lái)抑制GBM細(xì)胞的活性。

ART-青蒿琥酯 與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，下圖同

圖2 青蒿琥酯對(duì)U87和U251細(xì)胞周期的影響(, n = 4)

3.3 青蒿琥酯可促進(jìn)U87和U251細(xì)胞的自噬

采用qRT-PCR檢測(cè)經(jīng)180 μg/mL青蒿琥酯處理后U87和U251細(xì)胞的自噬標(biāo)志分子（、、）mRNA表達(dá)水平，如圖3-A所示，180 μg/mL青蒿琥酯處理后，U87細(xì)胞中、、mRNA表達(dá)水平均顯著升高（＜0.001），而U251細(xì)胞中僅mRNA表達(dá)增加（＜0.05）。Western blotting結(jié)果（圖3-B）顯示，11.35 μg/mL的青蒿琥酯顯著升高U87細(xì)胞中LC3B蛋白表達(dá)水平（＜0.05），22.69 μg/mL的青蒿琥酯顯著升高U87細(xì)胞中Beclin1蛋白表達(dá)水平（＜0.05），45.38 μg/mL的青蒿琥酯顯著升高U87細(xì)胞中p62蛋白表達(dá)水平（＜0.05），180、360 μg/mL的青蒿琥酯可使U251細(xì)胞中Beclin1、p62、LC3B蛋白表達(dá)趨勢(shì)升高，但無(wú)顯著性差異。

TMZ-替莫唑胺，圖7同

3.4 甲基化和去甲基化基因分布

前期的藥效和細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，青蒿琥酯對(duì)U87細(xì)胞較為敏感，而對(duì)U251細(xì)胞耐藥，為了探究青蒿琥酯在治療GBM中發(fā)揮藥效的機(jī)制以及產(chǎn)生耐藥的原因，本研究將給藥前后的U87與U251細(xì)胞進(jìn)行甲基化測(cè)序與分析，選取啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行甲基化數(shù)據(jù)分析。篩選U87和U251 2種細(xì)胞的差異基因數(shù)（U87U251），得到“U87與U251細(xì)胞差異基因集”；篩選2種細(xì)胞給予青蒿琥酯前后的差異基因數(shù)（U87U87-ART、U251U251-ART），得到“青蒿琥酯干預(yù)U87細(xì)胞效應(yīng)基因集”以及“青蒿琥酯干預(yù)U251細(xì)胞效應(yīng)基因集”。如圖4所示，U87U251中共有226 058個(gè)差異基因，其中包括61 891個(gè)甲基化基因和164 167個(gè)去甲基化基因；U87U87-ART中共有3345個(gè)差異基因，其中包括3294個(gè)甲基化基因和51個(gè)去甲基化基因；U251U251-ART中共有420個(gè)差異基因，其中包括243個(gè)甲基化基因和177個(gè)去甲基化基因。

通過(guò)對(duì)各組的差異基因進(jìn)行功能富集，選取富集度最高的前10個(gè)通路進(jìn)行功能模塊富集，主要富集到6大功能模塊。包括代謝、遺傳信息、環(huán)境信息、細(xì)胞過(guò)程、有機(jī)系統(tǒng)以及人類(lèi)疾病。其中U87U251主要富集到了代謝（包括藥物代謝-細(xì)胞色素P450信號(hào)通路）和細(xì)胞功能、人類(lèi)疾病[包括癌癥相關(guān)、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）相關(guān)信號(hào)通路]功能模塊；U87U87-ART主要富集到了代謝、環(huán)境信息（細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用信號(hào)通路）、細(xì)胞功能（自噬、黏著連接信號(hào)通路）、有機(jī)系統(tǒng)等功能模塊；U251U251-ART主要富集到了代謝、遺傳信息（基因復(fù)制、同源重組信號(hào)通路）、細(xì)胞功能（細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路）等功能模塊。根據(jù)以上信息，初步表明青蒿琥酯具有干預(yù)GBM的潛能。

3.5 青蒿琥酯干預(yù)GBM的核心靶點(diǎn)篩選

3.5.1 差異基因篩選 選取啟動(dòng)子區(qū)域甲基化數(shù)據(jù)，根據(jù)adj.和?β，篩選青蒿琥酯干預(yù)GBM效應(yīng)基因以及青蒿琥酯敏感型和耐藥型細(xì)胞系差異基因。U87U251中共有1881個(gè)差異基因，其中包含893個(gè)甲基化基因和988個(gè)去甲基化基因；U87U87-ART中共有342個(gè)差異基因，其中包含181個(gè)甲基化基因和161個(gè)去甲基化基因；U251U251-ART中共有56個(gè)差異基因，其中包含26個(gè)甲基化基因和30個(gè)去甲基化基因。

火山圖中，甲基化基因用紅色表示，去甲基化基因用藍(lán)色表示，未甲基化基因用灰色表示

差異基因篩選數(shù)據(jù)可見(jiàn)，U87和U251 2類(lèi)細(xì)胞差異基因數(shù)以及青蒿琥酯給藥前后U87細(xì)胞差異基因數(shù)較多，而青蒿琥酯給藥前后U251細(xì)胞差異基因數(shù)較少，這與青蒿琥酯對(duì)U87細(xì)胞較敏感，而對(duì)U251細(xì)胞耐藥的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相呼應(yīng)。

3.5.2 核心靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 基于STRING v10.0軟件，挖掘“U87與U251細(xì)胞差異基因集”、“青蒿琥酯干預(yù)U87細(xì)胞效應(yīng)基因集”以及“青蒿琥酯干預(yù)U251細(xì)胞效應(yīng)基因集”各自的相互作用關(guān)系。如圖5-A所示，U87U251中包含1016個(gè)節(jié)點(diǎn)和2353對(duì)相互作用；U87U87-ART中包含288個(gè)節(jié)點(diǎn)和160對(duì)相互作用；U251U251-ART中包含53個(gè)節(jié)點(diǎn)和4對(duì)相互作用。

運(yùn)用Cyto Hubba v0.1分別計(jì)算PPI網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣髦担ǘ戎?、最大集團(tuán)中心、介數(shù)中心性和接近中心性），篩選4者均大于相應(yīng)中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)為關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)，共得到290個(gè)U87U251核心靶點(diǎn)（最大集團(tuán)中心為4、度值為4、接近中心性為203.6、介數(shù)中心性為1 220.3）和53個(gè)U87U87-ART核心靶點(diǎn)（最大集團(tuán)中心為2、度值為2、接近中心性為13.6、介數(shù)中心性為0）。

圖5 U87 vs U251、U87 vs U87-ART關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)(A) 及主要富集通路(B)

3.6 核心靶點(diǎn)的富集分析

基于DAVID v6.8數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)青蒿琥酯干預(yù)GBM效應(yīng)基因以及青蒿琥酯敏感型和耐藥型細(xì)胞系差異基因的關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析。生物功能富集結(jié)果顯示，U87U251核心節(jié)點(diǎn)共富集到23條信號(hào)通路（＜0.05），包含神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)通路以及與調(diào)節(jié)細(xì)胞功能和免疫-炎癥反應(yīng)相關(guān)的信號(hào)通路；U87U87-ART核心節(jié)點(diǎn)共富集到2條信號(hào)通路（＜0.05），分別是Janus激酶（Janus kinase，JAK）-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducers and activators of transcription，STAT）信號(hào)通路和自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性信號(hào)通路（圖5-B）。其中，與細(xì)胞增殖分化密切相關(guān)的JAK-STAT信號(hào)通路為共同富集通路，對(duì)富集到該通路的基因進(jìn)行分析。

分析結(jié)果顯示，該條通路上的基因與GBM密切相關(guān)，該基因發(fā)生突變后會(huì)促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展。進(jìn)一步文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)PDGFRA和BRAF普遍在GBM患者發(fā)生突變。甲基化數(shù)據(jù)結(jié)果也顯示，和基因在U87U87-ART中被甲基化沉默（adj.＜0.05），且均與GBM的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

3.7 青蒿琥酯與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果分析

采用AuotDock和AutoDock Vina 2種對(duì)接方法考察青蒿琥酯與關(guān)鍵靶點(diǎn)BRAF和PDGFRA的結(jié)合能力。如圖6所示，青蒿琥酯與BRAF蛋白的結(jié)合能分別為?22.06、?31.4 kJ/moL，青蒿琥酯與PDGFRA蛋白的結(jié)合能分別為?24.58、?34.75 kJ/moL，由此看出，青蒿琥酯與BRAF和PDGFRA這2種蛋白的結(jié)合能力較強(qiáng)。

3.8 青蒿琥酯對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)的蛋白表達(dá)影響

為了驗(yàn)證青蒿琥酯對(duì)BRAF和PDGFRA 2種蛋白表達(dá)的影響，用11.35、22.69、45.38 μg/mL的青蒿琥酯處理U87細(xì)胞，90、180、360 μg/mL的青蒿琥酯處理U251細(xì)胞，采用Western blotting進(jìn)行檢測(cè)，如圖7所示，11.35、22.69、45.38 μg/mL的青蒿琥酯均可降低U87細(xì)胞中PDGFRA蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01），11.35、45.38 μg/mL的青蒿琥酯可降低BRAF蛋白表達(dá)水平（＜0.01）；90、180、360 μg/mL的青蒿琥酯對(duì)U251細(xì)胞中PDGFRA蛋白表達(dá)無(wú)顯著影響，90 μg/mL的青蒿琥酯可顯著降低BRAF蛋白表達(dá)（＜0.001）。

圖6 青蒿琥酯與BRAF (A) 和PDGFRA (B) 蛋白的分子對(duì)接結(jié)果

圖7 青蒿琥酯對(duì)U87 (A) 和U251 (B) 細(xì)胞中PDGFRA和BRAF蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

4 討論

腦膠質(zhì)瘤作為一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的惡性腫瘤，具有高度侵襲性，因部分臨床患者存在化療耐藥性，且腫瘤抑制因子和癌基因的多重功能障礙的存在使其成為最難治療的惡性腫瘤之一[10]。目前主要存在預(yù)后差及復(fù)發(fā)率高等問(wèn)題，亟需挖掘新的抗GBM治療藥物。本研究基于2種GBM細(xì)胞U87和U251的藥效實(shí)驗(yàn)和甲基化數(shù)據(jù)分析，旨在探討具有抗腫瘤活性的一類(lèi)青蒿素衍生物青蒿琥酯發(fā)揮抗GBM的藥效，并初步挖掘其作用機(jī)制以及臨床產(chǎn)生耐藥相關(guān)的分子機(jī)制。

細(xì)胞活性和增殖結(jié)果顯示，青蒿琥酯對(duì)U87細(xì)胞的抑制作用比U251細(xì)胞強(qiáng)；中、高劑量的青蒿琥酯從早期開(kāi)始即可抑制U87細(xì)胞的增殖，而僅有高劑量青蒿琥酯才能影響耐藥型細(xì)胞U251的增殖。此外，高劑量青蒿琥酯可阻滯U87和U251腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期分布，低、中、高劑量青蒿琥酯促進(jìn)U87細(xì)胞3種自噬標(biāo)志分子（Beclin1、p62、LC3）的表達(dá)，而僅有中、高劑量才能影響U251細(xì)胞的自噬標(biāo)志分子表達(dá)。以上實(shí)驗(yàn)表明青蒿琥酯對(duì)U87細(xì)胞敏感，而對(duì)U251細(xì)胞耐藥。為進(jìn)一步揭示青蒿琥酯在治療GBM中發(fā)揮藥效的分子機(jī)制和潛在的耐藥機(jī)制，本研究將給藥前后的U87與U251細(xì)胞進(jìn)行甲基化測(cè)序與分析，篩選出的核心靶點(diǎn)顯著富集于癌癥、細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)通路，其中青蒿琥酯干預(yù)GBM的關(guān)鍵靶標(biāo)顯著參與了PDGFRA-大鼠肉瘤基因（rat sarcoma viral oncogene homolog，RAS）-BRAF-絲裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）-細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）通路。甲基化數(shù)據(jù)顯示，青蒿琥酯給藥后，該通路上的PDGFRA和BRAF被甲基化沉默，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)受到抑制，進(jìn)而阻止下游RAS-RAF-MEK-ERK信號(hào)通路的激活。青蒿琥酯與蛋白質(zhì)PDGFRA和BRAF的分子對(duì)接結(jié)果顯示青蒿琥酯與2種蛋白質(zhì)有較好的結(jié)合能力。Western blotting結(jié)果證實(shí)青蒿琥酯可以抑制PDGFRA和BRAF 2種關(guān)鍵蛋白在U87和U251細(xì)胞中的表達(dá)。

研究表明，GBM的惡性進(jìn)展可能與PDGFRA的過(guò)表達(dá)有關(guān)[11]。PDGFRA作為細(xì)胞表面受體，在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育和細(xì)胞增殖中起著重要的作用，可介導(dǎo)RAS的激活[12]。此外，G34R/V型膠質(zhì)瘤（G34R/V HGGs）中PDGFRA的高激活突變，可觀察到明顯的ERK磷酸化，表明下游有絲分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）/ERK途徑被激活，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生[13]；在GBM細(xì)胞中，具有GTP酶活性的RAS蛋白被上游PDGFRA激活后，通過(guò)與BRAF的端結(jié)構(gòu)域結(jié)合使BRAF活化，參與惡性腫瘤的形成和發(fā)展。此外，其突變也與許多癌癥類(lèi)型的預(yù)后不良有關(guān)[14]。突變使BRAF蛋白持續(xù)激活，磷酸化MEK，從而誘導(dǎo)MAP激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并持續(xù)作用于下游的唯一底物ERK進(jìn)入細(xì)胞核，通過(guò)影響DNA和蛋白質(zhì)合成以及細(xì)胞周期進(jìn)入來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化[15]，其中ERK2還可以通過(guò)調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體來(lái)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[16]。相關(guān)研究表明，抑制MAPK/ERK通路可以逆轉(zhuǎn)阿霉素對(duì)乳腺癌的耐藥性[17]。因此，推測(cè)青蒿琥酯緩解GBM可能通過(guò)調(diào)節(jié)PDGFRA的表達(dá)，從而抑制下游RAS-RAF-MEK-ERK信號(hào)通路；或通過(guò)直接抑制BRAF及其下游MEK-ERK途徑，即青蒿琥酯可通過(guò)上述2條途徑切斷MEK-ERK的信號(hào)傳導(dǎo)，從而阻止GBM細(xì)胞的增殖擴(kuò)散發(fā)揮治療作用（圖8）。

目前臨床前已有多種有效藥物靶向GBM中的PDGFRA，包括酪氨酸激酶抑制劑達(dá)沙替尼，然而，達(dá)沙替尼的單藥治療未能改善成人高級(jí)別膠質(zhì)瘤（high- grade gliomas，HGG）的結(jié)局[18]；此外，BRAF抑制劑維莫非尼以及達(dá)拉非尼也具有抗GBM活性[19-21]。臨床上單純抑制PDGFRA或BRAF對(duì)GBM的療效有限，而青蒿琥酯不僅可抑制PDGFRA，還可進(jìn)一步作用于BRAF，具有治療GBM的潛能。

圖8 青蒿琥酯可能通過(guò)調(diào)節(jié)PDGFRA-RAS-BRAF-MEK-ERK信號(hào)通路來(lái)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞

綜上所述，本研究結(jié)合藥物對(duì)2類(lèi)GBM細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)和甲基化數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯可能通過(guò)抑制PDGFRA-RAS-BRAF-MEK-ERK途徑，發(fā)揮抑制GBM細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散的治療作用。研究結(jié)果不僅為GBM提供潛在新的治療方案，也為臨床中GBM患者對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥的機(jī)制探索提供方法學(xué)參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Molecular mechanism of artesunate on intervening glioblastoma based on DNA methylation sequencing technology

YAN Xiang-ying1, MAO Xia1, LI Tao1, Koji Mizuno2, Katsuki Okuyama2, LIN Na1, ZHANG Yan-qiong1, Takashi Sato2

1. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China 2. Department of Biochemistry, Tokyo University of Pharmacy and Life Sciences, Tokyo 192-0392, Japan

To explore the efficacy and mechanism of artesunate in intervening glioblastoma.Cell Titer-Blue was used to detect the effect of artesunate on viability and proliferation of U87 and U251 human glioblastoma cells; Flow cytometry was used to detect the regulation effect of artesunate on two cell cycles; qRT-PCR and Western blotting were used to detect the effect of artesunate on autophagy level of two kinds of cells. Further, target genes of artesunate intervention in glioblastoma were studied from the epigenetic level by using the analysis strategy of DNA methylation combined with network pharmacology, and a protein-protein interaction network was established. By calculating the network topological eigenvalues of each node in network, core targets of artesunate intervention in glioblastoma were screened out and biological function enrichment analysis was carried out. Finally, AutoDock v4.2.6 and AutoDock Vina v1.2.0 software were used to carry out molecular docking virtual calculation, to investigate the binding ability of artesunate and its candidate key targets, and verify the influence of artesunate on the expressions of key targets in two types of glioma cells by Western blotting.Artesunate significantly inhibited the activity and proliferation of U87 cells (< 0.05, 0.01, 0.001), but had no significant effect on U251 cells. High-dose artesunate could affect the distribution of two cell cycles. High-dose artesunate significantly increased the mRNA expression levels of three autophagy markers [ATG6 autophagy related 6 homolog (), ubiquitin-binding protein (), microtubule-associated protein 1 light chain 3 ()] in U87 cells (< 0.001), while only high-dose artesunate increased the mRNA expression level ofin U251 cells (< 0.05). Low-, medium- and high-dose of artesunate could significantly improve the expression levels of Beclin1, p62 and LC3B proteins in U87 cells (< 0.05, 0.01), only medium- and high-dose of artesunate could affect Beclin1, p62 and LC3B protein expressions in U251 cells. Furthermore, DNA methylation sequencing and network pharmacologic integration analysis were performed on U87 and U251 cells before and after drug administration, on the basis of obtaining the differential gene sets of artesunate-sensitive and drug-resistant glioma cells, and effector gene sets of two types of cells after artesunate intervention, it was found that key network targets of two types of glioma cells were involved in platelet derived growth factor receptor α (PDGFRA)-rat sarcoma viral oncogene homolog (RAS)-B-Raf proto-oncogene (BRAF)-mitogen-activated protein kinase kinase (MEK)-extracellular signal regulated kinase (ERK) pathway, which were closely related to the malignant progression of glioblastoma, and artesunate had strong affinity with its direct targets (PDGFRA and BRAF). Western blotting analysis confirmed that artesunate could inhibit the expressions of PDGFRA and BRAF proteins in U87 and U251 cells (< 0.05, 0.01, 0.001).Artesunate may exert its medicinal effect on inhibiting the growth and proliferation of glioblastoma cells by targeting PDGFRA-RAS-BRAF-MEK-ERK signaling pathway, which provides anexperimental basis for artesunate in treatment of glioblastoma, and also provides new ideas and methods for solving the drug resistance problem of clinical anti-tumor drugs.

artesunate; glioblastoma; DNA methylation analysis; drug resistance; PDGFRA-RAS-BRAF-MEK-ERK signaling pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2023)06 - 1814 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.06.013

2022-09-29

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（8210143224）；中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院優(yōu)秀青年科技人才（創(chuàng)新類(lèi)）（ZZ15-YQ-029）

閆向英，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幚砼c毒理學(xué)。E-mail: yxy1254253857@163.com

張彥瓊，研究員，主要從事中醫(yī)藥生物信息學(xué)研究。E-mail: yqzhang@icmm.ac.cn Takashi Sato，日本東京藥科大學(xué)教授，主要從事藥理學(xué)研究。E-mail: satotak@toyaku.ac.jp

#共同第一作者：毛 霞，助理研究員，研究方向?yàn)榭寡酌庖咧兴幩幚韺W(xué)。E-mail:xmao@icmm.ac.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]