基于NLRP3炎癥小體研究黃芩苷聯(lián)合梔子苷防治缺血性腦卒中及并發(fā)心肌損傷的作用機(jī)制

趙 麓，張行行，孫欠欠，趙安東，史永恒, 2, 3，王 川, 2，王國全, 2, 3，王 斌, 2, 3

基于NLRP3炎癥小體研究黃芩苷聯(lián)合梔子苷防治缺血性腦卒中及并發(fā)心肌損傷的作用機(jī)制

趙 麓1，張行行1，孫欠欠1，趙安東1，史永恒1, 2, 3，王 川1, 2，王國全1, 2, 3，王 斌1, 2, 3*

1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046 2. 中醫(yī)藥腦健康產(chǎn)業(yè)陜西省高校工程研究中心，陜西 咸陽 712046 3. 陜西省中醫(yī)藥管理局 中藥藥效機(jī)制與物質(zhì)基礎(chǔ)重點研究室，陜西 咸陽 712046

以NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎癥小體為切入點，研究黃芩苷-梔子苷（7∶3）抗腦缺血損傷及并發(fā)心肌損傷的作用機(jī)制。將雄性SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、尼莫地平（10 mg/kg）組和黃芩苷-梔子苷低、中、高劑量（30、45、60 mg/kg）組，每組10只。ig藥物7 d后，采用線栓法構(gòu)建大鼠局灶性腦缺血模型，采用Zea-Longa評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能評分；干濕質(zhì)量法檢測腦組織水腫情況；激光多普勒檢測腦血流量；蘇木素-伊紅（HE）染色觀察腦和心肌組織病理變化；TUNEL染色觀察心肌組織凋亡情況；采用ELISA法測定心肌組織中心肌酶譜活性。利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測黃芩苷-梔子苷抗腦缺血損傷及并發(fā)心肌損傷的作用機(jī)制；采用ELISA法檢測血清中白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、IL-18、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平；采用Western blotting法檢測腦組織、心肌組織中NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)。與對照組比較，模型組大鼠腦、心組織損傷嚴(yán)重，炎性因子水平升高（＜0.01），心肌酶譜活性顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組腦、心組織病理損傷不同程度減輕，腦含水量、神經(jīng)功能評分、心肌細(xì)胞凋亡率、血清中心肌酶譜顯著降低（＜0.05、0.01），腦血流量顯著增加（＜0.05、0.01）。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示，NOD樣信號通路在黃芩苷-梔子苷防治腦缺血及其并發(fā)心損傷中發(fā)揮重要作用，選取NOD樣受體家族NLRP3炎性小體繼續(xù)深入研究，ELISA和qRT-PCR結(jié)果表明，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平及腦組織皮層、心肌組織中NLRP3炎癥小體蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01），而各給藥組血清中炎癥因子水平和腦組織皮層、心肌組織中NLRP3炎癥小體蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01）。黃芩苷-梔子苷能抑制炎性介質(zhì)的表達(dá)，通過下調(diào)NLRP3炎癥小體發(fā)揮抗腦缺血損傷及卒中后心肌損傷作用。

黃芩苷-梔子苷；缺血性腦卒中；卒中后心損傷；腦-心軸；NLRP3；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

大腦是人體的控制中心，能夠調(diào)節(jié)復(fù)雜的生命活動，因此大腦是人體耗氧量最大和消耗能量最多的器官，當(dāng)腦缺血時，大腦得不到充分的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而引起局部組織細(xì)胞凋亡和壞死，引發(fā)嚴(yán)重的后果[1]。缺血性腦卒中（cerebral ischemic stroke，CIS）是由于腦血管閉塞所致，約占所有腦卒中病例的72%[2]，大多數(shù)CIS后死亡歸因于神經(jīng)損傷，而心血管并發(fā)癥是CIS后死亡的第2大原因[3]。CIS后并發(fā)心臟損傷早在1947年就已被報道[4]，大量臨床數(shù)據(jù)也顯示，腦卒中后早期患者出現(xiàn)心肌受損、心功能不全及心率不齊等癥狀，常伴有血清心肌酶升高[3,5-6]，即使沒有原發(fā)性心臟病的患者也在CIS后檢測到心肌損傷[7]。因此，在研究CIS治療時應(yīng)同時考慮心肌組織的保護(hù)。

NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎癥小體是CIS后炎癥的重要組成部分，主要在M1型極化的巨噬細(xì)胞中被激活[8]，從而介導(dǎo)全身炎癥。另有研究發(fā)現(xiàn)，在急性心肌梗死中NLRP3介導(dǎo)了不良的炎性反應(yīng)，加重心肌梗死及心功能障礙[9]。故本研究以NLRP3炎癥小體為切入點，探討CIS及并發(fā)心肌損傷的作用機(jī)制及黃芩苷、梔子苷的干預(yù)作用。課題組前期基于中醫(yī)基礎(chǔ)“清熱解毒”治則以及治療腦血管疾病的現(xiàn)代化研究發(fā)現(xiàn)，黃芩和梔子中主要抗炎活性成分黃芩苷和梔子苷最佳比例7∶3聯(lián)合應(yīng)用能夠相互促進(jìn)提高入腦[10]、改善腦缺血后炎性損傷和血腦屏障透過率等效用[11]；黃芩苷-梔子苷（20～60 mg/kg）能降低腦缺血后炎性指標(biāo)表達(dá)，改善CIS后腦水腫等[12-13]，并通過降低興奮性氨基酸毒性[1]、調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞極化狀態(tài)[14]等途徑抗腦缺血損傷，因此，本研究在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究黃芩苷-梔子苷對抗腦缺血損傷及其并發(fā)癥的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動物

60只SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量（220±20）g，購自成都達(dá)碩實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（川）2020-030。動物飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理實驗動物房內(nèi)，溫度23～25 ℃，相對濕度45%～55%，自由攝食與飲水，晝夜各半，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實驗過程中對動物的處置符合《實驗動物福利倫理審查指南》（GB/T 35892—2018）《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》和陜西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會規(guī)定和相關(guān)管理條例，動物實驗符合3R原則，本實驗通過動物實驗倫理審查（批準(zhǔn)號SUCMDL20220520002）。

1.2 藥品與試劑

黃芩苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞95%，批號419J022）、IL-18 ELISA試劑盒（批號SEKR-0054）購自北京索萊寶科技有限公司；梔子苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，C14223935）購自德國默克醫(yī)藥生物科技公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6 ELISA試劑盒（批號分別為2401718426、11516129426、1331735426）、NRLP3抗體（批號BA-3677-2）購自武漢博士德生物工程有限公司；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒（批號分別為20180901-1、20180901、20180801-2、20181201）購自濰坊澤成生物技術(shù)有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（批號011821210312）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；二抗（批號SA00001-2）購自武漢三鷹生物科技有限公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cystein-asparate protease-1，Caspase-1）抗體（批號GB11383）、二抗（批號GB23303）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；凋亡斑點樣蛋白（apoptotic spot-like protein，ASC）抗體（批號BS6741R）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；頭端直徑（0.38±0.40）mm的線栓購自瑞沃德。

1.3 儀器

NW10LVF型超純水系統(tǒng)（力康生物醫(yī)療科技控股集團(tuán)）；L420型離心機(jī)（北京六一生物科技有限公司）；DP73型顯微鏡拍照系統(tǒng)（日本Olympus公司）；800TS型酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）；DH36001B型電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津泰斯特儀器有限公司）；H-2050R型冷凍超速離心機(jī)（湖南湘儀集團(tuán)）；Exicycler 96熒光定量PCR儀（韓國Bioneer公司）；SH01D型高速離心機(jī)（上海知信實驗儀器技術(shù)有限公司）；電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）；PIM3型激光多普勒血流灌注成像儀（瑞典Perimed公司）。

2 方法

2.1 動物造模、分組與給藥

將60只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平（10 mg/kg）組、黃芩苷-梔子苷低、中、高劑量（30、45、60 mg/kg）組，每組10只。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，各給藥組ig相應(yīng)藥物，對照組和模型組ig等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)7 d。末次給藥結(jié)束后，大鼠禁食12 h，ip 1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，模型組和各給藥組采用改良Longa線栓法[15]制備右側(cè)大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型：大鼠仰臥位固定于鼠板，頸部消毒備皮，正中切口1.5 cm，鈍性分離右側(cè)胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌之間的肌間隙，分離頸動脈，夾閉頸總動脈，由頸外動脈插入線栓，至線栓18 mm標(biāo)記進(jìn)入頸內(nèi)動脈與頸總動脈分叉處，術(shù)中術(shù)后保溫。對照組大鼠除不插線栓外，其他與模型組大鼠操作一致，造模24 h后取材[16]，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定。

2.2 神經(jīng)功能評分

所有大鼠均在缺血2、24 h后參考Zea-Longa 5分制評分標(biāo)準(zhǔn)[15]進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評分，觀察并記錄神經(jīng)功能缺損癥狀。

2.3 激光多普勒檢測腦血流量

大鼠麻醉后，呈俯臥位固定于鼠板，腦部備皮，沿腦正中線做一約2 cm切口，棉簽蘸取生理鹽水擦拭去除皮下筋膜，使顱骨充分暴露，手持微型顱骨打磨機(jī)打薄顱骨，置于激光多普勒儀探測器下穩(wěn)定5 min，設(shè)置激光多普勒血流成像灌注儀檢測距離13 cm，參數(shù)面積3 cm×3 cm，平行檢測3次大鼠腦部血流量變化，結(jié)果取平均值。

2.4 干濕質(zhì)量法測定腦組織含水量

大鼠腹主動脈取血處死后，斷頸法取出全腦，濾紙吸干表面水分，冰上預(yù)冷30 s，手術(shù)刀片切去嗅球及額極前部約4 mm的腦組織，并向后取約2 mm厚的腦組織，中線縱向切開，取缺血側(cè)腦組織，稱定質(zhì)量得缺血側(cè)腦組織濕質(zhì)量，用鋁箔紙包好腦組織放入95 ℃恒溫烤箱內(nèi)烘干24 h，取出，待降至室溫測得干質(zhì)量，計算腦含水量。

腦含水量＝(濕質(zhì)量－干質(zhì)量)/濕質(zhì)量

2.5 腦、心肌組織切片蘇木素-伊紅（HE）染色

腦、心肌組織分別置于4%多聚甲醛中固定，梯度乙醇脫水，二甲苯脫醇、浸蠟包埋后切片（厚度5 μm），二甲苯-乙醇脫蠟、蘇木素染色10 min后，于1%鹽酸-乙醇中30 s；純水浸泡15 min后0.5%伊紅染色3 min，沖洗后梯度乙醇脫水，二甲苯脫醇，中性樹膠固封，于顯微鏡下觀察。

2.6 心肌組織TUNEL檢測

心肌組織固定后，脫水、包埋、切片，按試劑盒說明書進(jìn)行TUNEL染色，計算心肌細(xì)胞凋亡率。

2.7 心肌組織中心肌酶譜測定

取心肌組織100 mg，加入10倍量預(yù)冷生理鹽水，用冷凍型高通量組織研磨器進(jìn)行組織勻漿，離心后取少許上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書檢測組織勻漿中ALT、AST、CK和LDH活性。

2.8 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測黃芩苷-梔子苷心腦共治作用機(jī)制

利用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫對黃芩苷、梔子苷進(jìn)行靶點預(yù)測，將得到的靶點合并后刪除重復(fù)值。以“cerebral ischemia”和“myocardial damage”為搜索詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫收集得分較高相關(guān)疾病靶點，將三者靶點導(dǎo)入Venny數(shù)據(jù)庫，取其交集，對其進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，篩選排名較高的通路進(jìn)行下一步研究[17]。

2.9 ELISA測定血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18水平

血液樣本常溫靜置30 min，3000 r/min離心15 min，分裝血清，?80 ℃凍存，按照試劑盒說明書測定血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18水平。

2.10 Western blotting測定缺血側(cè)皮層、心肌組織中NLRP3通路相關(guān)蛋白表達(dá)

分別取缺血側(cè)皮層、心肌組織，加入RIPA裂解液提取蛋白并測定蛋白濃度，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉后加入抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜；洗滌后加入二抗（1∶5000）孵育，洗滌后加入ECL超敏發(fā)光液顯影，采用成像儀攝像、測量，利用Image Pro Plus 5.0軟件分析計算條帶灰度值。

2.11 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 黃芩苷-梔子苷干預(yù)腦缺血狀態(tài)下大鼠行為學(xué)的變化

如圖1所示，與對照組比較，模型組大鼠在手術(shù)2 h后行為學(xué)評分顯著升高（＜0.01），表明手術(shù)后模型構(gòu)建成功；術(shù)后24 h，模型組大鼠行為學(xué)與術(shù)后2 h無差異，腦梗死區(qū)域穩(wěn)定；與模型組比較，尼莫地平組和黃芩苷-梔子苷中、高劑量組大鼠神經(jīng)功能評分顯著降低（＜0.05、0.01），提示黃芩苷-梔子苷中、高劑量能降低MCAO大鼠神經(jīng)功能評分，改善神經(jīng)功能。

與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01，下圖同

3.2 黃芩苷-梔子苷干預(yù)腦缺血狀態(tài)下大鼠腦組織相關(guān)指標(biāo)的變化

如圖2所示，與對照組比較，模型組大鼠腦組織皮層結(jié)構(gòu)松散、水腫，胞核皺縮或溶解，呈現(xiàn)空泡狀，結(jié)構(gòu)模糊不清，損傷嚴(yán)重，腦含水量顯著上升（＜0.01），腦血流量顯著下降（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠腦細(xì)胞損傷、水腫、胞核萎縮等病理損傷有不同程度減輕，尼莫地平組和黃芩苷-梔子苷中、高劑量組大鼠腦組織含水量均顯著降低（＜0.01），腦血流量顯著上升（＜0.01），黃芩苷-梔子苷低劑量組大鼠腦組織含水量顯著降低（＜0.01），提示黃芩苷-梔子苷能夠增加缺血半暗帶血流供應(yīng)，降低腦含水量，改善腦水腫，減輕腦組織病理損傷。

A-各組腦組織HE染色(×200) B-各組大鼠腦血流量熱圖 C-各組大鼠腦組織含水率(n = 4) D-各組大鼠腦血流量(n = 10)

3.3 黃芩苷-梔子苷干預(yù)腦缺血狀態(tài)下大鼠心功能相關(guān)指標(biāo)的變化

如圖3所示，與對照組比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂、層次不清，胞體萎縮，炎性細(xì)胞浸潤，橫紋斷裂，走向不規(guī)整，損傷嚴(yán)重；心肌組織中ALT、AST、CK、LDH活性均顯著上升（＜0.01），心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高（＜0.01）。與模型組比較，各給藥組心肌組織病理損傷減輕，心肌組織中ALT、AST、CK活性均顯著下降（＜0.01），心肌細(xì)胞凋亡率顯著降低（＜0.05、0.01），尼莫地平組和黃芩苷-梔子苷中、高劑量組心肌組織中LDH活性顯著降低（＜0.01）。提示腦缺血可誘發(fā)心肌組織結(jié)構(gòu)損傷、心肌細(xì)胞凋亡率上升，黃芩苷-梔子苷能夠減緩由腦缺血引發(fā)的心肌損傷。

A-各組大鼠心肌組織HE染色(×200) B-各組大鼠心肌組織TUNEL染色(×400) C～F-各組大鼠心肌組織中心肌酶譜表達(dá)(n = 10) G-各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率(n = 4)

3.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測黃芩苷-梔子苷改善腦缺血和心功能的機(jī)制

運用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫對黃芩苷、梔子苷進(jìn)行靶點預(yù)測，黃芩苷得到102個靶點，梔子苷得到108個靶點，合并刪除重復(fù)值，黃芩苷、梔子苷共得到189個預(yù)測靶點。分別以“cerebral ischemia”和“myocardial ischemia”為搜索詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫收集相關(guān)疾病靶點，篩選分?jǐn)?shù)在3分以上的靶點，共得到1176個腦缺血相關(guān)靶點和770個心肌缺血相關(guān)靶點。將黃芩苷-梔子苷、腦缺血、心肌缺血3者靶點導(dǎo)入Venn數(shù)據(jù)庫，共得到45個共同靶點（圖4-A），對其進(jìn)行PPI（圖4-B）與KEGG通路富集分析，篩選得到網(wǎng)絡(luò)度較高的10個靶點（表1）和與疾病相關(guān)的前10條通路（表2），結(jié)果表明，黃芩苷-梔子苷參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、動脈粥樣硬化、免疫、細(xì)胞凋亡等途徑發(fā)揮心腦保護(hù)作用。篩選結(jié)果中，NOD樣受體信號通路排名靠前，且在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、焦亡等生理過程中發(fā)揮重要作用，而NLRP3炎性小體是目前NOD樣受體家族研究最多的一種受體，已有多項研究證明NLRP3介導(dǎo)的炎性小體的激活參與腦缺血的病理過程[18]。因此，本研究選取NLRP3炎性小體繼續(xù)深入探討黃芩苷-梔子苷抗CIS及并發(fā)心肌損傷的作用機(jī)制。

圖4 黃芩苷-梔子苷、CIS、心肌損傷Venn交集(A) 與PPI網(wǎng)絡(luò)(B)

表1 黃芩苷-梔子苷防治心腦損傷關(guān)鍵靶點

表2 黃芩苷-梔子苷防治心腦損傷靶點富集關(guān)鍵通路

3.5 黃芩苷-梔子苷干預(yù)腦缺血狀態(tài)下大鼠血清中炎性因子水平和大腦皮層、心肌組織中NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白表達(dá)

為進(jìn)一步驗證黃芩苷-梔子苷能否通過NLRP3起到防治CIS及并發(fā)心肌損傷的作用，利用ELISA檢測血清中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平，如圖5所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組IL-1β、IL-6、IL-18水平均顯著降低（＜0.01），尼莫地平組和黃芩苷-梔子苷中、高劑量組TNF-α水平顯著降低（＜0.01）。

采用Western blotting檢測缺血側(cè)腦組織皮層和心肌組織中NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白表達(dá)，如圖6所示，與對照組比較，模型組大鼠大腦皮層和心肌組織中NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠大腦皮層和心肌組織中ASC蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01），尼莫地平組和黃芩苷-梔子苷中、高劑量組大腦皮層和心肌組織中NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01）。表明黃芩苷-梔子苷可降低血清炎性因子表達(dá)，減少NLRP3炎性小體的激活，從而保護(hù)腦、心組織。

圖5 黃芩苷-梔子苷干預(yù)腦缺血狀態(tài)下大鼠血清中炎性因子水平(, n = 6)

圖6 黃芩苷-梔子苷干預(yù)腦缺血狀態(tài)下大鼠缺血測皮層(A) 和心肌組織(B) 中NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白表達(dá) (, n = 3)

4 討論

腦卒中是一個全球性健康問題，近年來，多種問題致使腦卒中患者持續(xù)增加，據(jù)2022年中國心血管病報告數(shù)據(jù)[19]顯示，腦卒中為我國第一大病種，每年新發(fā)病例超過300萬人，因腦卒中死亡的人數(shù)近200萬人，居全球首位，給社會造成了非常沉重的負(fù)擔(dān)，而CIS約占所有腦卒中病例的72%。CIS發(fā)生后，可引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、水電解質(zhì)紊亂等病理反應(yīng)誘導(dǎo)心肌組織損傷、心臟功能失調(diào)[20]，而臨床上心腦血管疾病常合并出現(xiàn)，互相交互，互為因果，沒有固定分界[21]，以往采取的溶栓、取栓治療造價昂貴且需要操作者具有較高技術(shù)水平，而傳統(tǒng)中醫(yī)藥能通過多靶點、多途徑有效防治這類復(fù)雜疾病，如何挖掘傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論并將其應(yīng)用于防治CIS這類慢性疾病及其并發(fā)癥成為醫(yī)藥學(xué)界的迫切需求。

黃芩苷、梔子苷分別是清熱解毒類中藥黃芩、梔子的主要活性成分，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷-梔子苷（7∶3）能有效保護(hù)神經(jīng)功能損傷、減輕腦水腫、增加血流量、下調(diào)炎癥反應(yīng)等，且療效優(yōu)于其他比例配伍，本研究擬探討黃芩苷-梔子苷（7∶3）防治CIS后心肌組織損傷的可行性，為預(yù)防CIS后并發(fā)癥的治療提供新的思路。本研究結(jié)果表明，模型組大鼠造模后腦部組織病理損傷嚴(yán)重，神經(jīng)功能評分、腦含水量顯著升高，腦血流量顯著下降，而在腦缺血狀態(tài)下，大鼠心肌組織出現(xiàn)明顯病理損傷，心肌細(xì)胞凋亡率增加，血清中AST、ALT、CK、LDH活性顯著升高，表明腦缺血狀態(tài)下大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)受損，心功能受到影響。而各給藥組均可不同程度地降低腦含水量、神經(jīng)功能評分、心肌細(xì)胞凋亡率、心肌酶譜指標(biāo)，增加腦血流量，提示黃芩苷-梔子苷在減輕腦組織損傷的同時預(yù)防心肌損傷，提示了黃芩苷-梔子苷是抗CIS及心肌損傷的潛在藥物。

為進(jìn)一步探討黃芩苷-梔子苷抗CIS及心肌損傷的具體作用機(jī)制，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測其可能的分子機(jī)制，結(jié)果表明，黃芩苷-梔子苷抗CIS及心肌損傷的作用機(jī)制主要涉及脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、C型凝集素受體信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、NOD樣受體信號通路，提示黃芩苷-梔子苷通過參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、血管動脈粥樣硬化等途徑發(fā)揮保護(hù)作用。本研究預(yù)以NOD樣受體信號通路為基礎(chǔ)，選擇NLRP3炎性小體為切入點，探討黃芩苷-梔子苷預(yù)防損傷的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。NLRP3炎性小體為廣泛存在于免疫細(xì)胞中的多蛋白復(fù)合體，由NLRP3、ASC和pro Caspase-1組成[22]，NLRP3受體負(fù)責(zé)感受周圍刺激，被激活后立即與ASC結(jié)合并募集pro Caspase-1，形成完整的NLRP3炎性小體，隨后可將pro Caspase-1剪切為有活性的Caspase-1（p20），p20可將pro IL-1β和pro IL-18剪切活化為IL-1β和IL-18，誘導(dǎo)下游IL-6、TNF-α等多種炎癥因子的成熟和分泌，啟動相關(guān)信號通路誘發(fā)炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平顯著升高，缺血側(cè)皮層、心肌組織中NLRP3炎癥小體蛋白表達(dá)顯著升高；與模型組比較，各給藥組可不同程度地降低血清中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平以及缺血測皮層、心肌組織中NLRP3炎癥小體蛋白表達(dá)，表明黃芩苷-梔子苷可通過抑制NLRP3炎性小體，下調(diào)機(jī)體炎癥因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)，從而改善腦缺血狀態(tài)下的大腦和心肌損傷。

本研究以線栓法構(gòu)建MCAO模型，初步探討黃芩苷-梔子苷抗CIS及并發(fā)心肌損傷中的具體體現(xiàn)與應(yīng)用，即腦缺血狀態(tài)下對心肌組織結(jié)構(gòu)、功能的影響和黃芩苷-梔子苷防治的機(jī)制。提示黃芩苷-梔子苷通過抑制NLRP3炎性小體的激活，下調(diào)炎性因子表達(dá)、腦組織含水量，增加缺血區(qū)供血，穩(wěn)定心肌組織結(jié)構(gòu)發(fā)揮保護(hù)作用。本研究有助于揭示中醫(yī)藥多靶點、多途徑的共效應(yīng)性，有助于豐富“腦損及心”等學(xué)說，為治療心腦血管疾病提供新參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of baicalin combined with geniposide for prevention and treatment of cerebral ischemic stroke and complex myocardial injury based on NLRP3 inflammasome

ZHAO Lu1, ZHANG Hang-hang1, SUN Qian-qian1, ZHAO An-dong1, SHI Yong-heng1, 2, 3, WANG Chuan1, 2, WANG Guo-quan1, 2, 3, WANG Bin1, 2, 3

1. Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China 2. Shaanxi University Engineering Research Center of Traditional Chinese Medicine Brain Health Industry, Xianyang 712046, China 3. Key Laboratory of Pharmacodynamic Mechanism and Material Base of Traditional Chinese Medicine, Shaanxi Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine, Xianyang 712046, China

To study the mechanism of baicalin-geniposide (7∶3) in preventing cerebral ischemia injury and myocardial injury by taking NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3 (NLRP3) inflammasome as the breakthrough point.Male SD rats were randomly divided into control group, model group, nimodipine (10 mg/kg) group and baicalin-geniposide low-, medium- and high-dose (30, 45, 60 mg/kg) groups, with 10 rats in each group. After 7 d of administration, the rat model of focal cerebral ischemia was established by thread embolism method, and neurological function was scored by Zea-Longa scoring standard. The edema of brain tissue was detected by dry-wet mass method; Cerebral blood flow was detected by laser Doppler; HE staining was used to observe the pathological changes of brain and myocardium; TUNEL staining was used to observe myocardial apoptosis; The activities of myocardial zymogram in myocardial tissue was determined by ELISA. Network pharmacology method was used to predict the mechanism of baicalin-geniposide against cerebral ischemia injury and myocardial injury; Levels of interleukin-1β (IL-1β), IL-6, IL-18 and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in serum were detected by ELISA; Western blotting was used to detect the expressions of NLRP3 inflammasome related protein in brain tissue and myocardial tissue.Compared with control group, brain and heart tissue of model group were seriously damaged, levels of inflammatory factors were increased (< 0.01), and activities of myocardial enzymes were significantly increased (< 0.01). Compared with model group, pathological damage of brain and heart tissue were alleviated in different degrees, brain water content, neurological function score, myocardial cell apoptosis rate and myocardial enzyme spectrum in serum were significantly decreased (< 0.05, 0.01), and cerebral blood flow was significantly increased (< 0.05, 0.01) in each administration group. The results of network pharmacology showed that NOD-like signaling pathway played an important role in prevention and treatment of cerebral ischemia and its complicated myocardial injury by baicalin-geniposide. NOD-like receptor family NLRP3 inflammasome were selected for further study. The results of ELISA and qRT-PCR showed that, levels of IL-1β, IL-6, IL-18, TNF-α in serum and expressions of NLRP3 inflammasome protein in brain cortex and myocardial tissue of rats in model group were significantly increased (< 0.01), while levels of inflammatory factors in serum and expressions of NLRP3 inflammasome protein in brain cortex and myocardial tissue were significantly decreased (< 0.01).Baicalin-geniposide could inhibit the expression of inflammatory mediators, and play an anti-cerebral ischemia injury and myocardial injury after stroke by down-regulating NLRP3 inflammasome.

baicalin-gardenoside; cerebral ischemic stroke; heart injury after stroke; brain-heart axis; NLRP3; network pharmacology

R285.5

A

0253 - 2670(2023)06 - 1833 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.06.015

2022-10-04

國家自然科學(xué)基金資助項目（81473385）；中醫(yī)藥“雙鏈融合”中青年科研創(chuàng)新團(tuán)隊（2022-SLRH-YQ-006）；陜西省中醫(yī)藥科研項目（2021-ZZ-JC023）；咸陽市重點研發(fā)科技項目（JBGS-001）

趙 麓，碩士研究生，研究方向為心腦血管疾病藥理學(xué)。E-mail: mountainzhao@qq.com

王 斌，博士生導(dǎo)師，教授，從事中藥藥理心腦血管疾病研究。E-mail: wangbin812@126.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]