黃連須多糖降血糖活性及結(jié)構(gòu)表征

田谷正男，周鑫超，頡若童，王 譽(yù)，毛美林，鄧子言，蔡長(zhǎng)君，涂 康，朱希強(qiáng)，姜 寧, 2，劉曉鵬, 2*

黃連須多糖降血糖活性及結(jié)構(gòu)表征

田谷正男1，周鑫超1，頡若童1，王 譽(yù)1，毛美林1，鄧子言1，蔡長(zhǎng)君1，涂 康1，朱希強(qiáng)1，姜 寧1, 2，劉曉鵬1, 2*

1. 湖北民族大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，湖北 恩施 445000 2. 生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000

探究黃連副產(chǎn)品黃連須多糖（fibrous polysaccharides，CRFP）的降血糖活性和物質(zhì)基礎(chǔ)。研究CRFP對(duì)糖尿病模型小鼠的作用，并對(duì)其進(jìn)行分離純化，檢測(cè)純化產(chǎn)物的純度和相對(duì)分子質(zhì)量，分析其結(jié)構(gòu)和單糖組成。給藥8周后，CRFP能顯著降低糖尿病模型小鼠的血糖（＜0.01），加速小鼠的血糖和血脂代謝，提高空腹胰島素水平（＜0.01），改善血脂紊亂（＜0.05、0.01），提高肝臟己糖激酶（hexokinase，HK）和丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）活性（＜0.01），改善氧化應(yīng)激（＜0.05、0.01）。CRFP經(jīng)純化后得到成分均一的多糖CRFP-1和CRFP-2，相對(duì)分子質(zhì)量分別為24 307±311和18 405±168，CRFP-1為α-型多糖，由8種單糖組成；CRFP-2為β-型多糖，由10種單糖組成。CRFP具有良好的降血糖活性，為黃連這一傳統(tǒng)中藥的深度開(kāi)發(fā)和提高利用價(jià)值奠定了基礎(chǔ)。

黃連須；多糖；糖尿?。环蛛x純化；結(jié)構(gòu)解析

糖尿病作為代謝紊亂的慢性疾病，主要由體內(nèi)胰島素分泌障礙或胰島素耐受引起，糖尿病會(huì)引起體內(nèi)臟器受損，引發(fā)一系列并發(fā)癥，甚至導(dǎo)致死亡[1-2]。2021年全世界20～79歲糖尿病患者約占10.5%（5.37億），預(yù)計(jì)2045年將達(dá)到12.2%（7.83億）[3]，我國(guó)是成人糖尿病患者最多的國(guó)家，2021年達(dá)1.4億[4]，其中90%以上為2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）。目前，已有多種降糖藥物被用于臨床治療T2DM，如二甲雙胍、磺脲類、格列奈類、α-糖苷酶抑制劑、噻唑烷二酮類、二肽基肽酶IV（dipeptidyl peptidaseIV，DPP-4）、鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（sodium-glucose cotransporter 2，SGLT2）、胰高糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑、胰島素，但這些降糖藥物會(huì)引起胃腸道反應(yīng)、低血糖、骨質(zhì)疏松、心力衰竭、泌尿生殖系統(tǒng)感染等不良反應(yīng)[5]。研究表明多種植物多糖具有較強(qiáng)的降血糖活性，且來(lái)源廣泛、安全性好，是篩選新型降血糖藥物的寶庫(kù)[6-7]。

黃連為毛茛科植物黃連Franch.的干燥根莖[8]，多項(xiàng)研究表明，黃連多糖具有降血糖、抗氧化、調(diào)血脂等活性[9-11]。但藥用黃連生長(zhǎng)周期為3～4年，而收獲時(shí)大量的黃連須被廢棄，課題組前期研究表明，黃連須富含多糖，且具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性[12]。本研究以黃連須多糖（fibrous polysaccharides，CRFP）為對(duì)象，研究CRFP對(duì)糖尿病模型小鼠的作用，明確其降血糖活性，從中分離純化出2種成分均一的多糖，并解析其結(jié)構(gòu)，為提高黃連的利用率，將黃連須變廢為寶提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性ICR小鼠，體質(zhì)量18～22 g，6周齡，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（遼）2020-0001。動(dòng)物于溫度（24±2）℃、12 h光晝交替的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖北民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為（2021）131。

1.2 藥品與試劑

CRFP為本實(shí)驗(yàn)室提取并制備[12]；右旋糖酐分子量標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)10237229）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；標(biāo)準(zhǔn)品鼠李糖（批號(hào)O12A10K95105，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、阿拉伯糖（批號(hào)K28J12B135956，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、甘露糖（批號(hào)TS08J12G137083，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、巖藻糖（批號(hào)X16N8Y48166，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、半乳糖（批號(hào)MFCD00151230，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%）、半乳糖醛酸（批號(hào)3962101，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞97%）、葡萄糖醛酸（批號(hào)R09J11H115178，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、核糖（批號(hào)B21897，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)品木糖（批號(hào)D17N9S74410，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%）購(gòu)自TMstandard；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP，批號(hào)C11370802，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三氟乙酸（批號(hào)H2123035）、乙腈（批號(hào)0114220806）、鹽酸二甲雙胍（批號(hào)D16GS171362)、氯化鈉（批號(hào)20190919）、無(wú)水乙醇（批號(hào)20211014）、硫酸（批號(hào)20210517）、蒽酮（批號(hào)20210220）、氯仿（批號(hào)20210514）、磷酸二氫鉀（批號(hào)20180223）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，批號(hào)20210316）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；檸檬酸鈉（批號(hào)20201006）購(gòu)自天津博迪化工股份有限公司；甲醇（批號(hào)20180605）購(gòu)自武漢市中天化工有限責(zé)任公司；鹽酸（批號(hào)2022110902）購(gòu)自成都市科隆化學(xué)品有限公司；葡萄糖檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20201029）、總膽固醇（total cholesterol，TC）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20210708）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20210703）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20210703）、三酰甘油（triacylglycerol，TG）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20210430）、游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20210728）、己糖激酶（hexokinase，HK）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20210726）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20220822）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20220827）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20211105）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20180508）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20180302）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20190731）、胰島素檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20210728）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；其余試劑均為分析純。

1.3 儀器

P680A型液相色譜（戴安中國(guó)有限公司）；RI-101型示差折光檢測(cè)器（日本Showa Denko K.K.公司）；Nicolet iS5型傅里葉紅外光譜儀、Multiskan FC全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientic公司）；HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州智博儀器制造有限公司）；752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海菁華科技有限公司）；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

2 方法

2.1 CRFP對(duì)糖尿病模型小鼠的影響

2.1.1 動(dòng)物分組、造模和給藥 ICR小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（10只）、模型組、二甲雙胍（200 mg/kg）組和CRFP低、中、高劑量（100、200、400 mg/kg）組各13只。模型組和各給藥組連續(xù)4 d ip STZ（50 mg/kg），對(duì)照組ip等體積的檸檬酸緩沖液，除對(duì)照組外其余各組給予高脂飼料喂養(yǎng)。檢測(cè)小鼠空腹血糖，選取空腹血糖≥11.1 mmol/L[13]的10只小鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。造模成功后，各給藥組ig相應(yīng)藥物，對(duì)照組和模型組ig等體積的蒸餾水，1次/d，連續(xù)8周。

2.1.2 生理生化指標(biāo)檢測(cè) 治療期間，各組小鼠每周眼眶靜脈叢取血，檢測(cè)空腹血糖。取血前小鼠禁食8 h，自由飲水，取血后3500 r/min離心15 min，取血清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)血糖含量。

治療結(jié)束后，小鼠禁食8 h，進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（oral glucose tolerance test，OGTT）。各組小鼠ig葡萄糖（2 g/kg），分別于0、0.5、1、1.5、2 h眼眶靜脈叢取血，測(cè)定血糖，繪出血糖變化曲線，計(jì)算曲線下面積（area under curve，AUC）[14]。

OGTT結(jié)束24 h后，小鼠禁食8 h，進(jìn)行口服脂肪耐量試驗(yàn)（oral fat tolerance test，OFTT）。各組小鼠ig橄欖油（10 mL/kg）。分別于0、1、2、3、4 h眼眶靜脈叢取血，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)血清TG水平，繪出血脂變化曲線，計(jì)算AUC[15]。

最后，摘眼球取血，血液3500 r/min離心15 min取血清，按照說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)血糖、空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）、TC、TG、LDL-C、HDL-C、FFA水平。

取小鼠肝臟，生理鹽水清洗，稱定質(zhì)量，剪碎，加入9倍體積的生理鹽水，制成10%勻漿，2500 r/min離心10 min，取上清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)勻漿液中HK和PK活性；按照說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定小鼠血清和肝臟中SOD、CAT、T-AOC、GSH-Px活性及MDA含量。

2.2 CRFP的結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 CRFP的分離純化 將CRFP粉末溶于20 mmol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 4.5）中，進(jìn)行DEAE纖維素DE-52色譜分離，醋酸-醋酸鈉緩沖液洗脫3個(gè)柱體積，分管收集，硫酸-蒽酮法[16]檢測(cè)每管的多糖含量，合并洗脫峰，為CRFP-a；然后用含1mol/L NaCl的醋酸-醋酸鈉緩沖液洗脫3個(gè)柱體積，分管收集，檢測(cè)每管的多糖含量，合并洗脫峰，為CRFP-b。分別將CRFP-a和CRFP-b醇沉，60 ℃烘干。分別將CRFP-a和CRFP-b配制成10 mg/mL的水溶液，采用Sephacry1 S-200凝膠過(guò)濾色譜純化，蒸餾水洗脫，體積流量為1 mL/min，分管收集洗脫液，檢測(cè)每管的多糖含量，合并洗脫峰，分別命名為CRFP-1和CRFP-2，冷凍干燥。

2.2.2 多糖純度和相對(duì)分子質(zhì)量的檢測(cè) 采用高效分子排阻色譜（high performance molecular exclusion chromatography，HPSEC）法[17]檢測(cè)多糖純度和相對(duì)分子質(zhì)量。Shodex SUGAR KS-805色譜柱（300 mm×8 mm）；檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器；流動(dòng)相為H2O；體積流量1 mL/min；柱溫65 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

將不同相對(duì)分子質(zhì)量（分別為180、2700、5250、9750、13 050、36 800）的右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成2 mg/mL的水溶液，上樣，以相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，保留時(shí)間為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別將CRFP-1和CRFP-2水溶液按上述條件進(jìn)行HPSEC，根據(jù)色譜圖分析樣品純度，根據(jù)保留時(shí)間計(jì)算樣品的相對(duì)分子質(zhì)量。

2.2.3 紅外光譜掃描 分別稱取2 mg CRFP-1和CRFP-2，加入一定量溴化鉀充分研磨，制成溴化鉀壓片進(jìn)行傅里葉紅外光譜掃描[18]，掃描范圍為500～4000 cm?1。

2.2.4 CRFP單糖組成分析 CRFP-1和CRFP-2采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）柱前衍生法[19]測(cè)定其單糖組成。稱取多糖樣品10 mg于水解管中，加入4 mol/L三氟乙酸1 mL，于120 ℃烘箱中水解2 h。然后氮?dú)獯蹈?，加蒸餾水定容至20 mL。分別稱取鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、巖藻糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、核糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，配制成1.0 mg/mL的混合溶液，稀釋成質(zhì)量濃度分別為2.5、5.0、12.0、18.0、25.0 μg/mL的溶液。取樣品和標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5 mL，加1 mL 0.5 mol/L PMP-甲醇溶液以及0.5 mL 0.3 mol/L NaOH溶液，70 ℃水浴60 min，冷卻后依次加入0.5 mL 0.3 mol/L HCl溶液和0.5 mL氯仿，振蕩搖勻后靜置20 min，棄去下層，萃取3次，取水層過(guò)0.45 μm濾膜進(jìn)行HPLC分析。色譜條件：SHISEIDO C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.1 mol/L KH2PO4（pH 6.8）-乙腈（82∶18）；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL，波長(zhǎng)245 nm。以單糖標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為自變量，峰面積為因變量，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品各單糖的峰面積計(jì)算單糖含量，計(jì)算物質(zhì)的量比。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 CRFP對(duì)糖尿病模型小鼠的影響

3.1.1 CRFP對(duì)糖尿病小鼠血糖、OGTT、OFTT和FINS水平的影響 如圖1-A所示，造模后，模型組血糖水平呈上升趨勢(shì)；經(jīng)CRFP治療2周后血糖逐步下降。如圖1-B所示，治療結(jié)束后ig葡萄糖，各給藥組血糖隨時(shí)間的變化趨勢(shì)一致，均在ig葡萄糖0.5 h時(shí)達(dá)到最大值，然后逐步下降，2 h后恢復(fù)。根據(jù)各組的血糖變化曲線，計(jì)算各組的AUC，與對(duì)照組比較，各給藥組的AUC均與模型組有顯著差異（＜0.01），說(shuō)明CRFP能顯著加快糖尿病模型小鼠的葡萄糖代謝速度，從而降低血糖。

如圖1-C所示，治療結(jié)束后，各組小鼠的TG水平各異，這是因?yàn)樘悄虿⌒∈蟮难x紊亂，模型組的TG維持在較高水平，各給藥組TG水平有所降低，但下降程度有所不同。ig橄欖油后，各組小鼠的TG變化趨勢(shì)相同，均在2 h時(shí)達(dá)最高值，隨后開(kāi)始下降。計(jì)算各組TG的AUC，與模型組比較，CRFP中、高劑量組的AUC均顯著降低（＜0.05、0.01），CRFP低劑量組雖然與模型組無(wú)顯著差異，但已表現(xiàn)出下降趨勢(shì)。因此，CRFP能加速糖尿病小鼠的脂肪代謝，具有潛在的改善糖尿病脂肪代謝紊亂功能。如圖1-D所示，與對(duì)照組比較，模型組FINS水平顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組FINS水平均顯著升高（＜0.01），且呈劑量相關(guān)性。

與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

3.1.2 CRFP對(duì)糖尿病小鼠肝臟HK和PK活性的影響 如表1所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠肝臟HK和PK活性均顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組肝臟HK活性均顯著升高（＜0.01），二甲雙胍組和CRFP中、高劑量組PK活性均顯著升高（＜0.01），且呈劑量相關(guān)性。表明CRFP能有效提高肝臟HK和PK活性，從而達(dá)到降低血糖的作用。

表1 CRFP對(duì)糖尿病小鼠肝臟HK和PK活性的影響(, n = 10)

與對(duì)照組比較：##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01，下表同

##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group, same as below tables

3.1.3 CRFP對(duì)糖尿病小鼠血脂的影響 如表2所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠TC、LDL-C、TG、FFA水平均顯著升高（＜0.01），HDL-C水平顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組LDL-C、TG、FFA水平均顯著降低（＜0.05、0.01），HDL-C水平顯著升高（＜0.05、0.01）；二甲雙胍組和CRFP中、高劑量組TC水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。

3.1.4 CRFP對(duì)糖尿病小鼠體內(nèi)抗氧化活性的影響 如表3、4所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清和肝臟中SOD、CAT、T-AOC和GSH-Px活性均顯著降低（＜0.01），MDA水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組血清和肝臟中SOD、CAT、T-AOC和GSH-Px活性均顯著升高（＜0.05、0.01），MDA水平顯著降低（＜0.01）。

3.2 CRFP的結(jié)構(gòu)表征

3.2.1 DE-52離子交換色譜 圖2為CRFP經(jīng)DE-52離子交換色譜不同洗脫液的洗脫圖譜，CRFP經(jīng)20 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 4.5）和1 mol/L NaCl緩沖液洗脫后各自得到單一峰，分別收集對(duì)應(yīng)主峰的洗脫液，醇沉，60 ℃烘干。得到CRFP-a和CRFP-b，離子交換色譜的得率分別為28.25%和53.17%。

表2 CRFP對(duì)糖尿病小鼠血脂的影響(, n = 10)

表3 CRFP對(duì)糖尿病小鼠血清抗氧化活性的影響(, n = 10)

表4 CRFP對(duì)糖尿病小鼠肝臟抗氧化活性的影響(, n = 10)

圖2 CRFP DE-52 HAc-NaAc緩沖液洗脫曲線(A) 和鹽洗脫曲線(B)

3.2.2 Sephacry1 S-200凝膠過(guò)濾色譜 CRFP-a和CRFP-b分別經(jīng)Sephacry1 S-200分子篩進(jìn)一步純化后均得到單一洗脫峰（圖3），分別收集對(duì)應(yīng)的洗脫液，冷凍干燥，分別命名為CRFP-1和CRFP-2，凝膠過(guò)濾色譜的得率分別為82.39%和78.65%。

3.2.3 CRFP-1和CRFP-2純度和相對(duì)分子質(zhì)量的檢測(cè) CRFP-1和CRFP-2經(jīng)高效液相示差檢測(cè)均為單一對(duì)稱峰，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為99.86%和99.58%，均為均一組分多糖（圖4）。右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值（lgP）與保留時(shí)間（R）具有線性關(guān)系，2＝0.996，線性方程為＝?0.587 9＋12.531。高效液相檢測(cè)CRFP-1的R為（9.953±0.006）min、CRFP-2的R為（10.024±0.002）min，根據(jù)線性方程求得所對(duì)應(yīng)的相對(duì)分子質(zhì)量為24 307±311和18 405±168。

圖3 CRFP-a (A) 和CRFP-b(B) S-200洗脫曲線

圖4 CRFP-1 (A) 和CRFP-2 (B) 高效液相色譜圖

3.2.4 紅外光譜掃描 CRFP-1紅外光譜掃描結(jié)果見(jiàn)圖5-A，在3383 cm?1附近處的特征吸收峰為O-H伸縮振動(dòng)吸收峰；在2932 cm?1附近處為C-H伸縮振動(dòng)吸收峰；在1649 cm?1附近為-CHO上的C＝O縮振動(dòng)吸收峰，是酰胺碳基的特征吸收峰；在1376 cm?1附近為＝CH2變形吸收峰；在1252 cm?1附近為C-H彎曲振動(dòng)吸收峰；在1041 cm?1附近為醇羥基-OH變角振動(dòng)吸收峰，在865 cm?1附近為α-型糖苷鍵的特性吸收峰，說(shuō)明CRFP-1為α-型多糖。

CRFP-2紅外光譜掃描結(jié)果見(jiàn)圖5-B，在3417 cm?1附近處的特征吸收峰為O-H伸縮振動(dòng)吸收峰；在2927 cm?1附近處為C-H伸縮振動(dòng)吸收峰；在1614 cm?1為-OH彎曲振動(dòng)吸收峰；1414 cm?1為＝CH2變形吸收峰；在1251 cm?1附近為C-H彎曲振動(dòng)吸收峰；在1074 cm?1附近為醇羥基-OH變角振動(dòng)吸收峰，在916 cm?1附近為β-型糖苷鍵的特性吸收峰，說(shuō)明CRFP-2為β-型多糖。

3.2.5 CRFP-1和CRFP-2單糖組成 如圖6所示，與單糖標(biāo)準(zhǔn)品圖譜比較，CRFP-1由8種單糖組成，分別為甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖，物質(zhì)的量比為0.245∶0.071∶0.003∶0.001∶0.122∶0.425∶0.123 5∶0.01，其中半乳糖占比最高。CRFP-2由10種單糖組成，分別為甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖，物質(zhì)的量比為0.061∶0.01∶0.083∶0.128∶0.127∶0.038∶0.301∶0.048∶0.112∶0.093，其中半乳糖占比最高。

圖5 CRFP-1 (A) 和CRFP-2 (B) 紅外掃描圖譜

1-甘露糖 2-核糖 3-鼠李糖 4-葡萄糖醛酸 5-半乳糖醛酸 6-葡萄糖 7-半乳糖 8-木糖 9-阿拉伯糖 10-巖藻糖

4 討論

課題組前期研究表明，CRFP得率高于黃連多糖，且具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性[12]。黃連多糖的降血糖作用已得到證實(shí)[20-21]，但CRFP是否具有降血糖作用，還需研究確認(rèn)。由于黃連須成本遠(yuǎn)低于黃連，所以從黃連須中得到降血糖的多糖具有重大意義。本研究表明CRFP能顯著降低糖尿病小鼠的空腹血糖水平，降低OGTT的AUC，說(shuō)明加速外周組織（肝、肌肉、脂肪）對(duì)葡萄糖的利用、改善胰島素抵抗是CRFP降血糖的機(jī)制之一；提高FINS，表明CRFP能改善受損胰島的功能，促進(jìn)胰島素分泌；HK和PK作為體內(nèi)糖酵解過(guò)程中的關(guān)鍵性的限速酶，在體內(nèi)糖代謝過(guò)程發(fā)揮重要作用，CRFP提高了糖尿病小鼠肝臟的HK和PK活性，說(shuō)明CRFP能通過(guò)提高糖代謝中的關(guān)鍵酶活性起到降血糖作用。糖代謝異常會(huì)導(dǎo)致血脂代謝紊亂，引發(fā)高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化和心血管疾病等。本研究結(jié)果顯示，給予CRFP后糖尿病小鼠OFTT的AUC、TG、TC、LDL-C和FFA含量顯著降低，HDL-C水平提高，說(shuō)明CRFP能改善糖尿病引起的血脂代謝紊亂，降低由血脂異常引發(fā)的糖尿病并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)。血糖升高會(huì)引起體內(nèi)氧化應(yīng)激水平增高，反之，氧化應(yīng)激水平增高又會(huì)加劇血糖升高，所以抗氧化是治療糖尿病的重要輔助手段。CRFP能顯著提高糖尿病小鼠血清和肝臟中的抗氧化活性，顯示抗氧化活性亦是CRFP降血糖的機(jī)制之一。

在證實(shí)CRFP降血糖活性后，本研究通過(guò)色譜技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了分離純化，得到2種成分均一的精多糖CRFP-1和CRFP-2，并解析了結(jié)構(gòu)。李云[20]采用了4種不同梯度的NaCl溶液作為洗脫液，得到了4種電荷量不同的黃連多糖；范剛等[22]通過(guò)柱前衍生法分析了3種不同品種黃連單糖組分，均有7種單糖組分，而本研究的CRFP-1和CRFP-2分別由8種和10種單糖組成，與張亞麗等[23]的研究基本一致。研究材料、提取方法和分離純化技術(shù)的不同會(huì)導(dǎo)致單糖組成存在差異。至于CRFP-1和CRFP-2在降血糖中的作用還有待進(jìn)一步研究。

綜上，本研究從黃連采收過(guò)程中廢棄的黃連須中提取了CRFP，研究該多糖對(duì)糖尿病小鼠的作用，發(fā)現(xiàn)CRFP通過(guò)促進(jìn)外周組織對(duì)葡萄糖的利用、提高胰島分泌胰島素能力、加速葡萄糖代謝、改善血脂代謝紊亂和提高氧化應(yīng)激水平降低血糖，具有開(kāi)發(fā)成降血糖藥物的潛力。為進(jìn)一步深入研究CRFP的結(jié)構(gòu)和組成，本研究對(duì)CRFP進(jìn)行了分離純化，得到了成分均一的α-型CRFP-1和β-型CRFP-2，相對(duì)分子質(zhì)量分別為24 307±311和18 405±168，均為半乳糖含量最高，但其他組成各異。CRFP-1和CRFP-2在降血糖中所起的作用還有待進(jìn)一步研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Hypoglycemic activity and structure characterization offibrous polysaccharides

TIAN Gu-zheng-nan1, ZHOU Xin-chao1, XIE Ruo-tong1, WANG Yu1, MAO Mei-ling1, DENG Zi-yan1, CAI Chang-jun1, TU Kang1, ZHU Xi-qiang1, JIANG Ning1, 2, LIU Xiao-Peng1, 2

1. College of Biological and Food Engineering, Hubei Minzu University, Enshi445000, China 2. Hubei Key Laboratory of Biological Resources Protection and Utilization, Enshi 445000, China

To explore the hypoglycemic activity and material basis of Huanglian () fibrous polysaccharides (CRFP), a by-product of.The effect of CRFP on diabetes model mice was studied and CRFP was purified. The purity and relative molecular weight of purified product were detected, and its structure and monosaccharide composition were analyzed.After eight weeks of administration, CRFP could significantly reduce blood glucose (< 0.01), accelerate blood glucose and lipid metabolism, increase fasting insulin level (< 0.01), improve blood lipid disorder (< 0.05, 0.01), increase liver hexokinase (HK) and pyruvate kinase (PK) activities (< 0.01), and improve oxidative stress (< 0.05, 0.01) in diabetes model mice. After purification, CRFP-1 and CRFP-2 with uniform components were obtained. The relative molecular weight of CRFP-1 and CRFP-2 respectively were (24 307 ± 311) and (18 405 ± 168), CRFP-1 was α-type polysaccharide, composed of eight monosaccharides; CRFP-2 was β-type polysaccharide, composed of 10 monosaccharides.CRFP has good hypoglycemic activity, which lays a foundation for the deep development and improvement of utilization value of.

fibrous; polysaccharides; diabetes mellitus; separation and purification; structural analysis

R285.5

A

0253 - 2670(2023)06 - 1825 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.06.014

2022-11-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82160713）；湖北省技術(shù)創(chuàng)新專項(xiàng)（2017AKB077，2016AKB058）；湖北產(chǎn)業(yè)教授人才項(xiàng)目（2019029，2021067）；湖北民族大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（X202210517208）

田谷正男（1994—），男，研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物研究。E-mail: 976050052@qq.com

劉曉鵬（1971—），男，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物研究。Tel: 15671896031 E-mail: liuxp999@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]