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    冬蓀綠霉病病原鑒定及藥劑篩選

    2023-03-20 06:14:58劉忠玄王萬(wàn)坤
    安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2023年4期
    關(guān)鍵詞:甲環(huán)唑咪鮮胺苯醚

    劉忠玄,王萬(wàn)坤,吳 陽(yáng),黃 靜,王 晶,王 芳,馬 丁,康 超*

    (1.貴州科學(xué)院貴州省生物研究所,貴州貴陽(yáng) 550025;2.貴州科學(xué)院貴州省分析測(cè)試院,貴州貴陽(yáng) 550002;3.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院,貴州銅仁 554300)

    冬蓀(Phallusdongsun),常寄生于枯竹根部,屬于鬼筆目(Phallales)鬼筆科(Phallaceae)鬼筆屬(Phallus)[1],是一種營(yíng)養(yǎng)豐富、味道鮮美、肉質(zhì)松脆的食藥兩用的林下真菌。自然條件下,冬蓀單生或簇生于林下腐殖質(zhì)層中,主要分布于貴州、四川、云南、廣東、安徽等地[2-4]。冬蓀子實(shí)體未開(kāi)傘前呈球形或卵圓形,俗稱(chēng)菌蕾或菌蛋,半埋土生,灰色至白色,野生菌蛋直徑5~7 cm,人工種植菌蛋可達(dá)20 cm,基部有白色或淺黃色菌索,后期表面有皺紋,有彈性,待菌蛋硬化成熟后,菌托層由上部裂開(kāi)開(kāi)傘,形成白色子實(shí)體。冬蓀富含鄰苯二甲酸二丁酯、多糖、紫蘇烯、異山梨醇、麥甾醇、甲基硫醇、氨基酸、糖醛酸聚糖等成分,提取物能抑制腐敗菌生長(zhǎng),可開(kāi)發(fā)為短期的生物性防腐劑,子實(shí)體、菌柄和菌托具有一定的治風(fēng)濕、活血祛瘀、鎮(zhèn)痛、抗氧化甚至抗癌的藥用活性[5-7],適當(dāng)?shù)氖秤每稍鰪?qiáng)免疫力、防病保健[8],隨著食藥價(jià)值和資源開(kāi)發(fā)利用研發(fā)不斷突破,冬蓀日益成為人們關(guān)注的珍稀食用菌焦點(diǎn)。

    冬蓀是貴州省大方縣的地方特色,也是中國(guó)國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品,更是貴州省最主要林下經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)之一。2015年前大方縣、織金縣及周邊已種植超過(guò)133.33 hm2[9],至2016年達(dá)400 hm2,凈產(chǎn)量約60 t。十三五期間,貴州省規(guī)劃人工種植冬蓀約666.67 hm2,產(chǎn)量達(dá)5萬(wàn)t[貴州省“十三五”食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃(2016—2020年)]。近年來(lái),隨著貴州省農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整以及脫貧攻堅(jiān)和鄉(xiāng)村振興發(fā)展戰(zhàn)略,助推食用菌產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展,冬蓀種植規(guī)模不斷擴(kuò)大,尤其是國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品認(rèn)證后,冬蓀產(chǎn)業(yè)在貴州形成裂變式發(fā)展,產(chǎn)品數(shù)量和質(zhì)量不斷提升,相關(guān)的科研成果也不斷涌現(xiàn),但國(guó)內(nèi)外對(duì)冬蓀的研究集中于資源分類(lèi)、組織分離、良種選育、栽培技術(shù)、農(nóng)藥及重金屬殘留、生化藥理特性等方面[10-12]。冬蓀病蟲(chóng)害研究極少,主要是其抗病蟲(chóng)害能力較強(qiáng),一是冬蓀子實(shí)體由菌蛋生長(zhǎng)破殼形成,自身具備較好的物理防御系統(tǒng);二是冬蓀特殊的氣味和分泌物能有效趨避部分病蟲(chóng)害侵染,因此,關(guān)于冬蓀病蟲(chóng)害的研究極少。

    2020和2021年秋季,正直冬蓀收獲期,筆者所在課題組成員分別從貴州省畢節(jié)市大方、織金2個(gè)縣采集65份冬蓀菌蛋綠霉病樣本,并對(duì)5個(gè)種植基地(約20 hm2)進(jìn)行初步調(diào)查,其發(fā)病率達(dá)9%,發(fā)病程度為輕度。經(jīng)鑒定為絨毛木霉(T.tomentosum)引起的冬蓀新病害,嚴(yán)重制約當(dāng)?shù)囟p產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展,急需闡明該病害的病原學(xué)并提出科學(xué)的防控方案。然而,截至2020年末,中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng)(http://www.chinapesticide.org.cn/)登記的食用菌可用農(nóng)藥產(chǎn)品13個(gè)、有效成分6種,3種類(lèi)型(植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、殺菌劑、殺蟲(chóng)劑),僅咪鮮胺錳鹽為殺菌劑[13],但均未提及冬蓀病害,關(guān)于該病害的防治仍是空白,防治藥劑急需篩選論證。因此,明確冬蓀綠霉病病原種類(lèi)、篩選具有針對(duì)性的高效殺菌劑并進(jìn)行藥劑混配試驗(yàn),選出共毒系數(shù)較高的混配方案為生產(chǎn)實(shí)踐提供理論參考,對(duì)當(dāng)?shù)囟p綠霉病的防控和延緩病原抗藥性具有十分重要的指導(dǎo)意義。

    1 材料與方法

    1.1 材料2020和2021年秋季,從貴州省畢節(jié)市大方縣、織金縣采集冬蓀綠霉病菌蛋共65份,用無(wú)菌袋密封包裝帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病害診斷、病原分離。

    4種殺菌劑原藥分別為95%咪鮮胺錳鹽(常州天擇化工有限公司)、96%吡唑醚菌酯(湖北康寶泰精細(xì)化工有限公司)、96%苯醚甲環(huán)唑(常熟恒耀新材料有限公司)、95%唑菌酯(沈陽(yáng)化工研究院有限公司)。

    1.2 冬蓀綠霉病病原菌分離培養(yǎng)組織分離法:選擇輕、中度感病菌蛋樣品,以75%無(wú)水乙醇消毒10 s,再用1% NaClO消毒1 min,無(wú)菌水沖洗3次并用無(wú)菌濾紙吸干水分,切取病健交界處組織塊(0.5 cm ×0.5 cm ×0.5 cm)于PDA培養(yǎng)基中25 ℃黑暗培養(yǎng)3 d,挑取純凈的菌絲進(jìn)一步純化,分離物保存于4 ℃的PDA斜面。

    菌絲分離法:在超凈工作臺(tái)中用無(wú)菌針挑取中、重度感病菌蛋樣品表面病原菌菌絲尖端,置于PDA培養(yǎng)基中25 ℃黑暗培養(yǎng)3 d,進(jìn)一步純化得到純分離物保存于4 ℃的PDA斜面。

    觀察記錄PDA培養(yǎng)基上病原菌落形態(tài)、培養(yǎng)特征,顯微鏡下觀察分生孢子、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)形態(tài)和大小并拍照。

    1.3 病原物致病性驗(yàn)證2021年10月,在大方縣2個(gè)冬蓀基地(105°41′45″E,27°10′16″N),采用注射法將孢子懸浮液(106conidia/mL)接種至無(wú)癥狀的冬蓀菌蛋(直徑8~12 cm)表皮層,每個(gè)菌蛋2個(gè)接種點(diǎn),各50 μL,從分離純化獲得培養(yǎng)特征相似的菌株15株中隨機(jī)選擇3個(gè)代表菌株(GZDS1101、GZDS1102、GZDS1103)進(jìn)行接種,各10個(gè)重復(fù),以10個(gè)無(wú)菌水接種為對(duì)照。

    1.4 病原物分子鑒定參照擎科生物提供試劑盒[T5Direct PCR Kit(TSE011)(TsingKe,Beijing,China)]說(shuō)明提取病原DNA,并參照各引物特性進(jìn)行PCR擴(kuò)增。3個(gè)致病代表菌株GZDS1101、GZDS1102、GZDS1103的ITS、tef1、rpb2基因片段分別采用引物:(ITS)ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′),(ITS)ITS4(5′-TCCGCTTATTGATATGC-3′);(tef1)EF1-728F(5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′),(tef1)TEF1LLErev(5′-AACTTGCAGGCAATGTGG-3′)[14];(rpb2)fRPB2-5F(5′-GGAGGATACTTCATCATCAATGG-3′),(rpb2)fRPB2-7cR(5′-CCCATGGCTTGCTTGCCCAT-3′)[15]。

    PCR反應(yīng)體系(50 μL),DNA模板1 μL,引物1 μL,2 × T5Direct PCR Mix 25 μL,ddH2O補(bǔ)足50 μL。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)熱5 min,94 ℃變性30 s,55~60 ℃(各引物不同)退火30 s,72 ℃延伸1 min,72 ℃補(bǔ)平10 min,40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)并純化后送至擎科生物上海分公司進(jìn)行測(cè)序并用Chromas軟件分析序列,上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù),通過(guò)BLAST同源比對(duì),采用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

    1.5 防治藥劑篩選采用菌絲生長(zhǎng)速率法篩選藥劑[16]。以GZDS1101為供試病原菌,將4種原藥配制成母液再稀釋至少5個(gè)濃度梯度,按體積1∶9加入PDA并制成平板,取直徑5 mm菌餅接種于5個(gè)濃度的PDA帶毒平板中心,等量無(wú)菌水代替農(nóng)藥作為對(duì)照,重復(fù)3次,28 ℃培養(yǎng)2~3 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,運(yùn)用DPS 13.0系統(tǒng)計(jì)算各藥劑對(duì)絨毛木霉菌絲生長(zhǎng)抑制回歸方程和EC50。

    菌絲生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑)×100%

    將咪鮮胺錳和苯醚甲環(huán)唑進(jìn)行組合配比,按質(zhì)量濃度8∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶8混合并稀釋至試驗(yàn)濃度進(jìn)行測(cè)試,以單劑作為對(duì)照,以無(wú)菌水替代為空白對(duì)照,各重復(fù)3次,求得各配比的毒力回歸方程和EC50,再根據(jù)共毒系數(shù)法求得獨(dú)立指數(shù)、理論毒力指數(shù)、實(shí)際毒力指數(shù)和混合劑的共毒系數(shù)CTC,CTC>120為增效作用,80

    實(shí)測(cè)藥劑毒力指數(shù)(ATI)=標(biāo)準(zhǔn)藥劑的EC50/供試藥劑的EC50×100%

    混劑理論毒力指數(shù)(TTI)=(藥劑A毒力指數(shù)×Ax)+(藥劑B毒力指數(shù)×Bx)(Ax、Bx為藥劑A、B在混劑中的百分比)

    共毒系數(shù)(CTC)=ATI/TTI×100%

    2 結(jié)果與分析

    2.1 冬蓀綠霉病病害癥狀該病害發(fā)生于冬蓀菌蛋上,成熟子實(shí)體未見(jiàn)發(fā)生。病害的早期,菌蛋表面出現(xiàn)不規(guī)則的、褐色至黑色斑點(diǎn),呈水漬狀,病斑不斷擴(kuò)大,2~3 d后產(chǎn)生白霉?fàn)钗?病原的菌絲體),菌蛋表皮出現(xiàn)腐爛癥狀并軟化,灰白色的表皮變?yōu)槊黠@水漬狀,開(kāi)裂,內(nèi)部肉質(zhì)層裸露,軟腐的表皮褶皺狀塌陷,白色菌絲轉(zhuǎn)色為綠色粉狀霉層(圖1b、c、d),嗅之有悶人的芳香,無(wú)惡臭味,很快全蛋腐爛、干癟,中重度感病菌蛋將無(wú)法發(fā)育為成熟的子實(shí)體,影響冬蓀產(chǎn)量和質(zhì)量,嚴(yán)重時(shí)甚至絕收。

    2.2 致病性測(cè)定結(jié)果3個(gè)菌株接種3 d后,處理組均觀察到白霉?fàn)罹z,明顯的表皮軟腐癥狀與野外發(fā)病癥狀相一致,7 d后出現(xiàn)淺綠色菌落(圖1 h),對(duì)照組無(wú)感病癥狀,再分離發(fā)病組病原與接種病原形態(tài)特征一致,完成柯赫氏法則驗(yàn)證。

    2.3 冬蓀綠霉病病原形態(tài)鑒定結(jié)果3個(gè)致病菌株在PDA平板上生長(zhǎng)迅速,菌絲稀疏棉絮狀,白色,中心淺黃色,背面淺灰黃色;菌絲無(wú)隔;分生孢子梗從菌絲交錯(cuò)生出,直立單生,具有明顯的頸部,多數(shù)向上彎曲,長(zhǎng)(4.0-)4.2~5.6(-5.9)μm,最寬(2.9-)3.1~3.8(-4.3)μm,底部寬(1.7-)2.1~2.7(-3.1)μm(n=50,圖1f);分生孢子光滑、寬橢圓形,大小為(2.7-)3~3.3(-3.6)× 2.2~2.7 μm(n=50,圖1g),病原形態(tài)特征與絨毛木霉T.tomentosum一致[17-19]。

    注:a.無(wú)癥狀的冬蓀子實(shí)體和菌蛋,b、c、d.感病菌蛋軟腐、綠霉和開(kāi)裂癥狀,e.絨毛木霉在PDA平板生長(zhǎng)5 d后菌落正面和背面,f.分生孢子梗結(jié)構(gòu),g.分生孢子,h.病原GZDS1101接種7 d后發(fā)病癥狀。Note:a.Asymptomatic mature fruit body and immature “egg” of stinkhorn,b,c,d.Symptoms of rot,green mold and cracking on immature “egg”,respectively,e.T.tomentosum on PDA medium 5 days(front and back),f.Conidiophore,g.Conidia,h.Symptoms at seven days after inoculation,pathogenic bacteria GZDS1101 in the treatment(GZDS1101).圖1 冬蓀綠霉病Fig.1 Green mold of P.dongsun

    2.4 冬蓀綠霉病病原分子鑒定結(jié)果根據(jù)NCBI-BLAST和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析,3個(gè)菌株為同種,ITS基因與T.tomentosum(KX343119.1、KX343120.1、KX343120.1等)、T.cerinum(KP009282.1、KP009288.1)2個(gè)種同源性>98%,與其他種同源性<97%(圖2),初步確認(rèn)為木霉屬Trichoderma;tef1和rpb2基因與T.tomentosum(CBS 120637,S23,S33,等;圖3、圖4)同源性均為99%~100%,與其他種<96%,種水平將3株病原鑒定為絨毛木霉T.tomentosum[14]。

    圖2 基于rDNA-ITS序列的病原菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.2 The phylogenetic tree of pathogens based on rDNA-ITS sequence

    圖3 基于tef1序列的病原菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.3 The phylogenetic tree of pathogens based on tef1 sequence

    圖4 基于rpb2序列的病原菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.4 The phylogenetic tree of pathogens based on rpb2 sequence

    2.5 防治冬蓀綠霉病藥劑篩選結(jié)果4種供試藥劑對(duì)病原菌生長(zhǎng)均有一定的抑制效果,但敏感性存在顯著差異(表1)。苯醚甲環(huán)唑抑菌作用最強(qiáng),EC50為1.93 mg/L;其次是吡唑醚菌酯,EC50為4.02 mg/L,咪鮮胺錳鹽EC50為4.96 mg/L,而唑菌酯敏感性較低,EC50為23.89 mg/L。

    表1 不同殺菌劑對(duì)病原菌絲生長(zhǎng)抑制情況

    選用咪鮮胺錳鹽(食用菌合法登記)與敏感性最強(qiáng)的苯醚甲環(huán)唑進(jìn)行混配試驗(yàn),結(jié)果顯示不同比例混配抑菌效果差異顯著。咪鮮胺錳鹽與苯醚甲環(huán)唑的質(zhì)量比為1∶2時(shí)CTC>120,為150.88,表現(xiàn)增效作用,增效顯著。質(zhì)量比為1∶1和1∶4 時(shí),CTC值分別為104.25和117.56,為相加作用,其他混配質(zhì)量比的CTC值均<80,在試驗(yàn)中表現(xiàn)一定的拮抗作用(表2)。

    表2 咪鮮胺錳鹽與苯醚甲環(huán)唑混配抑菌效果

    3 討論

    該研究對(duì)采自貴州省大方和織金2縣的冬蓀綠霉病進(jìn)行病原分離、致病性測(cè)定及鑒定發(fā)現(xiàn),病原菌株具有較強(qiáng)的致病性,經(jīng)形態(tài)和多基因分子生物學(xué)鑒定為絨毛木霉T.tomentosum。采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定4種殺菌劑原藥對(duì)病原菌的毒力,結(jié)果表明,病原菌對(duì)4種藥劑均有一定的敏感性,其中苯醚甲環(huán)唑抑菌作用最強(qiáng),EC50為1.93 mg/L;其次是吡唑醚菌酯和咪鮮胺錳鹽也較敏感,EC50分別為4.02和4.96 mg/L,而唑菌酯敏感性相對(duì)較低,EC50為23.89 mg/L。咪鮮胺錳鹽與苯醚甲環(huán)唑混質(zhì)量比為1∶2時(shí),EC50為2.18 mg/L,CTC值為150.88,大于120,表現(xiàn)增效作用,在該試驗(yàn)中抑菌效果最強(qiáng),質(zhì)量比為1∶1和1∶4時(shí),為相加作用,其他混配質(zhì)量比表現(xiàn)一定的拮抗作用。

    目前,關(guān)于冬蓀的研究主要在中國(guó),并集中在種源選育、栽培技術(shù)和產(chǎn)品加工等方面,關(guān)于病害的研究極少,隨著貴州地區(qū)規(guī)模化種植及食用菌連作障礙的影響,冬蓀病害日益嚴(yán)重,該研究的冬蓀綠霉病一般在低海拔(800 m以下)區(qū)域的高溫天氣(28 ℃以上)大發(fā)生,傳播速度較快,具有較強(qiáng)的傳染性,尤其是蚊蟲(chóng)叮咬或受傷的冬蓀菌蛋上發(fā)病率更高,傷口有助于病原菌入侵定殖,該病害已成為制約該地區(qū)冬蓀產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一,該研究鑒定冬蓀綠霉病病原為絨毛木霉,該菌在有益和有害菌方面均少有記載,急需科學(xué)的防控策略和方法。

    在藥劑篩選試驗(yàn)中,僅咪鮮胺錳鹽為已登記的食用菌可用藥,在供試藥劑中單劑藥效中等;而苯醚甲環(huán)唑單劑作用效果最佳,將二者進(jìn)行混配測(cè)試,結(jié)果顯示二者并不是簡(jiǎn)單的相加增效作用,當(dāng)咪:苯為1∶2時(shí)增效最顯著,不合適的混配甚至出現(xiàn)一定的拮抗作用,通過(guò)藥劑混配,不僅能提升協(xié)同增效殺菌譜,還能延緩病原菌抗藥性產(chǎn)生,提升藥劑適用期限。藥劑篩選結(jié)果表明,4種供試藥劑對(duì)病原菌均有較強(qiáng)的抑制作用,該結(jié)果可為冬蓀綠霉病的田間藥劑防治提供一定的理論依據(jù)。

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