高良姜的化學成分及抗腫瘤活性研究

歐虹雅，屈慧娟，周小妹，張 迎，張海瑩，靳德軍，魏 娜

（海南醫(yī)學院藥學院，海南 海口 571199）

中藥高良姜是姜科植物高良姜（Alpinia officinarumhance）的干燥根莖，味辛性熱，具有散寒止嘔、溫胃止痛的功效，臨床上廣泛用于脘腹冷痛、胃寒嘔吐、噯氣吞酸等癥［1］。目前主要產(chǎn)地在廣東、海南等地，其中道地性產(chǎn)地為廣東徐聞縣［2］。高良姜的化學成分有黃酮類、二芳基庚烷類、苯丙素類、糖苷類和揮發(fā)油等多種成分，其中黃酮類和二芳基庚烷類是高良姜主要活性成分［3-7］?，F(xiàn)代藥理研究表明高良姜具有抗炎、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗菌等藥理作用，黃酮類成分在抗炎、抗菌、抗氧化方面具有良好的活性，而二芳基庚烷類成分在鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等方面具有良好的活性［8-13］。

課題組前期進行了高良姜有效部位和有效組分的分離，得到了黃酮組分和二芳基庚烷組分，并進行了黃酮組分和二芳基庚烷組分的藥效學研究，明確了高良姜黃酮組分和二芳基庚烷組分具有抗胃黏膜損傷的作用［14，15］。本文研究高良姜中黃酮組分和二芳基庚烷組分的化學成分及其單體化合物的活性，為高良姜有效利用與進一步開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

高良姜藥材購自廣東徐聞，經(jīng)海南醫(yī)學院生藥學教研室田建平教授鑒定為姜科山姜屬植物高良姜（Alpinia officinarum hance）的干燥根莖。憑證標本（No.AOH-20140228）存放于海南醫(yī)學院天然藥物化學實驗室。

1.2 方法

1.2.1 提取分離

取高良姜總庚烷組分用制備薄層法分離（圖1），將其以二氯甲烷溶解，以環(huán)己烷：二氯甲烷：甲醇（6∶2.5∶1.5）為展開劑，展開后刮下熒光色帶，合并Rf 值相同色帶，共得5 個組分Fr.1～Fr.5。接著用半制備HPLC 純化Fr.1～Fr.5，以75%甲醇洗脫，得到化合物1～6。

圖1 總庚烷分離純化流程圖Fig 1 Flow chart of separation and purification of total heptane

取高良姜總黃酮組分用硅膠柱色譜分離（圖2），用石油醚-乙酸乙酯（30∶1～5∶1）梯度洗脫，共得到3個粗分組分Fr.1～Fr.3，F(xiàn)r.1 利用硅膠柱色譜分離，以石油醚-二氯甲烷（1∶2）起梯度洗脫，得到Fr.1.1后用半制備HPLC 純化得到化合物7，F(xiàn)r.2 利用硅膠柱色譜進行分離以石油醚-二氯甲烷（1∶2）起梯度洗脫，后用甲醇洗脫，得到化合物8，F(xiàn)r.3 利用硅膠柱色譜分離，以石油醚-二氯甲烷（1∶1、1∶10、1∶40、0∶1）洗脫，再用半制備HPLC 純化得到化合物9。

圖2 總黃酮分離純化流程圖Fig 2 Flow chart of separation and purification of total flavonoids

1.2.2 細胞毒活性篩選

1.2.2.1 藥物配制 將所分離純化得到的單體化合物用DMSO 溶解，然后加入培養(yǎng)基稀釋至濃度為100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56 μmol/L，陽性藥為姜黃素通過培養(yǎng)基稀釋至25 μmol/L。

1.2.2.2 細胞毒活性測試 取生長狀態(tài)良好的MDA-MB-231（乳腺癌）、HepG-2（肝癌）、MKN-45（胃癌）細胞，胰酶消化后，接種于96 孔板中，密度為5 000 個/孔，培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，實驗組加入不同濃度的藥物，陽性對照組加姜黃素25 μmol/L，同時設(shè)空白組和對照組，每組6 個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄去舊培養(yǎng)基，加入10% 的CCK-8，孵育30 min，酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm 處測量各個孔的吸光度，每組實驗重復3 次。抑制率%=1-（A 給藥-A 空白）/（A 對照-A 空白），根據(jù)A 值計算半數(shù)抑制濃度（median inhibitory concentration， IC50）。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

根據(jù)理化性質(zhì)和核磁進行結(jié)構(gòu)鑒定，從高良姜總庚烷組分中分離得到6 個二芳基庚烷（化合物1～6），從總黃酮中分離得到3 個黃酮（化合物7～9），其結(jié)構(gòu)如圖3 所示。

化合物1（圖3 中1）：淡黃色油狀物，共分離得到124.2 mg。1H-NMR（CDCl3，400 MHz），δH：7.16～7.30（5H， m， H-2’至6’芳環(huán)上未取代H），6.66～6.83（3H， m， H-2’’， 5’’， 6’’），5.66（1H，s， 4’’-OH ），4.02～4.08（1H， m， H-5），3.86（3H，s， 3’’-OCH3），2.54～2.91（8H， m， H-1， 2， 4， 7），1.63～1.82（2H， m， H-6）；13C-NMR（CDCl3，100 MHz），δc：211.35（C-3），146.57（C-3’’），143.84（C-4’’），140.77（C-1’’），133.82（C-1’’），128.68（C-3’， C-5’），128.39（C-2’， C-6’），126.35（C-4’），121.02（C-6’’），114.44（C-5’’），111.23（C-2’’），66.99（C-5’），55.98（3’’-OCH3），49.38（C-4），45.12（C-2），38.46（C-6），31.52（C-1），29.58（C-7）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的基本一致［16］，故鑒定化合物1 為5-hydroxy-7-（4-hydroxy-3-methoxyphenyl）-1-phen -ylheptan-3-one（DPHA）。

化合物2（圖3 中2）：淡黃色油狀物，共分離得到289.4 mg。1H-NMR（CDCl3，400 MHz），δH：7.17～7.25（5H， m， H-2’至6’芳環(huán)上未取代H），6.87（1H， dt，J=16.0，6.8 Hz， H-5），6.75（1H， d，J=1.92 Hz， H-2’’），6.65（1H， d，J=7.9 Hz，H-5’’），6.56（1H， dd，J=1.9， 7.96 Hz， H-6’’），6.10（1H， d，J=16.0 Hz， H-4），3.71（1H， s，-OCH3），2.78～2.85（4H， m， H-1， 2），2.60～2.63（2H， m， H-7），2.48～2.49（2H， m， H-6）；13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δc：30.01（C-1），33.79（C-7），34.43（C-6），41.25（C-2），56.07（-OCH3），113.10（C-2’’），115.85（C-5’’），120.94（C-6’’），126.40（C-4’），128.82（C-2’， C-6’），128.85（C-3’， C-5’），130.83（C-4），132.20（C-1’’），141.78（C-1’，C-4’’），145.25（C-4’’），147.60（C-5），147.96（C-3’’），199.53（C-3）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致［17］，故鑒定化合物2 為（E）-7-（4-hydroxy-3-methoxyphenyl）-1-phenylhept-4-en-3-one（DPHB）。

化合物3（圖3 中3），白色粉末，共分離得到226.4 mg。1H-NMR（CDCl3，400 MHz），δH：7.13～7.31（10H， m， 苯環(huán)H），4.03～4.09（1H， m， H-5），2.74～2.93（8H， m，H-1， 2， 4， 7），1.65～1.85（2H，m， H-6）；13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δc：211.29（C-3）， 141.92（C-1’），140.78（C-1’’），128.69（C-3’， 5’），128.59（C-3’’， 5’’）， 128.55（C-2’’，6’’）， 128.40（C-2’， 6’），126.36（C-4’），126.01（C-4’’），66.97（C-5），49.39（C-4），45.13（C-2），38.14（C-6），31.85（C-1），29.60（C-7）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致［18］，故鑒定化合物3（圖1 中3）為5-hydroxy-1，7-diphenylheptan-3-one（DPHC）。

化合物4（圖3 中4）：棕黃色油狀物，共分離得到22.1 mg。1H-NMR（CDCl3，400 MHz），δH：7.09～7.22（5H， m， 苯環(huán)H-2’至6’），6.93（2H， d，J=7.6 Hz， H-2’’， 6’’），6.65（2H， d，J=7.6 Hz， H-3’’，5’’），3.60（1H， m， H-5），3.22（1H， s， -OCH3），2.46～2.80（8H， m， H-1， 2， 4， 7），1.62～1.72（2H，m， H-6）；13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δc：211.07（C-3），156.46（C-4’’），142.50（C-1’），133.93（C-1’’），116.14（C-3’’， 5’’），130.27（C-2’’，6’’），129.43（C-3’， 5’），129.41（C-2’， 6’），127.02（C-4’），77.92（C-5），48.10（C-4），45.97（C-2），37.02（C-6），31.38（C-7），30.53（C-1），57.06（-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致［19］，故鑒定化合物4 為7-（4-hydroxyphenyl）-5-methoxy-1-pheny-lheptan-3-one。

圖3 化合物1～9 化學結(jié)構(gòu)Fig 3 Chemical structures of compounds 1～9

化合物5（圖3 中5）：深黃色油狀物，共分離得 到205.3 mg。1H-NMR（CDCl3，400 MHz），δH：7.19～7.32（苯環(huán)H-2’至6’），7.02（2H， d，J=8.8 Hz， H-2’’， 6’’），6.90（1H， m， H-5），6.82（2H，m， H-3’’， 5’’），2.86～2.97（4H， m， H-1， 2），2.67～2.71（2H， m， H-7），2.46～2.52（2H， m，H-6）；13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δc：200.99（C-3），154.63（C-4’’），141.15（C-1’），132.40（C-1’’），115.62（C-3’’， 5’’），129.53 （C-2’’，6’’），128.66（C-3’， 5’），128.52（C-2’， 6’），126.30（C-4’），147.89（C-5），130.65（C-4），41.74（C-2），34.65（C-6），33.59（C-7），30.31（C-1）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致［20］，故鑒定化合物5為（E）-7-（4-hydroxyphenyl）-1-phenylhept-4-en-3-one。

化合物6（圖3 中6）：黃色油狀物，共分離得到 9.4 mg。1H-NMR（CDCl3，400 MHz），δH：7.16～7.30（10H， m， 苯 環(huán)H），6.84（1H， dt，J=6.8， 15.92 Hz， H-5’’），6.11（1H， d，J=16.0 Hz， H-4），2.84～2.93（4H， m， H-1， 2），2.75～2.78（2H， m， H-7），2.52～2.56（2H， m， H-6）；13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δc：199.63（C-3），146.46（C-5），141.32（C-1’），140.76（C-1’’），130.79（C-4），128.61（C-3’， 5’），128.57（C-2’，6’），128.45（C-3’’， 5’’），128.42（C-2’’， 6’’），126.32（C-4’），126.18（C-4’’），41.79（C-2），34.48（C-7），34.23（C-6），30.17（C-1）。以上數(shù)據(jù)與文獻 報 道 基 本 一 致［21］，故 鑒 定 化 合 物6 為（E）-1，7-diphenylhept-4-en-3-one。

化合物7（圖3 中7）：無色針狀結(jié)晶，共分離得 到200 mg。1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz），δH：7.31～7.47（5H， m， H-2’- 6’），12.09（1H， s，5-OH），10.86（1H， s， 7-OH），5.58（1H， s， H-6），5.88（1H， s， H-8），5.51～5.54（1H， dd，J=17.3，3.28 Hz， H-3）；13C-NMR（DMSO-d6， 100 MHz）δc：78.91（C-2），42.63（C-3），196.46（C-4），163.25（C-5），96.50（C-6），166.40（C-7），95.61（C-8），164.04（C-9），102.28（C-10），139.23（C-1’），127.15（C-2’， 6’），129.08（C-3’， 4’， 5’）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致［22］，故鑒定化合物7 為pinocembrin。

化合物8（圖3 中8）：黃色針狀結(jié)晶，共分離得 到278 mg。1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz），δH：7.42～7.52（3H， m， H-3’， 4’， 5’），8.10（2H，d，J=7.7 Hz， H-2’， 6’），9.65（1H， s， 3-OH），12.32（1H， s， 5-OH），10.83（1H， s， 7-OH），6.16（1H， s， H-6），6.42（1H， s， H-8）；13C-NMR（DMSO-d6， 100 MHz）δc：146.25（C-2），137.66（C-3），176.83（C-4），161.30（C-5），98.86（C-6），164.77（C-7），94.12（C-8），156.95（C-9），103.76（C-10），131.49（C-1’），129.07（C-2’，6’），128.09（C-3’，5’），130.49（C-4’）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致［23］，故鑒定化合物8 為 galangin。

化合物9（圖3 中9）：黃色粉末，共分離得到5.6 mg。1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz），δH：7.53（3H， m， H-3’， 4’， 5’），7.96（2H， m， H-2’，6’），12.52（1H， s， 5-OH），10.88（1H， s， 7-OH），6.18（1H， s， H-6），6.41（1H， s， H-8），3.75（3H，s， 3-OCH3）；13C-NMR（DMSO-d6， 100 MHz）δc：60.56（3-OCH3），155.75（C-2），139.32（C-3），178.68（C-4），161.83（C-5），99.26（C-6），164.94（C-7），94.38（C-8），157.14（C-9），105.01（C-10），130.59（C-1’），128.72（C-2’， 6’），129.28（C-3’，5’），131.59（C-4’）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致［24］，故鑒定化合物9 為 3-O- methylgalangin。

2.2 體外抗腫瘤活性

從表1 可以看出，化合物2、化合物 3、化合物5 、化 合 物6 和 化 合 物 7 對MDA-MB-231 細 胞 具有微弱的細胞毒活性，化合物2、化合物 5 、化合物7 和化合物8 對HepG-2 細胞具有微弱的細胞毒活性，化合物2 和化合物 6 對MKN-45 細胞具有微弱的細胞毒活性。

表1 化合物1～9 的細胞毒活性IC50（μmol/L）Tab 1 Cytotoxicity IC50（μmol/L） of compounds 1～9（μmol/L）

3 討論

高良姜有抗炎、抗氧化、抗腫瘤的作用，現(xiàn)代臨床常用于胃炎、胃潰瘍、胃癌等疾病的治療，具有良好的開發(fā)和應用前景［25，26］。本實驗通過色譜方法結(jié)合波譜法，從高良姜二芳基庚烷組分和黃酮組分分離得到了9 個化合物，通過CCK-8 法考察了所有化合物對腫瘤細胞的體外抑制活性，本研究結(jié)果顯示高良姜具有潛在的抗腫瘤活性。

在高良姜黃酮類化合物中高良姜素（化合物8）對HepG-2（肝癌細胞）具有細胞毒活性，IC50值為（20.08±5.60） μmol/L，同時相關(guān)研究表明高良姜素（化合物8）可通過上調(diào)肝癌細胞（HepG-2）中的p53 表達，引起細胞凋亡的原因可能是自噬而與凋亡無關(guān)［27，28］。相關(guān)研究還顯示高良姜素在體內(nèi)外可抑制胃癌（MGC-803）細胞的生長，其作用機制可能是 通 過 抑 制NF-κB 通 路 和 增 強 自 噬 而 實 現(xiàn) 的［29］。但本研究中高良姜素對胃癌細胞（MKN-45）沒有表現(xiàn)出明顯的細胞毒活性，可能原因是胃癌細胞株不同。

高良姜中的二芳基庚烷類化合物對肝癌、乳腺癌、胃癌細胞具有細胞毒性［22，30］，本研究結(jié)果顯示（E）-1，7-diphenylhept-4-en-3-one（化合物6）對乳腺癌細胞（MDA-MB-231）和胃癌細胞（MKN-45）具有細 胞 毒 活 性，IC50 值 分 別 為（16.65±0.02）、（33.40±0.34） μmol/L，相 關(guān) 研 究［22］顯 示（E）-1，7-diphenylhept-4-en-3-one（化合物6）對乳腺癌細胞（MCF-7）和胃癌細胞（SGC-7901）的細胞毒活性強，IC50值分別為26.13，23.36 μM，與本文研究結(jié)果相似。

總的來說，二芳基庚烷類化合物比黃酮類化合物的細胞毒活性強，黃酮類化合物中增強細胞毒活性的重要基團是C-3 位的羥基，二芳基庚烷類化合物中C-3 位的羰基和C-4 位的雙鍵是影響細胞毒活性的重要基團。

綜上，根據(jù)本文研究顯示高良姜在抗腫瘤方面具有潛在的應用前景，但本文未對每種腫瘤細胞進行多種細胞系進行研究，這是本文的不足之處以及下一步需要進行的工作，下一步需要進行的工作還包括對活性單體化合物6、化合物8 的抗腫瘤機制研究。

作者貢獻度說明：

歐虹雅承擔本文細胞活性及文章撰寫工作；屈慧娟、周小妹、張迎承擔本文化合物分離工作；張?，撠撠煴疚捏w外細胞實驗指導；靳德軍負責本文化學成分實驗指導；魏娜負責本文實驗指導及本文寫作指導等工作。所有作者對稿件的編輯做出了貢獻，并就最終內(nèi)容達成了一致。

所有作者聲明不存在利益沖突。