巖黃連栓微生物限度檢查方法的適用性試驗(yàn)

龐云娟, 龐蘭英, 曾 金, 劉康連, 梁曉玲, 龍文洲, 肖 萍

（1.玉林市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心/玉林市中藥材（含香辛料）質(zhì)量監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心, 廣西 玉林 537000；2.柳州市婦幼保健院, 廣西 柳州 545001）

巖黃連栓是柳州市婦幼保健院的制劑方, 具有抗炎、鎮(zhèn)痛等作用[1］, 常用于慢性盆腔炎的治療[2］, 為慢性盆腔炎治療提供中醫(yī)藥的診療方案。巖黃連栓的主藥成分是巖黃連（Corydalis saxicolaBunting）提取物, 巖黃連為罌粟科紫堇屬植物石生黃堇的全草及肥大的根莖部, 是廣西壯族自治區(qū)重要的特色壯藥材之一[3, 4］。巖黃連全草性苦、涼, 其活性成分為巖黃連總生物堿[5］, 具有抗菌、消炎、止痛、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫功能等作用[6］。巖黃連栓的輔料組成是混合脂肪酸甘油酯（38 M）[7］（熔點(diǎn)在35～37 ℃）、混合脂肪酸甘油酯（38H）[8］（熔點(diǎn)在37～39 ℃）、羊毛脂[9］（熔點(diǎn)在36～42 ℃）、液體石蠟、吐溫-80。巖黃連栓是不含藥材原粉的半固體直腸給藥制劑, 其微生物限度標(biāo)準(zhǔn)為需氧菌總數(shù)103CFU/g、霉菌和酵母菌總數(shù)102CFU/g、不得檢出金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌（1 g）[10］。

本研究結(jié)合巖黃連提取物的抑菌作用[11, 12］、輔料熔點(diǎn)影響溶解的問(wèn)題以及其微生物限度的規(guī)定, 按照《中國(guó)藥典》2020 年版的要求, 優(yōu)選出科學(xué)、合理、便于操作的微生物限度檢查方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003］、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001］、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104］、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501］、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003］, 均從廣東環(huán)凱微生物科技有限公司購(gòu)買西林瓶?jī)龈煞劬N, 按照菌種說(shuō)明書(shū)進(jìn)行復(fù)活傳代并制備成甘油凍存管在超低溫冰箱保存（第2代）。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（Trypticase soy broth, TSB）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（Sabouraud dextrose broth, SDB）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（Soybean-casecin digest agar, TSA）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Sabouraud dextrose agar, SDA）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（Mannitol salt agar）、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基基礎(chǔ)（Cetrimide agar medium base）, 均為北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)；氯化鈉（分析純）, 丙三醇（分析純）, 均為廣東光華科技股份有限公司生產(chǎn)；吐溫-80（分析純）, 為天津市大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。

1.3 儀器

LRH-150-M 型霉菌培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）, SPX-150F-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱（上海龍躍儀器有限公司）, BHC-1300HA2 型生物安全柜（蘇州安春游空氣技術(shù)有限公司）, SQ810C 型立式壓力蒸汽滅菌器（雅馬拓科技貿(mào)易有限公司）, EK-1200i 型電子天平（日本島津公司）, SHZ-88 型水浴恒溫振蕩器（江蘇金怡儀器科技有限公司）, 微生物培養(yǎng)箱（德國(guó)賓得公司）, HTY-310 型微生物檢驗(yàn)儀（浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司）, S25 型圓周振蕩器（德國(guó)IKA公司）, Easypet 3 電動(dòng)助吸器、移液器（德國(guó)Eppendorf公司）等。

1.4 試驗(yàn)樣品

巖黃連栓（批號(hào)：20020701、20020702、20020703、20060301、20060302、20060303、200712, 柳州市婦幼保健院）。常溫下為半固體直腸栓劑, 其中批號(hào)20020701、20020702、20020703 是2020 年2 月7 日生產(chǎn), 批號(hào)20060301、20060302、20060303 是2020 年6月3 日生產(chǎn), 批號(hào)200712 是2020 年7 月12 日生產(chǎn)。

1.5 方法

1.5.1 菌懸液的制備 按照《中國(guó)藥典》2020 年版四部關(guān)于菌種的培養(yǎng)制備要求[10］, 并參考菌懸液制備方法進(jìn)行制備[13］, 從超低溫冰箱取出甘油凍存管菌種解凍至室溫, 分別取200 μL 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的甘油凍存管菌液接種至10 mL TSB 肉湯試管, 33 ℃振搖培養(yǎng)24 h；取200 μL 白色念珠菌的甘油凍存管菌液接種至10 mL SDB 肉湯試管, 23 ℃振搖培養(yǎng)48 h；取1 000 μL 黑曲霉的甘油凍存管菌液接種至200 mL SDA 瓊脂大斜面, 23 ℃培養(yǎng)7 d, 用5 mL 滅菌生理鹽水洗下孢子, 吸出孢子懸液至無(wú)菌試管[14］。將上述肉湯試管和黑曲霉孢子菌懸液試管放置2～8 ℃保存, 作為工作用菌液, 試驗(yàn)前逐級(jí)稀釋計(jì)數(shù)。

1.5.2 供試液的制備 供試品溶液的制備[15, 16］：取樣品10 g, 加至90 mL 稀釋液中, 置45 ℃水浴振搖15 min, 作為1:10 的供試液。用稀釋液依次稀釋成1:20、1:50、1:100、1:200 的供試液, 并置于45 ℃?zhèn)溆谩Ｏ♂屢汉蜎_洗液：0.9%氯化鈉溶液（即滅菌生理鹽水）, 置于45 ℃保溫備用。

1.5.3 微生物計(jì)數(shù)法的適用性試驗(yàn)

1）平皿傾注法預(yù)試驗(yàn)。

①試驗(yàn)組[17］：取已滅菌的試管, 每管分別分裝10 mL 1:10、1:20、1:50、1:100、1:200 的供試液, 分別加入0.1 mL 的金黃色葡萄球菌菌懸液（含菌量不超過(guò)10 000 CFU/mL）或白色念珠菌菌懸液（含菌量不超過(guò)10 000 CFU/mL）, 充分搖勻, 平行注2 皿, 并澆注相應(yīng)的培養(yǎng)基。

②菌液組[18］：取已滅菌的試管, 每管分裝10 mL滅菌生理鹽水, 加入0.1 mL 的金黃色葡萄球菌菌懸液（含菌量不超過(guò)10 000 CFU/mL）或白色念珠菌菌懸液（含菌量不超過(guò)10 000 CFU/mL）, 充分搖勻, 平行注2 皿, 并澆注相應(yīng)的培養(yǎng)基。

③供試品對(duì)照組：除不加入菌液, 操作同試驗(yàn)組。

2）薄膜過(guò)濾貼膜法預(yù)試驗(yàn)。

①試驗(yàn)組[19］：取已滅菌的薄膜過(guò)濾器, 每個(gè)濾器先加入20 mL 保溫的稀釋液潤(rùn)濕濾膜[20, 21］, 分別加入1 mL 1:100 供試液, 再分別加入1 mL 金黃色葡萄球菌菌懸液（含菌量不超過(guò)100 CFU/mL）, 抽濾, 濾干后, 取膜貼種于提前準(zhǔn)備好的瓊脂培養(yǎng)基平板。

②菌液組：取已滅菌的薄膜過(guò)濾器, 每個(gè)濾器先加入20 mL 保溫的稀釋液潤(rùn)濕濾膜, 分別加入1 mL稀釋液, 再分別加入1 mL 金黃色葡萄球菌菌懸液（含菌量不超過(guò)100 CFU/mL）, 抽濾, 濾干后, 取膜貼種于提前準(zhǔn)備好的瓊脂培養(yǎng)基平板。

③供試品對(duì)照組：除不加入菌液, 操作同試驗(yàn)組。

需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）, 霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）。胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）于33 ℃培養(yǎng), 其中枯草芽孢桿菌試驗(yàn)組、薄膜過(guò)濾貼膜的銅綠假單胞菌試驗(yàn)組培養(yǎng)18～24 h, 黑曲霉試驗(yàn)組培養(yǎng)3 d, 白色念珠菌試驗(yàn)組培養(yǎng)3～5 d, 其他細(xì)菌試驗(yàn)組培養(yǎng)不超過(guò)3 d；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）于23 ℃培養(yǎng), 其中黑曲霉試驗(yàn)組培養(yǎng)3 d, 白色念珠菌試驗(yàn)組培養(yǎng)5 d[22］。

結(jié)果判斷：試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組的值與菌液對(duì)照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.5～2.0 范圍內(nèi)[23, 24］。

1.5.4 控制菌檢查方法的適用性試驗(yàn)

1）金黃色葡萄球菌檢查預(yù)試驗(yàn)。分別取1:10供試液10 mL 分別接種至100、200、500、1 000 mL TSB 培養(yǎng)基中, 加入不大于100 CFU 的金黃色葡萄球菌, 33 ℃培養(yǎng)18～24 h, 劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板, 33 ℃培養(yǎng)18～72 h, 觀察平板的菌落形態(tài)[25, 26］。

2）銅綠假單胞菌檢查預(yù)試驗(yàn)。分別取1:10 供試液10 mL 分別接種至100、200 mL TSB 培養(yǎng)基中, 加入不大于100 CFU 的銅綠假單胞菌, 33 ℃培養(yǎng)18～24 h, 劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板, 33 ℃培養(yǎng)18～72 h, 觀察平板的菌落形態(tài)[27-29］。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物計(jì)數(shù)法的適用性試驗(yàn)

2.1.1 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法預(yù)試驗(yàn)結(jié)果 平皿傾注法加金黃色葡萄球菌預(yù)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1, 薄膜過(guò)濾貼膜法加金黃色葡萄球菌預(yù)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。巖黃連栓對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑制作用, 1:200供試品溶液稀釋平皿傾注法、1:100 供試品溶液稀釋薄膜過(guò)濾貼膜法能夠消除供試品溶液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用。由于受樣品處方組分的影響, 薄膜過(guò)濾貼膜法的沖洗液要維持在40～45 ℃才能確保不堵膜, 需要較長(zhǎng)的保溫空間, 采用1:200 供試品溶液稀釋平皿傾注法, 操作更為簡(jiǎn)單方便。

表1 平皿傾注法加金黃色葡萄球菌回收預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

表2 薄膜過(guò)濾貼膜法加金黃色葡萄球菌回收預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

2.1.2 霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法試驗(yàn)結(jié)果 平皿傾注法加白色念珠菌預(yù)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。1:10 供試液試驗(yàn)組中白色念珠菌回收比值在0.5～2.0 范圍內(nèi), 表明巖黃連栓對(duì)白色念珠菌沒(méi)有抑制作用, 采用該方法進(jìn)行霉菌及酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)是可行的。

表3 平皿傾注法加白色念珠菌回收預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

2.2 控制菌檢查方法的試驗(yàn)結(jié)果

各試驗(yàn)組分別在甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線分離培養(yǎng), 結(jié)果見(jiàn)表4。巖黃連栓對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑菌作用, 采用1 000 mL 增菌液接種法檢查巖黃連栓中的金黃色葡萄球菌, 采用100 mL 增菌液接種法檢查巖黃連栓的銅綠假單胞菌是可行的。

表4 控制菌檢查預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

2.3 微生物計(jì)數(shù)法適用性試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

取7 個(gè)批號(hào)的巖黃連栓樣品, 需氧菌總數(shù)按1:200 供試品溶液稀釋平皿傾注法、霉菌及酵母菌總數(shù)按常規(guī)1:10 平皿傾注法進(jìn)行加菌回收試驗(yàn), 結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明, 采用1:200 供試品溶液稀釋平皿傾注法對(duì)巖黃連栓進(jìn)行需氧菌總數(shù)的測(cè)定, 5 種試驗(yàn)菌回收比值均在0.5～2.0 范圍內(nèi)；采用常規(guī)1:10平皿傾注法對(duì)霉菌及酵母菌總數(shù)進(jìn)行測(cè)定, 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）規(guī)定的2 種試驗(yàn)菌回收比值均在0.5～2.0 范圍內(nèi), 均符合《中國(guó)藥典》2020 年版四部1105（非無(wú)菌產(chǎn)品微生物：微生物計(jì)數(shù)法）的規(guī)定, 該方法可行。

表5 微生物計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證試驗(yàn)的回收比值

2.4 控制菌檢查方法的驗(yàn)證

取7 個(gè)批號(hào)的巖黃連栓樣品, 金黃色葡萄球菌按照1 000 mL 增菌液接種法進(jìn)行加菌驗(yàn)證試驗(yàn)、銅綠假單胞菌按照100 mL 增菌液接種法進(jìn)行加菌驗(yàn)證試驗(yàn), 結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果表明, 采用1 000 mL 增菌液接種法對(duì)巖黃連栓的金黃色葡萄球菌的測(cè)定進(jìn)行加菌驗(yàn)證試驗(yàn), 采用100 mL 增菌液接種對(duì)巖黃連栓的銅綠假單胞菌的測(cè)定進(jìn)行加菌驗(yàn)證試驗(yàn), 符合《中國(guó)藥典》2020 年版四部1106（非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法）的有關(guān)規(guī)定, 該方法可行。

表6 巖黃連栓控制菌檢查方法驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.5 巖黃連栓的微生物限度檢查結(jié)果

采用1:200 供試品溶液稀釋平皿傾注法進(jìn)行需氧菌總數(shù)測(cè)定, 采用常規(guī)1:10 平皿傾注法對(duì)霉菌及酵母菌總數(shù)進(jìn)行測(cè)定, 采用1 000 mL 增菌液接種法檢查金黃色葡萄球菌, 采用100 mL 增菌液接種法檢查銅綠假單胞菌, 結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 巖黃連栓的微生物限度檢查結(jié)果

3 小結(jié)與討論

本研究建立的巖黃連栓微生物限度檢查方法科學(xué)有效、操作方便, 為有抑菌作用且部分處方組分的熔點(diǎn)在35～42 ℃的栓劑提供供試品溶液制備和適用性試驗(yàn)的方法參考。本研究對(duì)7 個(gè)批號(hào)的巖黃連栓同步進(jìn)行金黃色葡萄球菌加菌回收預(yù)試驗(yàn)研究, 縮短整個(gè)適用性試驗(yàn)研究的時(shí)間, 提高了工作效率。巖黃連栓是醫(yī)院制劑, 醫(yī)院制劑通常產(chǎn)量較小, 批號(hào)之間有時(shí)存在一定的差異。對(duì)產(chǎn)量較小的制劑, 驗(yàn)證樣品盡量多一些批號(hào), 能較大程度避免由于批號(hào)差異導(dǎo)致的方法不適用的問(wèn)題, 通過(guò)多批次的樣品同步試驗(yàn), 提前發(fā)現(xiàn)批號(hào)差異并反饋給醫(yī)院制劑室, 助推醫(yī)院制劑工藝穩(wěn)定發(fā)展。