尖孢鐮刀菌黏團(tuán)?；挺?葡萄糖苷酶Foglu1的功能

王 騰，王碧香，李詩瑤，尉 婧，李二峰

(天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 300392)

甘藍(lán)(Brassicaoleracea)是重要的蔬菜作物，在我國蔬菜周年供應(yīng)與出口貿(mào)易中占有十分重要的地位，在我國的種植面積約90萬hm2，居世界第一位[1]。甘藍(lán)枯萎病是由尖孢鐮刀菌引起的世界性土傳病害。在中國，首先在北京延慶發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)枯萎病，此后受害面積不斷擴(kuò)大，目前在甘肅、陜西、山西和河北等地都有發(fā)生，威脅著中國北方約三分之一的夏秋季甘藍(lán)種植區(qū)[2]。在國內(nèi)隨著甘藍(lán)種植面積的增大，甘藍(lán)枯萎病已經(jīng)成為生產(chǎn)種植的一大阻力。

尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)是一種兼性寄生菌，能破壞植物的維管束，最終引起植物枯萎病或根腐病。目前國內(nèi)外研究尖孢鐮刀菌的寄主植物包括甘藍(lán)、番茄(LycopersiconesculentumMill)、甜瓜(Cucumismelo)、香蕉(MusananaLour.)、棉花(Gossypiumhirsutum)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)等[3-5]。對病原菌致病機理的研究，有助于從分子層面解釋病害發(fā)生的原因，為寄主植物病害防治找到新的思路。在對香蕉枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌古巴?；?F.oxysporumf. sp.cubense)的研究中發(fā)現(xiàn)，病原菌產(chǎn)生的毒素能加強其在侵染寄主植物時的致病能力[6]。毒素只是影響尖孢鐮刀菌對寄主致病性的眾多因素中的一種。還有研究發(fā)現(xiàn)，在引起番茄枯萎病的尖孢鐮刀菌番茄?；?F.oxysporumf. sp.lycopersici)中介導(dǎo)囊泡運輸?shù)陌邢蚧騀olvam7的缺失，導(dǎo)致病原菌營養(yǎng)生長速率減慢、分生孢子產(chǎn)量降低和致病性減弱[7]。敲除禾谷鐮刀菌(F.graminearum)Spt-Ada-Gcn5-乙酰轉(zhuǎn)移酶(SAGA)復(fù)合體中的兩個轉(zhuǎn)錄因子基因Fgspt3和Fgspt8，其突變體喪失產(chǎn)孢能力，致病力大幅降低[8]。在尖孢鐮刀菌中與致病性相關(guān)的除了毒素和致病因子外，還有細(xì)胞壁降解酶等[9]。大多數(shù)真菌纖維素酶降解纖維素是由幾種酶共同協(xié)作完成的，包括內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanases， EC 3.2.1.4，EGs)、外切葡聚糖酶(cellobiohydrolases， EC 3.2.1.91，CBHs)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase， EC 3.2.1.21， BGLs)，β-葡萄糖苷酶是纖維素降解過程中的最后一步，缺乏β-葡萄糖苷酶會導(dǎo)致纖維二糖的積累、內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶活性被抑制，從而限制纖維素的水解速度[10]。根據(jù)氨基酸序列相似性可以把β-葡萄糖苷酶分別劃分到糖苷水解酶1家族(glycoside hydrolase 1，GH1)和糖苷水解酶3家族(glycoside hydrolase 3，GH3)[11]。β-葡萄糖苷酶是生物燃料生產(chǎn)中木質(zhì)纖維素降解的必需酶類之一，因此，在各種生物技術(shù)的應(yīng)用中得到關(guān)注[12]。在對疣狀青霉菌(Penicilliumverruculosum)GH3家族一個β-葡萄糖苷酶的體外重組表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn)，該酶對纖維二糖和其他纖維寡糖顯示出高降解活性[11]。有研究表明，β-葡萄糖苷酶可以與內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶和纖維二糖水解酶協(xié)同作用，以減輕或消除纖維二糖對其他纖維素酶的抑制作用[13-14]，從而加強纖維素水解。敲除尖孢鐮刀菌番茄?；椭信c纖維素降解相關(guān)的XlnR基因后，木聚糖酶基因和纖維素基因表達(dá)量降低，木聚糖酶活性也相應(yīng)降低，但是對寄主植物的致病力卻未減弱，表明該木聚糖酶和纖維素酶對病原菌的致病力可能不具有關(guān)鍵作用[15]。然而在蘋果樹腐爛病菌(Valsamali)中發(fā)現(xiàn)，β-葡萄糖苷酶VmGlu2在降解植物細(xì)胞壁的過程中發(fā)揮作用，有助于增強病原物毒力[16]。本研究敲除引起甘藍(lán)枯萎病的尖孢鐮刀菌黏團(tuán)?；?F.oxysporumf. sp.conglutinans， FOC)中一個β-葡萄糖苷酶編碼基因Foglu1，比較并分析缺失突變體和野生型菌株、回補菌株的表型差異，初步闡明Foglu1基因在FOC生長發(fā)育與致病過程中的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株與甘藍(lán)苗

尖孢鐮刀菌黏團(tuán)?；?號生理小種(52557)；甘藍(lán)種子(中甘21)。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基、PDB培養(yǎng)基、MM培養(yǎng)基、T-TOP培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基。

藥品：Driselase購于Sigma-Aldrich 公司，HygromycinB溶液購于Roche公司，PCR純化試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、T4 DNA Ligase、氨芐青霉素(ampicillin, Amp)、PCR試劑盒、Trans 5α感受態(tài)、easytaq酶、Fastpfu酶均購自于北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司，限制性內(nèi)切酶SpeI和PstI均購自New England Biolabs公司，新霉素(NEO)購自Avantor公司。50×TAE、TEC、PEG、0.5 mol·L-1pH值8.0的乙二胺四乙酸(EDTA)，山梨醇(Sorbitol)、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)和氯化鈣(CaCl2)的混合液STC自配。

1.2 β-葡萄糖苷酶的鑒定與系統(tǒng)進(jìn)化分析

從NCBI下載13種真菌的GH3家族β-葡萄糖苷酶序列，用來做系統(tǒng)進(jìn)化分析。采用MEGA-X軟件的ClustalW進(jìn)行序列比對，用最大似然法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。在Pfam網(wǎng)站(http：//pfam.xfam.org/)上對尖孢鐮刀菌中的β-葡萄糖苷酶蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。

1.3 ΔFoglu1缺失突變體的獲得

新鮮幼嫩菌絲中加入崩潰酶，混勻后，置于28 ℃、120 r·min-1的搖床酶解3 h，在冰上取該酶和菌絲的裂解液加入等量的STC，并用擦鏡紙過濾，用離心管收集濾液，3 000×g、4 ℃離心15 min，用STC重懸原生質(zhì)體后，置于冰上備用。取基因片段UP-HPT1、HPT2-DOWN各1 μg混合，加TEC預(yù)處理，在冰上放置20 min，12 000×g離心2 min，吸取上清到原生質(zhì)體中輕輕混勻，并在冰上放置40 min；再加入160 μL的PEG，室溫放置15 min后加入1 mL STC混勻，3 000×g、4 ℃離心5 min；沉淀用STC重懸；于MM培養(yǎng)基中混勻，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h后，加入含有80 μg·mL-1潮霉素的T-TOP培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 d后，挑取轉(zhuǎn)化子。

將挑取的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到含80 μg·mL-1潮霉素的PDA平板上，篩選具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化子。用野生型做對照，用引物對Foglu1-CHECK-F/R檢測轉(zhuǎn)化子中目的基因Foglu1是否被敲除；用潮霉素引物對HPT-F/R檢測敲除突變體是否具有完整的潮霉素抗性基因。若該轉(zhuǎn)化子中未擴(kuò)增出Foglu1-CHECK引物的條帶，而擴(kuò)增出了hpt引物的條帶則可以進(jìn)行下一步驗證，在該Foglu1基因上游臂UP前端設(shè)計引物UPCHECK-F，并在hpt基因片段上設(shè)計一個下游片段引物UPCHECK-R，即引物對UPCEHCK-F/R，來檢測UPCHECK片段是否存在；在hpt基因上設(shè)計一個上游引物DOWNCHECK-F，在目的基因下游臂DOWN的下游設(shè)計引物DOWNCHECK-R，即引物對DOWNCHECK-F/R來檢測DOWNCHECK，若UPCHECK、DOWNCHECK均有條帶則可以判定潮霉素抗性基因完全替換了目的基因，檢測的片段與各引物序列見表1。

表1 引物名稱與序列

為了進(jìn)一步驗證基因是否被敲除，以及同源置換臂在敲除突變體中的拷貝數(shù)，提取野生菌株和敲除突變菌株基因組DNA，并將其稀釋至10 ng·μL-1，作為后續(xù)qRT-PCR的模板。以單拷貝的延伸因子(EF1α)作為內(nèi)參基因，通過Ct值計算基因拷貝數(shù)[17]，引物名稱與序列見表1。

1.4 重組回補載體PKN-Foglu1的構(gòu)建

以野生型菌株的DNA為模板，用引物對H-F/R擴(kuò)增目的基因Foglu1及其上游啟動子區(qū)域、下游終止子區(qū)域。使用限制性內(nèi)切酶SpeⅠ、PstⅠ對Foglu1回補片段和PKN空質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，37 ℃酶切2 h。使用T4 DNA Ligase對2種酶切純化片段在25 ℃連接2 h，通過熱擊轉(zhuǎn)化構(gòu)建重組回補載體PKN-Foglu1。隨機挑取陽性克隆搖菌提取質(zhì)粒做PCR鑒定，用引物對Foglu1-CHECK-F/R、NEO-CHECK-F/R擴(kuò)增目的基因Foglu1，檢測片段和新霉素neo抗性基因片段，能擴(kuò)增出目的片段的轉(zhuǎn)化子為陽性克隆。對PKN空質(zhì)粒做單酶切，PKN-Foglu1質(zhì)粒做單、雙酶切(SpeⅠ和PstⅠ)驗證，20 μL體系37 ℃酶切2 h。

1.5 回補菌株制備

提取PKN-Foglu1質(zhì)粒，將該質(zhì)粒導(dǎo)入ΔFoglu1突變體的原生質(zhì)體中，利用1.3節(jié)方法進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，區(qū)別是在該轉(zhuǎn)化中用新霉素抗性基因(neo)來篩選轉(zhuǎn)化子。用CTAB法提取轉(zhuǎn)化子DNA，以此為模板用引物對CHECK-F/R檢驗?zāi)康幕騀oglu1的存在，用引物對NEO-CHECK-F/R檢驗neo的存在，以ΔFoglu1突變體為對照同時進(jìn)行PCR驗證。當(dāng)突變體中無法擴(kuò)增出這2個條帶，而回補體中能擴(kuò)增出這2個條帶時，說明目的基因回補成功。

1.6 表型分析

1.6.1 生長與脅迫測定

分別配制PDA培養(yǎng)基和含有0.05% SDS、1.2 mol·L-1NaCl、1.2 mol·L-1KCl、0.05% Congo red(CR)、0.1% H2O2的PDA培養(yǎng)基，用到的菌株有野生型、ΔFoglu1突變體、ΔFoglu1-C。

接種與測量方法：取培養(yǎng)7 d的各菌株用5 mm打孔器在菌落邊緣打孔，以牙簽挑取菌餅置于各種PDA平板中心，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后，使用十字交叉法測量菌落直徑并且拍照，該實驗重復(fù)3次。

1.6.2 產(chǎn)孢量測定

取滅菌的擦鏡紙過濾得到孢子懸浮液，用血球計數(shù)板準(zhǔn)確測定其孢子濃度，稀釋孢子液濃度到3×106CFU·mL-1后，用移液槍吸取1 mL到50 mL的PDB培養(yǎng)基中，在28 ℃、180 r·min-1恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48 h，用紗布過濾菌絲得到孢子液并用血球計數(shù)板計數(shù)，統(tǒng)計各組實驗數(shù)據(jù)并分析。

1.6.3 致病力測定

將孢子懸浮液稀釋到1×106CFU·mL-1，取三葉一心期的甘藍(lán)幼苗(營養(yǎng)土與蛭石質(zhì)量比2∶1， 9 cm苗盆，28 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng))浸根30 min，每組處理30株甘藍(lán)苗，置于光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔4 d調(diào)查1次，統(tǒng)計并計算病情指數(shù)。

病情指數(shù)=[∑(發(fā)病級數(shù)×該級株數(shù))]/(最高級數(shù)×總株數(shù))×100。

病害的分級標(biāo)準(zhǔn)[18]：0級，無癥狀；1級，1片葉片葉脈變黃；2級，1～2片葉脈輕度到中度變黃；3級，心葉以外的葉片重度黃化、萎蔫；4級，全部葉片中度重黃化或萎蔫；5級，全株葉片完全萎蔫并死亡。

1.7 數(shù)據(jù)分析

用Microsoft Office 2020軟件處理數(shù)據(jù)，用IBM SPSS Statistics 23軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，顯著性水平為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 Foglu1的生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)分析顯示，尖孢鐮刀菌黏團(tuán)?；?F.oxysporumf. sp.conglutinans， FOC)β-葡萄糖苷酶基因Foglu1(ON409647)編碼893個氨基酸，屬于糖苷水解酶3家族(GH3)。在PFAM數(shù)據(jù)庫(http：//pfam.xfam.org/)中對Foglu1進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該蛋白序列中在第102-361位具有Glyco_hydro_3結(jié)構(gòu)域，閾值為1.3×10-28；在第421-685位具有Glyco_hydro_3_C結(jié)構(gòu)域，閾值為3.3×10-43，在第814-883位具有Fn3-like結(jié)構(gòu)域，閾值為1.7×10-17(圖1-A)，推測Foglu1可水解兩個或多個碳水化合物之間的糖苷鍵，或一個碳水化合物和一個非碳水化合物之間的糖苷鍵。構(gòu)建13種真菌的Foglu1同源蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹，從圖1-B可看出，鐮刀屬不同種聚為一大分支，木霉菌屬和炭疽菌屬各聚為一分支，在尖孢鐮刀菌不同專化型中該蛋白親緣關(guān)系最近。

A，尖孢鐮刀菌β-葡萄糖苷酶Foglu1蛋白結(jié)構(gòu)域分析。紅色區(qū)域代表糖苷水解酶3N末端結(jié)構(gòu)域，綠色區(qū)域代表糖苷水解酶3C末端結(jié)構(gòu)域，紫色區(qū)域代表fibronectin type Ⅲ-like domain. B，β-葡萄糖苷酶同源蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析。尖孢鐮刀菌黏團(tuán)專化型Foglu1用藍(lán)色三角標(biāo)注。A， Conserved domains of β-glucosidase in F. oxysporum f. sp. conglutinans based on Pfam analysis. The red represented the glycosyl hydrolase family 3 N-terminal domain. The green represented the glycosyl hydrolase family 3 C-terminal domain. The purple represented the fibronectin type Ⅲ-like domain. B， Phylogenetic relationship of the β-glucosidase homologs from different fungal species. F. oxysporum f. sp. conglutinans was marked with blue triangle.圖1 尖孢鐮刀菌β-葡萄糖苷酶Foglu1蛋白結(jié)構(gòu)域分析和不同真菌中GH3家族β-葡萄糖苷酶同源蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 Structural domain and phylogenetic relationship analysis of the β-glucosidase homologs from different fungal species

2.2 Foglu1基因的敲除與回補

2.2.1 同源置換臂的制備

使用Split-Marker同源重組敲除技術(shù)[19]進(jìn)行目的基因的敲除，用引物對UP-F/R、DOWN-F/R擴(kuò)增得到目的基因Foglu1的上下游片段UP、DOWN，用引物對HPT-F/HPT-R1和HPT-F2/HPT-R擴(kuò)增潮霉素抗性基因的前2/3片段HPT1和后2/3的HPT2片段，用引物對UP-F/HPT-R1和HPT-F2/DOWN-R進(jìn)行片段融合擴(kuò)增得到UP-HPT1、HPT2-DOWN片段，F(xiàn)oglu1基因的上下游同源置換臂片段UP-HPT1、HPT2-DOWN的長度分別為2 352、2 135 bp(圖2-A)，各引物在片段中的對應(yīng)位置與同源重組敲除策略見圖2-B。

A，同源置換臂的擴(kuò)增。M，Trans 2K Plus Maker；1，UP-HPT1片段；2，HPT2-DOWN片段。B，基因敲除策略。A， Amplification of homologous replacement arms. M， Trans 2K Plus Maker； 1， Fragment of UP-HPT1； 2， Fragment of HPT2-DOWN. B， Strategy of gene knockout.圖2 Foglu1基因敲除Fig.2 Knockout of Foglu1 gene

2.2.2 ΔFoglu1突變體鑒定

采用PCR驗證ΔFoglu1突變體中目的基因是否被潮霉素抗性基因片段(hpt)替換，使用野生型菌株的DNA為對照，對各突變體DNA進(jìn)行PCR鑒定。用目的基因的部分片段Foglu1-CHECK鑒定目的基因是否存在，擴(kuò)增HPT片段鑒定潮霉素基因是否存在，用UPCHECK、DOWNCHECK片段鑒定在基因組上目的基因的上游和下游處是否被正確替換。驗證結(jié)果(圖3-A)表明：兩個ΔFoglu1突變體(ΔFoglu1-1和ΔFoglu1-2)中無法擴(kuò)增出Foglu1-CHECK片段，而野生型中可以，條帶大小為828 bp；兩個ΔFoglu1突變體中能擴(kuò)增出大小為1 500 bp的HPT條帶而野生型中不能，并且兩個ΔFoglu1突變體中擴(kuò)增的UPCHECK條帶大小為2 435 bp、DOWNCHECK條帶大小為2 196 bp，野生型不能擴(kuò)增出這2個片段。為了進(jìn)一步驗證Foglu1基因在ΔFoglu1-1和ΔFoglu1-2中已被敲除且無異位插入，提取野生菌株和ΔFoglu1突變體的基因組DNA進(jìn)行qRT-PCR驗證，結(jié)果顯示，野生菌株和兩個缺失突變體均含有1個拷貝數(shù)的內(nèi)參基因EF1α；野生型含有1個拷貝數(shù)的β-葡萄糖苷酶基因(Foglu1)，兩個缺失突變體沒有該基因；野生型不含有潮霉素基因，兩個缺失突變體在基因組中含有1個拷貝數(shù)的潮霉素基因(圖3-B)。上述結(jié)果表明，ΔFoglu1-1和ΔFoglu1-2為Foglu1基因敲除突變體。

A，缺失突變體的PCR驗證。M，Trans 2K Plus Maker；1，ΔFoglu1-1突變體；2，ΔFoglu1-2突變體；WT，野生型。B，qRT-PCR驗證ΔFoglu1突變體基因拷貝數(shù)。A， PCR verification of ΔFoglu1 mutants. M， Trans 2K Plus Maker； 1， ΔFoglu1-1 mutant； 2， ΔFoglu1-2 mutant； WT， Wild type. B， qRT-PCR verification of gene copy number in ΔFoglu1 mutants.圖3 ΔFoglu1突變體的驗證Fig.3 Verification of ΔFoglu1 mutants

2.2.3Foglu1基因的回補

將Foglu1基因的回補片段與PKN(含新霉素NEO和Amp抗性)質(zhì)粒分別酶切、連接，熱擊轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞，用含有Amp抗性的LB培養(yǎng)基篩選陽性克隆，挑取單菌落搖菌，提取重組質(zhì)粒(PKN-Foglu1)進(jìn)行單酶切(SpeI)和雙酶切(SpeI、PstI)驗證，PKN質(zhì)粒單酶切大小為5 007 bp，PKN-Foglu1質(zhì)粒單酶切大小為9 960 bp，PKN-Foglu1質(zhì)粒雙酶切質(zhì)粒大小為4 985 bp、片段大小為4 975 bp。結(jié)果(圖4-A)表明，回補載體PKN-Foglu1構(gòu)建成功。將回補載體導(dǎo)入ΔFoglu1突變體制備的原生質(zhì)體中，在含NEO的LB培養(yǎng)基上篩選獲得回補體菌株ΔFoglu1-C，提取其DNA做PCR鑒定，擴(kuò)增抗性篩選標(biāo)記基因NEO-CHECK片段，大小為901 bp；擴(kuò)增回補片段上的Foglu1-CHECK片段，大小為828 bp，表明成功獲得回補菌株ΔFoglu1-C(圖4-B)。

A，PKN-Foglu1的酶切驗證。M，Trans 15K maker；1，PKN質(zhì)粒單酶切；2，PKN-Foglu1質(zhì)粒單酶切；3，PKN-Foglu1質(zhì)粒雙酶切；4，F(xiàn)oglu1回補片段雙酶切。B，回補菌株ΔFoglu1-C的驗證。M，Trans 2K Plus Maker；1，ΔFoglu1-C的NEO-CHECK片段；2，ΔFoglu1突變體的NEO-CHECK片段；3，ΔFoglu1-C的Foglu1-CHECK片段；4，ΔFoglu1突變體的Foglu1-CHECK片段。A， Enzymatic digestion validation of PKN-Foglu1. M， Trans 15K maker； 1， Single cleavage of PKN plasmid； 2， Single cleavage of PKN-Foglu1 plasmid； 3， Double digestion of PKN-Foglu1 plasmid； 4， Double digestion of Foglu1 complement fragment. B， Validation of complement strain ΔFoglu1-C. M， Trans 2K Plus Maker； 1， NEO-CHECK fragment of ΔFoglu1-C； 2， NEO-CHECK fragment of ΔFoglu1； 3， Foglu1-CHECK fragment of ΔFoglu1-C； 4， Foglu1-CHECK fragment of ΔFoglu1.圖4 PKN-Foglu1質(zhì)粒的酶切驗證與ΔFoglu1-C驗證Fig.4 PKN-Foglu1 enzyme digestion and ΔFoglu1-C validation

2.3 ΔFoglu1突變體表型分析

2.3.1 ΔFoglu1突變體菌絲生長對細(xì)胞膜脅迫和氧化脅迫敏感

對野生型、ΔFoglu1突變體、ΔFoglu1-C進(jìn)行菌絲生長脅迫試驗，5 d后菌落生長情況如圖5-A所示。用含有1.2 mol·L-1NaCl、1.2 mol·L-1KCl的PDA培養(yǎng)基進(jìn)行滲透脅迫，用含有0.05%剛果紅(congo red， CR)的PDA培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞壁脅迫。結(jié)果顯示，ΔFoglu1突變體與野生型相比菌絲生長沒有顯著性差異(圖5-B)。含有0.05%十二烷基硫酸鈉(SDS)的PDA平板上細(xì)胞膜脅迫試驗結(jié)果顯示，ΔFoglu1突變體與野生型相比生長速率降低了約19.6%，說明缺失Foglu1基因會使FOC細(xì)胞膜功能受損。在氧脅迫試驗中發(fā)現(xiàn)，ΔFoglu1突變體在含0.1% H2O2的PDA平板上生長速率較野生型降低了14%，而野生型和ΔFoglu1-C相比無顯著性差異(圖5-B)。上述研究結(jié)果表明，F(xiàn)oglu1基因缺失會降低FOC對氧的耐受性。預(yù)測ΔFoglu1突變體侵染甘藍(lán)時，對植物免疫反應(yīng)中氧爆發(fā)抵抗能力會減弱。

A，不同脅迫條件下生長5 d的菌落；B，菌落直徑的方差分析。柱形上方相同字母表示數(shù)據(jù)在單因素方差分析中差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。A， Colonies under different stresses for 5 days； B， Variance analysis of colony diameter. The same letters above the column indicated that the data were not significant (P>0.05) in one-way ANOVA， different letters indicated significant (P<0.05). The same as below.圖5 ΔFoglu1突變體生長脅迫測定Fig.5 Stress measurement of ΔFoglu1 mutant growth

2.3.2 ΔFoglu1突變體的產(chǎn)孢能力下降

為驗證Foglu1基因?qū)OC的生殖生長是否有影響，統(tǒng)計了野生型、ΔFoglu1突變體和ΔFoglu1-C的產(chǎn)孢量，接種3×106個孢子到50 mL的PDB中，并在28 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48 h后，測得野生型菌株的孢子濃度平均值為4.74×107CFU·mL-1，ΔFoglu1突變體的孢子濃度平均值為3.68×107CFU·mL-1，而ΔFoglu1-C的孢子濃度平均值為4.70×107CFU·mL-1，ΔFoglu1突變體產(chǎn)孢量相對于野生型下降了約22.3% (圖6)，表明缺失Foglu1基因可以降低FOC的產(chǎn)孢能力。

圖6 野生型和突變體菌株的產(chǎn)孢能力Fig.6 Conidia production of wild type and mutant stains

2.3.3 缺失Foglu1基因延緩病原菌致病進(jìn)程

對接種野生型、ΔFoglu1突變體、ΔFoglu1-C菌株的甘藍(lán)苗進(jìn)行病害調(diào)查。在第8天時，接種野生型的甘藍(lán)苗病情指數(shù)為48.4，接種ΔFoglu1突變體的甘藍(lán)苗病情指數(shù)為29.3，接種ΔFoglu1-C的甘藍(lán)苗病情指數(shù)為45.3，此時接種ΔFoglu1突變體與野生型、回補體的甘藍(lán)苗病情指數(shù)具有顯著性差異(圖7)，說明Foglu1的缺失延緩了病原菌致病進(jìn)程；然而，在接種后11 d發(fā)現(xiàn)接種3種菌株的甘藍(lán)苗均發(fā)病嚴(yán)重，接種野生型和回補體的病情指數(shù)為64.7和63.0，接種突變體的病情指數(shù)為55.9，此時接種突變體的發(fā)病相對較輕，但三者無顯著性差異；在第15天時，接種野生型的病情指數(shù)為75.3，接種ΔFoglu1突變體與回補體的病情指數(shù)均為72.0；第18天，接種3種菌株的甘藍(lán)幼苗病情指數(shù)趨于一致，均達(dá)到80.0以上，說明當(dāng)病原菌定殖寄主后，該基因?qū)OC的致病力沒有影響(圖7)。

A，接種尖孢鐮刀菌的甘藍(lán)在第8、11、15天的生長情況；B，野生菌株、缺失突變菌株ΔFoglu1、回補菌株ΔFoglu1-C接種甘藍(lán)4～18 d的病情指數(shù)。A， The growth of cabbage inoculated with FOC at 8 days， 11 days and 15 days after inoculation； B， The disease indexes of wild type， ΔFoglu1 and ΔFoglu1-C from 4 to 18 days after inoculation.圖7 缺失Foglu1基因?qū)е翭OC侵染初期的致病力減弱Fig.7 Deletion of the Foglu1 gene leads to reduced virulence in the initial stage of FOC infected cabbage

3 討論

β-葡萄糖苷酶的研究與應(yīng)用廣泛存在于食品、飼料、紡織品和制藥等領(lǐng)域[20-21]。本研究對尖孢鐮刀菌黏團(tuán)專化型(FOC)β-葡萄糖苷酶基因Foglu1的敲除旨在研究該基因在形態(tài)分化與致病力中的作用。在細(xì)胞膜脅迫試驗中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oglu1敲除突變菌株生長速率較野生型下降了19.6%，說明β-葡萄糖苷酶在尖孢鐮刀菌中對維持細(xì)胞膜正常的生理功能有一定的作用，推測敲除Foglu1基因?qū)е翭OC細(xì)胞膜的功能受到損傷；在對產(chǎn)孢量的測定中發(fā)現(xiàn)，敲除突變體與野生菌株相比，產(chǎn)孢量下降約22.3%，推測Foglu1基因參與FOC的產(chǎn)孢過程。在植物中存在著抵抗病原菌入侵的基礎(chǔ)防御系統(tǒng)，其中就包括過氧化氫等活性氧(ROS)。有研究報道，植物在入侵位點上的活性氧可抵御入侵的病原菌[22]。相應(yīng)地，植物病原菌也進(jìn)化出許多策略來抵御活性氧，從而成功地侵染寄主[23]。所以病原真菌對活性氧的抵抗能力可在一定程度上反映其侵染寄主的能力。本研究中，野生型、突變體與回補體在含有0.1% H2O2平板上培養(yǎng)時，ΔFoglu1突變體的生長速率較野生型降低14%，表明Foglu1基因可能與侵染寄主時病原菌的抗氧化防御機制有關(guān)，這一功能在后續(xù)接種寄主甘藍(lán)時也得以驗證。野生型菌株接種寄主甘藍(lán)，接種后第6天葉片出現(xiàn)明顯網(wǎng)狀黃化，敲除突變菌株接種的寄主甘藍(lán)沒有明顯黃化癥狀；在接種后11 d內(nèi)，ΔFoglu1突變體的病情發(fā)展較野生型和回補體緩慢，葉片網(wǎng)狀黃化程度比野生型和回補體輕，但是在接種15 d后ΔFoglu1突變體、野生型和回補體接種的甘藍(lán)幼苗病情指數(shù)相當(dāng)，直到第18天所有甘藍(lán)苗病情指數(shù)趨于一致。這說明缺失Foglu1基因?qū)е翭OC與寄主互作初期致病力下降，可能的原因是突變體侵入寄主植物時抵抗氧爆發(fā)能力減弱，發(fā)病相對于野生型延緩。在侵染甘藍(lán)的后期致病力表現(xiàn)正常，說明敲除該基因僅對FOC前期侵入寄主甘藍(lán)有影響，但是并不影響其致病力。有研究報道，GH3家族的β-葡萄糖苷酶在水解纖維素過程中對纖維二糖發(fā)揮著重要作用[24]。突變體與寄主互作初期致病力下降是否與病原菌水解纖維素的能力下降有關(guān)，這將是下一步研究的重點。