蟬花菌質(zhì)在飼料中應(yīng)用的安全性研究

紀(jì) 偉， 蘇文英， 劉曉梅， 柴文波*， 任立凱*， 閆文娟， 孫長(zhǎng)勝， 陳克龍

（1.連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇連云港 222000；2.青海師范大學(xué)，青海西寧 810000；3.浙江泛亞生物醫(yī)藥股份有限公司，浙江嘉興 314200）

蟬花（IsariacicadaeMiquel）是一種古老的蟲(chóng)草，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值（李增智等，2020；劉愛(ài)英，2012）。蟬花子實(shí)體（人工培植）采收后剩余的培養(yǎng)基，在發(fā)酵過(guò)程中，培養(yǎng)基大部被分解轉(zhuǎn)化，里面含有部分蟬花蟲(chóng)草菌絲體，故命名為蟬花菌質(zhì)（紀(jì)偉等，2021）。研究表明，蟬花菌質(zhì)不僅含有腺苷、多糖等活性成分，還含有豐富的氨基酸、微量元素、D-甘露醇和核苷類(lèi)、維生素類(lèi)、蕈糖和硬脂酸等物質(zhì)（于士軍等，2015；于士軍等，2014），具有廣泛的藥理作用（孫長(zhǎng)勝等，2020）。開(kāi)發(fā)應(yīng)用這部分資源，不僅為蟬花子實(shí)體收獲后留下的材料解決了出路問(wèn)題，而且可變廢為寶，提高蟬花培養(yǎng)物的附加值（昆都孜斯坎達(dá)爾等，2019）。

蟲(chóng)草作為飼料原料或飼料添加劑應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)逐漸成為研究熱點(diǎn)，尤其是我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194號(hào)公告發(fā)布后，“減抗、替抗、無(wú)抗”轉(zhuǎn)型升級(jí)已是大勢(shì)所趨。蟲(chóng)草飼料添加劑屬真菌類(lèi)發(fā)酵產(chǎn)物，天然、無(wú)耐藥性、無(wú)毒副作用、無(wú)殘留，是一種新型的免疫增強(qiáng)劑，符合添加劑或飼料原料市場(chǎng)綠色、環(huán)保的發(fā)展要求，可作為免疫增強(qiáng)類(lèi)飼料添加劑或飼料原料應(yīng)用于畜禽毒性疾病的防治中，對(duì)我國(guó)實(shí)施的生態(tài)養(yǎng)殖和健康養(yǎng)殖具有非常重要的意義（紀(jì)偉等，2021；李洋等，2019）。

本研究擬對(duì)大鼠連續(xù)染毒90 d，通過(guò)分析受試大鼠的食欲、飲水、增重、血液學(xué)指標(biāo)、血液生化指標(biāo)和病理學(xué)等指標(biāo)，評(píng)價(jià)蟬花菌質(zhì)的安全性，以期為蟬花菌質(zhì)作為飼料添加劑或飼料原料提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蟬花菌質(zhì) 蟬花人工培育完成后，將蟬花子實(shí)體采收剩余的小麥培養(yǎng)基，在發(fā)酵過(guò)程中，小麥培養(yǎng)基大部被分解轉(zhuǎn)化，里面含有部分蟬花蟲(chóng)草菌絲體，該樣品由浙江泛亞生物醫(yī)藥股份有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 健康無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)斯普拉格-杜勒（SD）大鼠100只，雌雄各半，試驗(yàn)動(dòng)物為4～5周齡，體重70～90 g，試驗(yàn)用SD大鼠購(gòu)自北京為通利華動(dòng)物科技有限公司，合格證號(hào)：SCXK（京）2016-0011。

1.3 主要試劑和儀器 甲醛水溶液（含量37%～40%，天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)）；血液指示檢測(cè)試劑（上?？迫A生物工程股份有限公司）；稀釋液（法國(guó)優(yōu)德實(shí)驗(yàn)室公司）；清洗液（含酶，法國(guó)優(yōu)德實(shí)驗(yàn)室公司）；BS2202電子天平（北京賽多利斯儀器公司）；ELLIPSE全自動(dòng)生化分析儀（法國(guó)優(yōu)德公司）；Hema starⅡ血細(xì)胞分析儀 （法國(guó)YESBAERT）；切片機(jī)（美國(guó)Thermo）；顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.4 染毒劑量與分組 根據(jù)受試物急性毒性試驗(yàn)結(jié)果，即半數(shù)致死量（LD50）大于5000 mg/kg體重，以及受試物加入飼料中最大量不能大于飼料量5%的限定，試驗(yàn)設(shè)50000 mg/kg飼料（高）、10000 mg/kg飼料（中）、2000 mg/kg飼料（低）三個(gè)劑量組，另設(shè)一個(gè)陰性對(duì)照組。每組20只SD大鼠（雌雄各半），雌雄大鼠的體重差異控制在平均體重的20%以?xún)?nèi)。

1.5 受試物的配制 將受試物加入到各劑量鼠維持飼料中，在飼料混合器中攪拌均勻后制成顆粒飼料，試驗(yàn)大鼠自由采食含有各劑量受試物的飼料，陰性對(duì)照組飼料中不添加受試物。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 一般觀察 每日察看一次試驗(yàn)動(dòng)物的健康狀況，詳細(xì)記錄大鼠行為、眼口鼻是否有分泌物、糞便是否成形、是否腹瀉或便秘及糞便顏色、毛發(fā)是否黯淡無(wú)光、豎毛，仔細(xì)檢查各劑量組大鼠是否出現(xiàn)中毒癥狀及出現(xiàn)癥狀的時(shí)間、表現(xiàn)。假如發(fā)現(xiàn)死亡或?yàn)l死大鼠，需要立即進(jìn)行相應(yīng)檢查，并對(duì)大鼠異常情況和死亡時(shí)間進(jìn)行記錄，對(duì)死亡動(dòng)物及時(shí)剖檢并取心、肝、脾、肺、腎、十二指腸等組織做病理切片。所有試驗(yàn)動(dòng)物每5 d稱(chēng)量一次體重和采食量，飲水每天計(jì)量一次（Liu等，2020）。

1.6.2 血常規(guī)檢查 在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)（第90天），各試驗(yàn)組分別取5只雄性和5只雌性大鼠的血液，進(jìn)行血紅蛋白（Hg）、紅細(xì)胞數(shù)（RBC）、白細(xì)胞數(shù)（WBC）、血小板數(shù)（PLT）、紅細(xì)胞壓積（HCT）、嗜酸性（EOS）、嗜堿性（BAS）、單核細(xì)胞（MO）、淋巴細(xì)胞（LY）等血液學(xué)指標(biāo)檢測(cè)（董飛飛，2017；張淑慧，2015）。

1.6.3 血清生化檢查 在血常規(guī)檢查的同時(shí)對(duì)血清白蛋白（Alb）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、總膽固醇（TCH）、肌酐（Cr）、血糖（Glu）、總蛋白（TP）和甘油三酯（TG）等血液生化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)（Rasmus等，2022）。

1.7 病理檢查

1.7.1 大體剖檢 在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)（第90天），各試驗(yàn)組分別處死5只雄性和5只雌性大鼠，進(jìn)行大體剖檢，如觀察到可疑病變組織，應(yīng)及時(shí)固定保存并進(jìn)行組織學(xué)檢查。大體剖檢的同時(shí)，需稱(chēng)取體重及重要臟器重量，并計(jì)算心肝、腎、脾、肺、胃腸、睪丸及卵巢等臟器的臟器系數(shù)（Smitn等，2022）。

1.7.2 組織病理學(xué)檢查 在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)（第90天），各試驗(yàn)組分別處死5只雄性和5只雌性大鼠，取心、肝、脾、肺、腎、十二指腸用10%中性福爾馬林溶液浸泡固定。對(duì)高劑量組和對(duì)照組試驗(yàn)鼠的心、肝、脾、肺、腎、十二指腸等主要臟器制作常規(guī)病理石蠟切片，HE染色進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，如發(fā)現(xiàn)病變則需對(duì)較低劑量組試驗(yàn)鼠的相應(yīng)組織器官進(jìn)行組織病理學(xué)檢查（宋翼升等，2017）。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析 以t檢驗(yàn)分析比較受試物各劑量組與陰性對(duì)照組之間的采食量、飲水量、日增重、血液學(xué)指標(biāo)、血液生化指標(biāo)及臟器系數(shù)等指標(biāo)的差異顯著性，如有動(dòng)物某臟器發(fā)生病變、腫瘤或動(dòng)物發(fā)生死亡現(xiàn)象，則病變率、腫瘤發(fā)生率、死亡率等計(jì)數(shù)資料采用X2檢驗(yàn)分析其差異顯著性。如分析結(jié)果為P值小于0.05，則判定其具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 一般觀察 在試驗(yàn)期限（90 d）內(nèi)，受試物高、中、低三個(gè)劑量組動(dòng)物和陰性對(duì)照組動(dòng)物均未見(jiàn)行為異常，并且其毛色順滑，眼口鼻無(wú)分泌物，糞便形態(tài)正常（淺灰色）。

2.2 采食量 由圖1可知，隨著喂養(yǎng)時(shí)間增加各試驗(yàn)組采食量呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，喂養(yǎng)至50 d時(shí)采食量趨于穩(wěn)定，受試物高、中、低三個(gè)劑量組平均日采食量分別較對(duì)照組提高了0.31%、0.89%、0.19%（P＞0.05），表明蟬花菌質(zhì)在2000～50000 mg/kg飼料劑量?jī)?nèi)經(jīng)自由采食連續(xù)給予大鼠90 d，對(duì)受試動(dòng)物的采食量無(wú)顯著影響。

圖1 蟬花菌質(zhì)對(duì)大鼠采食量的影響

2.3 飲水量 由圖2可知，受試物高、中、低三個(gè)劑量組平均日飲水量分別較對(duì)照組提高了2.91%、2.48%、1.06%（P＞0.05），表明蟬花菌質(zhì)在2000～50000 mg/kg飼料劑量?jī)?nèi)經(jīng)自由飲水連續(xù)給予大鼠90 d，對(duì)受試動(dòng)物的飲水量無(wú)顯著影響。

圖2 蟬花菌質(zhì)對(duì)大鼠飲水量的影響

2.4 日增重 由圖3可知，受試物高、低兩個(gè)劑量組平均日增重分別較對(duì)照組提高了0.53%、0.26%（P＞0.05），受試動(dòng)物中劑量組平均日增重較對(duì)照組降低了0.47%（P＞0.05），表明蟬花菌質(zhì)在2000～50000 mg/kg飼料劑量對(duì)受試動(dòng)物的增重?zé)o顯著影響。

圖3 蟬花菌質(zhì)對(duì)大鼠平均增重的影響

2.5 血常規(guī) 從表1可以看出，受試物高劑量組、中劑量組、低劑量組動(dòng)物在試驗(yàn)期間的血液學(xué)指標(biāo)與陰性對(duì)照組的血液學(xué)指標(biāo)無(wú)顯著性差異（P＞0.05），表明蟬花菌質(zhì)在2000～50000 mg/kg飼料劑量?jī)?nèi)經(jīng)自由采食給予大鼠90 d，對(duì)受試動(dòng)物的血液學(xué)指標(biāo)無(wú)顯著影響。

表1 喂養(yǎng)90 d時(shí)蟬花菌質(zhì)對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

2.6 血液生化指標(biāo) 從表2可以看出，受試物高劑量組、中劑量組、低劑量組動(dòng)物在試驗(yàn)期間的血液生化指標(biāo)與陰性對(duì)照組的血液生化指標(biāo)無(wú)顯著性差異（P＞0.05），表明蟬花菌質(zhì)在2000～50000 mg/kg飼料劑量?jī)?nèi)經(jīng)自由采食給予大鼠90 d，對(duì)受試動(dòng)物的血液生化指標(biāo)無(wú)顯著影響。

表2 喂養(yǎng)90 d時(shí)蟬花菌質(zhì)對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)的影響

2.7 臟器系數(shù) 從表3可以看出，受試物高劑量組、中劑量組、低劑量組三個(gè)劑量組動(dòng)物在試驗(yàn)期間的臟器系數(shù)均與陰性對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），表明經(jīng)自由采食給予大鼠蟬花菌質(zhì)對(duì)動(dòng)物的心、肝、腎、脾、肺、胃腸、睪丸及卵巢等主要器官的臟器系數(shù)無(wú)顯著影響。

表3 喂養(yǎng)90 d時(shí)蟬花菌質(zhì)對(duì)大鼠臟器系數(shù)的影響

2.8 病理檢查

2.8.1 大體剖檢 在試驗(yàn)期限（90 d）內(nèi)，受試動(dòng)物未見(jiàn)發(fā)病和死亡現(xiàn)象，受試物高、中、低三個(gè)劑量組動(dòng)物和陰性對(duì)照組動(dòng)物的大體剖解均未見(jiàn)異常。

2.8.2 病變檢查 從圖4可以看出，受試物高劑量組動(dòng)物和陰性對(duì)照組動(dòng)物的上述臟器的組織切片均未見(jiàn)異常，表明在2000～50000 mg/kg飼料劑量?jī)?nèi)經(jīng)自由采食給予大鼠蟬花菌質(zhì)對(duì)受試動(dòng)物的心、肝、脾、腎、十二指腸等主要臟器無(wú)不良影響。

圖4 主要臟器組織切片圖

3 討論

本研究通過(guò)大鼠90 d喂養(yǎng)試驗(yàn)來(lái)開(kāi)展蟬花菌質(zhì)的安全性評(píng)價(jià)工作，蟬花菌質(zhì)在2000～50000 mg/kg飼料劑量?jī)?nèi)連續(xù)染毒90 d對(duì)SD大鼠的食欲、飲水、增重、血液學(xué)指標(biāo)、血液生化指標(biāo)和病理學(xué)指標(biāo)均無(wú)顯著影響，在2000～50000 mg/kg飼料劑量?jī)?nèi)經(jīng)自由采食給予大鼠蟬花菌質(zhì)對(duì)受試動(dòng)物的心、肝、脾、腎、十二指腸等主要臟器無(wú)不良影響。

蟬花作為一種古老的蟲(chóng)草具有一千多年的入藥歷史（李增智等，2020），蟬花子實(shí)體（人工培植）已于2021年國(guó)家衛(wèi)健委批準(zhǔn)為新食品原料，其安全性已經(jīng)得到長(zhǎng)期驗(yàn)證和認(rèn)可，人工培養(yǎng)蟬花子實(shí)體的副產(chǎn)物蟬花菌質(zhì)同樣蘊(yùn)含豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，可作為免疫增強(qiáng)類(lèi)飼料添加劑或飼料原料應(yīng)用于畜禽疾病的預(yù)防中，對(duì)我國(guó)實(shí)施的生態(tài)養(yǎng)殖和健康養(yǎng)殖具有非常重要的意義（紀(jì)偉等，2021；李洋等，2019）。蟬花菌質(zhì)所使用的菌株是經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的研究和篩選所得，其可以通過(guò)微生物發(fā)酵方法進(jìn)行生產(chǎn)，不僅產(chǎn)量和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，且質(zhì)量易控。通過(guò)蟬花菌質(zhì)在飼料應(yīng)用中的安全性研究，為今后蟬花菌質(zhì)在飼料中應(yīng)用提供科學(xué)理論依據(jù)（昆都孜斯坎達(dá)爾等，2019）。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，蟬花菌質(zhì)在2000～50000 mg/kg飼料劑量?jī)?nèi)連續(xù)染毒90 d，受試大鼠高、中、低三個(gè)劑量組平均日采食量、平均日飲水量、平均日增重較對(duì)照組均有一定提高，但以上均無(wú)顯著性差異；受試大鼠的血液學(xué)指標(biāo)、血液生化指標(biāo)和病理學(xué)指標(biāo)與陰性對(duì)照組相比也均無(wú)顯著性差異；在試驗(yàn)中期和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)高劑量組及陰性對(duì)照組試驗(yàn)鼠的心、肝、脾、腎、十二指腸等主要臟器的組織切片觀察，受試物高劑量組動(dòng)物和陰性對(duì)照組動(dòng)物的上述臟器的組織切片均未見(jiàn)異常。因此，本試驗(yàn)（90 d喂養(yǎng)試驗(yàn)）結(jié)果顯示蟬花菌質(zhì)在2000～50000 mg/kg飼料劑量?jī)?nèi)無(wú)亞慢性毒性。