在結腸癌細胞中P53突變調控KLF5功能及表達變化的實驗研究

曹杰智 賴東明 伍衡褚 忠 華 曾育杰

在結腸癌細胞中P53突變調控KLF5功能及表達變化的實驗研究

曹杰智 賴東明 伍衡褚 忠 華 曾育杰*

目的探討在結腸癌細胞株中P53基因突變對KLF5基因功能及表達變化的影響。方法通過對常見結腸癌細胞株的篩選，選取P53野生型及KLF5基因蛋白表達相對較低的細胞株作為研究對象，應用質粒構建過表達載體轉染目的細胞，運用PCR及Western blot技術進行驗證，再用細胞遷移、侵襲、增殖實驗觀察結腸癌細胞株中P53突變與否對KLF5基因功能及表達的影響。結果通過應用Western blot技術對常見的7株結腸癌細胞株中KLF5基因蛋白表達以及應用Sanger測序對細胞株中P53突變情況的篩選，選取結腸癌細胞株RKO作為研究對象，在成功構建P53R175H過表達載體及KLF5干擾和過表達載體，并轉染到RKO細胞株中，并行Western?blot驗證后，運用細胞遷移、侵襲及增殖實驗，發(fā)現(xiàn)在沒有P53R175H突變的RKO結腸癌細胞株中，KLF5的過表達能抑制細胞的遷移、侵襲及增殖的能力，而敲除KLF5的表達后，可以發(fā)現(xiàn)細胞的遷移、侵襲及增殖能力明顯增加；而在P53R175H突變后的結腸癌細胞株RKO中，KLF5的過表達則會導致RKO的遷移、侵襲及增殖能力明顯增強，而敲除KLF5的表達后遷移、侵襲及增殖能力下降。同時也發(fā)現(xiàn)RKO細胞中P53的突變會導致KLF5的表達水平的下降。結論在高表達P53突變的結腸癌細胞株RKO中，KLF5的蛋白表達水平下降，而且其基因功能則從抑癌向促癌方向轉換。

結腸癌；P53突變；KLF5

P53基因與人類約50%的腫瘤相關，具有抑制腫瘤生長功能，而其突變使之獲得類似癌基因的功能，導致細胞增殖失控，是腫瘤發(fā)生的一個重要原因。P53突變是結直腸癌發(fā)生中常見的早期事件，其最常見的突變位點是第175位氨基酸，但突變并不能夠直接導致腫瘤的浸潤及轉移進展［1，2］。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，消化道特異性轉錄因子??KLF5，在結直腸組織不典型增生和結腸腺瘤等癌前病變以及癌組織的高分化區(qū)域中表達升高，而在結直腸腺癌低分化或深度浸潤區(qū)域的表達減低至完全消失。有研究資料認為［3，4］，KLF5具有原癌基因功能，可以促進乳腺癌及結腸癌細胞的增殖生長和轉移；而我們前期利用慢病毒載體在結腸癌細胞株中過表達KLF5，發(fā)現(xiàn)其能抑制結腸癌細胞的增殖、遷移侵襲能力［5］，與另一些研究資料結論一致［6］，體現(xiàn)了其抑癌基因的功能。這種不一樣的細胞及不同生物學背景間發(fā)生KLF5功能及表達變化的原因尚未探明。本研究通過基因過表達的技術，觀察在結直腸癌細胞中P53突變對KLF5功能及表達變化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人結腸癌細胞株Caco2、DLD1、HT?29、HT?116、Lovo、RKO、HCT?8購自中科院上海細胞庫，并于中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院醫(yī)研中心保種。胎牛血清、1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自Gibco公司，聚合酶鏈反應（PCR）試劑盒購自TaKaRa公司。羊抗一抗KLF5抗體購自Boster公司，鼠抗一抗P53抗體購自Abcam公司，PCR引物由上海捷瑞生物有限公司構建，Transwell小室購自Falcon公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

復蘇的結腸癌細胞株置于10%胎牛血清1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，待細胞融合至80%左右，用胰酶消化傳代。

1.3 過表達質粒構建和轉染

KLF5所用的載體為LV003，其過表達構建過程如下：擴增引物序列設計：在NCBI上搜索到目的基因，找到該基因的mRNA，確定CDS長度及序列??KLF5（1374 bp），并用Primer Premier5設計引物，以人肺組織cDNA為模板調取目的基因，用Transgen DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產物，然后用EcoRI與NotI雙切載體及目的基因，通過目的片段與載體連接及產物轉化，并克隆菌落PCR，擴增培養(yǎng)后提取質粒測序。引物系列設計為：KLF5?F1 GTGGGCGAGGTGGGAAGT；KLF5?R1 CTG?GAACGGGTCACACGG；KLF5?F2 CCGGAATTCAT?GGCTACAAGGGTGCTGAGC；KLF5?R2 ATTGCG?GCCGCTCAGTTCTGGTGCCTCTTCATATG，應用Li?pofectamine?2000進行轉染細胞。

P53所用的載體為PCDNA3.1，其過表達構建過程如下：擴增引物序列設計：在NCBI上搜索到目的基因，找到該基因的mRNA，確定CDS長度及序列?P53R175H（1182 bp），并用Primer Premier5設計引物，以P53基因為模板調取175位點上、下游片段，然后將其連接，用Transgen DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產物，然后用EcoRI與NotI雙切載體及目的基因，通過目的片段與載體連接及產物轉化，并克隆菌落PCR，擴增培養(yǎng)后提取質粒測序。引物系列設計為：P53?F3 AGGTTGTGAG?GCACTGCC；P53?R3 GGCAGTGCCTCACAACCT；P53?F2CTGGCTAGCTTGGCTAGCATGGAGGAGCC?GCAGTCAG；P53?R2 AACCTCGAGCCGCTCGAGT?CAGTCTGAGTCAGGCCCTTC，應用Lipofectamine?2000進行轉染細胞。

1.4 Transwell檢測細胞遷移能力

胰酶消化成單細胞懸液，計數(shù)，用無血清培養(yǎng)基調整細胞濃度至1×106/mL。加入100μL細胞懸液至小室上室，在下室中加入600μL含不同濃度胎牛血清的完全培養(yǎng)基。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。取出小室，用棉簽擦去上室的細胞，4%多聚甲醛固定10min，PBS洗滌一次，結晶紫染色10min，PBS洗滌一次，顯微鏡觀測并拍照。

1.5 Transwell細胞侵襲實驗

將Matrigel置于4℃中過夜溶解，用預冷的基礎培養(yǎng)基按Matrigel：培養(yǎng)基=1∶3的比例稀釋，取20μL加入預冷的Transwell小室中，動作要慢，避免產生氣泡。37℃孵育2 h使Matrigel凝固。分別在上下室加入100μL和600μL基礎培養(yǎng)基，37℃水合過夜。次日吸去培養(yǎng)基。實驗細胞胰酶消化后，取適量細胞懸液，800 rpm離心5min。吸去上清，用基礎培養(yǎng)基重懸細胞后，細胞計數(shù)并用基礎培養(yǎng)基調整細胞濃度至1×106/mL，取100μL加入至Transwell小室上室，在下室加入600μL完全培養(yǎng)基。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h后，取出小室，用棉簽擦去上室的細胞，4%多聚甲醛固定15分鐘，PBS洗滌一次，1%結晶紫染色10min，PBS洗滌一次，顯微鏡下觀察細胞是否穿過小孔。如有穿過，終止其他實驗組，拍照。

1.6 細胞增殖實驗（MTS法）

細胞提前一天消化成單細胞懸液，計數(shù)，調整細胞濃度為5×104個/mL，分到96孔板，每孔100 μL，即每孔細胞為5000個，6個組，每個組9個孔。待細胞貼壁后，分別加入MTS試劑，比例為1∶10，即100μL培養(yǎng)液加入10μL檢測液。37℃孵育4h后，酶標儀檢測490 nm吸光值。連續(xù)檢測3天，每天3復孔。

1.7 Western blot法

使用RIPA裂解細胞，提取細胞總蛋白，定量。取蛋白樣品，加入緩沖液，98℃水浴5min后上樣。SDS?PAGE凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉至PVDF膜，隨后將膜置于5%脫脂奶粉的TBST溶液中封閉1 h，加入一抗抗體，4℃過夜，次日加入二抗室溫孵育1 h，通過增強型化學發(fā)光試劑ECL發(fā)光液檢測蛋白條帶。

1.8 統(tǒng)計學方法

結果均采取均數(shù)±標準差表示，采取t檢驗，應用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 結腸癌細胞株篩選

Western?blot和Q?PCR檢測實驗室所擁有的七株結腸癌細胞株（Caco2、DLD1、HT?29、HT?116、Lovo、RKO、HCT?8），發(fā)現(xiàn)RKO及LOVO這兩株結腸癌細胞株中，KLF5的蛋白及mRNA水平表達最低。同時Sanger測序檢測上述結腸癌細胞株中P53第175位氨基酸對應的核酸突變情況，經過測列比對，RKO細胞在175位氨基酸對應的核苷酸中沒有突變，RKO中的P53基因是野生型的。因此我們選取RKO細胞株作為研究細胞株。

2.2 過表達載體細胞株的構建

成功構建P53R175H過表達載體及KLF5干擾和過表達載體，并轉染到RKO細胞株中，并行Western?blot驗證（圖1）。

圖1 P53突變對KLF5蛋白水平表達影響

2.3 P53突變對KLF5表達水平的影響

根據（圖1）Western?Blot的結果顯示：當存在P53R175H突變時，空載體的RKO細胞，相對于沒有突變的空載體的RKO細胞中的KLF5的蛋白水平表達是下降的，（KLF5/GAPDH標準化：在pCDNA3.1?NC細胞中為1，則在P53R175H?NC細胞中為0.839±0.028），這結果說明了結腸癌細胞株RKO中P53的突變會導致KLF5的表達水平的改變。

2.4 KLF5基因過表達及P53R175H的突變對結腸癌細胞株RKO的細胞生物學行為影響

①細胞侵襲實驗：結果提示：在沒有P53R175H突變的RKO結腸癌細胞株中，KLF5的過表達能抑制細胞的侵襲能力，而敲除KLF5的表達后，可以發(fā)現(xiàn)細胞的侵襲性明顯增加。而在P53R175H突變后的結腸癌細胞株RKO中，KLF5的過表達會導致RKO的侵襲能力明顯增強，而敲除KLF5的表達后侵襲能力下降。（圖2）

圖2 細胞侵襲實驗圖

②細胞遷移實驗：結果同侵襲實驗。無P53R175H突變組中，RKO?NC細胞的穿膜細胞數(shù)為37.2±3.1個，而RKO?KLF5細胞的穿膜細胞數(shù)為25.1±3.2個，RKO?ShKLF5細胞的穿膜細胞數(shù)為71.5±3.8個；同樣，P53R175H突變組中，P53R175H?RKO?NC細胞的穿膜細胞數(shù)為48.6±4.1個，P53R175H?RKO?KLF5細胞的穿膜細胞數(shù)為87.5±5.7個，P53R175H?RKO?ShKLF5細胞的穿膜細胞數(shù)為39.3±3.8個。兩組各自組間的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖3）

③細胞增殖實驗：同樣結果顯示和侵襲實驗結論一致。在沒有P53R175H突變的RKO結腸癌細胞株中，KLF5的過表達能抑制細胞的增殖能力，而敲除KLF5的表達后，可以發(fā)現(xiàn)細胞的增殖能力明顯增加。而在P53R175H突變后的結腸癌細胞株RKO中，則出現(xiàn)相反的結果。（圖4）

圖3 細胞遷移實驗圖

圖4 細胞增殖實驗圖

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有生物特性的多樣性和局部組織器官特異性，結直腸粘膜所處的特定環(huán)境和上皮組織代謝特點決定結直腸癌發(fā)生和轉移機制的特殊性，控制結腸上皮細胞正常功能的一些關鍵因子起著重要作用。人類P53基因定位于染色體17p13.1，它像“分子警察”一樣，監(jiān)視著細胞基因組的完整性，而P53基因的突變使之失去野生型抑癌功能，獲得類似癌基因的功能，致細胞增殖失控，是腫瘤發(fā)生的一個重要原因。但是，盡管P53的突變或者功能丟失如此頻繁，是導致結腸癌形成的一個重要原因，但它并不能夠直接導致腫瘤的浸潤及轉移進展［7］。

KLF5屬于含有“鋅?手指”樣結構的蛋白家族成員，可以識別并結合靶基因促進子富含GC的序列部位，發(fā)揮促進基因表達的作用，在正常成熟組織，KLF5主要表達在消化道，以胃、小腸和大腸為最高。在胃癌、前列腺癌及乳腺癌的研究［6，8，9］，以及我們前期對結腸癌細胞株RKO的研究中，均提示KLF5是一個抑癌基因，但這些研究均尚未涉及到在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，P53基因的突變所造成的基因前后背景不同，而所導致的關鍵基因轉錄調控在這些過程中扮演了不同的角色。

本研究通過對常見的結腸癌細胞株進行P53突變以及KLF5蛋白水平表達的篩選，選取P53基因為野生型、同時KLF5表達量相對較低的細胞株RKO，以進行后續(xù)的基因過表達實驗。結果發(fā)現(xiàn)，在P53突變與否這種基因背景不同的情況下，KLF5的表達水平及基因功能發(fā)生了相應的變化。在高表達P53突變的結腸癌細胞株RKO中，KLF5的蛋白表達水平下降，而且其基因功能則從抑癌向促癌方向轉換，這為我們提供了一個新的視角去認識理解轉錄因子在前后相關聯(lián)的功能變化中所起的作用，也可以初步解釋研究者們在研究KLF5基因功能時出現(xiàn)不一致的結論。而對于P53突變是如何調控KLF5基因的表達水平及功能轉換，也將是我們進一步研究的方向。

參考文獻

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P53 mutation regulate the change of function and expression of KLF5 in the colon cancer cell

CAO Jiezhi1，LAI Dongming2，WU Heng2，CHU Zonghua2，ZENG Yujie2

1Department of Surgery，Baiyun District Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou，510470，China；2Department of Gastroenterology Surgery，Sun Yat?sen Memorial Hospital，Sun Yat?sen University，Guangzhou 510120，China.Corresponding author：ZENG，sumsyorky@hotmail.com

Objective To investigate P53 mutation impact on the function and expression of KLF5 in colon cancer cell.M ethods Take the colon cancer cell lines RKO as the research object，which was both lower KLF5 expression and P53 wild type，chosen from the common colon cancer cells by Western blot and Sanger sequencing.Construct the over?expression/knock?down cell RKO?PCDNA?KLF5 and RKO?PCDNA?shKLF5，RKO?P53R175H?KLF5 and RKO?P53R175H?shKLF5 by the plasmid and verified by Western blot.Transwell assay was used to examine the invasion and metastasis ability.MTS assay was used to examine the proliferation ability.Results In the colon cancer cell lines RKO which was P53 wild type，Transwell assays revealed that themigratory and invasive capacitieswere inhibited by over?expression of KLF5，aswell proliferation ability.And when the KLF5 was silent，the capacities of migratory and invasive，aswell as proliferation ability were enhanced obviously.On the contrastwith this result，the capacities ofmigratory，invasive and proliferation in the RKO?P53R175Hcellwith over?expres?sion KLF5 or silent KLF5 showed the opposite conclusion.At the same time，the protein level expression of KLF5 in the RKO?P53R175Hcell was declined，contrast to the RKO cell with P53 wild type.Conclu?sion In colon cancer cell lines RKO with high expression of P53 mutation，the protein expression of KLF5 levels dropped，and the gene function transformed from a tumor suppressor to the tumor promoter.

colon cancer；P53mutation；KLF5

R

A

10.3969/j.issn.1009?976X.2017.04.008

2017-06-13）

廣東省醫(yī)學科研基金（A2015554）

1510470廣州白云區(qū)中醫(yī)醫(yī)院外二科；2510120廣州中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院胃腸外科

*通信作者：曾育杰，Email：sumsyorky@hotmail.com