基于P53、Bax、Caspase-3基因表達探討竹節(jié)參水提取物對宮頸癌細胞增殖、凋亡的影響

陳紅梅 馮強 黎娟 陳鐵民

(儋州市中醫(yī)醫(yī)院，海南 儋州 571700)

宮頸癌是較為常見的生殖器官癌癥〔1〕，其嚴重危害女性身體心理健康。目前，臨床宮頸癌治療以手術(shù)及放化療為主，但由于化療藥物的神經(jīng)毒性、關(guān)節(jié)肌肉疼痛、脫發(fā)等毒副反應(yīng)及耐藥問題，使其臨床應(yīng)用受到了一定限制〔2〕?，F(xiàn)階段，宮頸癌的發(fā)病年齡逐漸年輕化〔3〕，死亡率也日益見長〔4〕，這給宮頸癌的防范與治療帶來更大的挑戰(zhàn)。目前，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，中草藥在宮頸癌的治療中發(fā)揮著積極作用〔5〕。竹節(jié)參又名竹節(jié)三七、竹節(jié)人參、白三七，為五加科植物竹節(jié)參(Panax japonicus C.A.Mey.)的干燥根莖,屬《中國藥典》多年收載的中藥材品種〔6〕。竹節(jié)參屬溫性藥材，味道甘中帶苦，能夠補腎益氣，還可以消散瘀滯、緩解疼痛、收斂止血、清肺化痰〔7,8〕，常用于大病初愈、產(chǎn)后虧虛、咳嗽上痰、跌打損傷者〔9〕。藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)〔10〕，竹節(jié)參具有抗炎、延緩衰老、降血糖及抗腫瘤作用。皂苷是竹節(jié)參的主要活性成分(約占 23.6%)，且三萜類皂苷具有較高含量，具有解熱、抗菌、抗癌等生物作用。竹節(jié)參具有較低的毒副作用，臨床使用時不宜產(chǎn)生耐藥性，且對惡心腫瘤具有良好的療效〔11〕，但是其與宮頸癌的相關(guān)研究較少，作用機制也不明晰。本研究基于P53、B細胞淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3基因表達探討竹節(jié)參水提取物對宮頸癌細胞增殖、凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1細胞、儀器 宮頸癌HeLa細胞；MCO-AC型CO2細胞培養(yǎng)箱；EPICS XL流式細胞儀；5910型高度冷凍離心機；Imagephoto圖像處理軟件；倒置熒光顯微鏡；PCR儀；DAPI staining solution。

1.2藥材 竹節(jié)參購自種植基地，經(jīng)專家鑒定為正品。把竹節(jié)參的根莖烘干蒸發(fā)掉水分后進行碾壓，收集粉狀后加入純凈水回流提取3次，將獲得的濾液進行濃縮，即為竹節(jié)參水提取物，提取率為25.8%，加入達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)基依次制成0、50、100、150 μg/ml濃度，分別為A、B、C、D組。

1.3細胞培養(yǎng) 取第3代培養(yǎng)的宮頸癌Hela細胞，0.25%乙二胺四乙酸(EDTA)進行消化，調(diào)整細胞濃度為1×105/ml，接種在96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μl，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中至單層細胞。將 0、50、100、150 μg/ml濃度竹節(jié)參水提取物分別加入宮頸癌Hela細胞中(100 μl/孔)，每種質(zhì)量濃度設(shè)置5個復(fù)孔，將培養(yǎng)板放置在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，連續(xù)進行24 h培養(yǎng)。

1.4HeLa細胞增殖活力 取培養(yǎng)好的HeLa細胞，挪至96孔板，A、B、C、D組各添加10 μl相應(yīng)劑量竹節(jié)參水提取物后加入噻唑藍(MTT)液，黑暗條件下靜置4 h后除培養(yǎng)基，加二甲基亞砜150 μl，震蕩后進行計算。

1.5HeLa細胞凋亡率 取A、B、C、D組細胞，消化后將細胞密度調(diào)至2 × 105ml，挪至96孔板，每孔200 μl，放入培養(yǎng)箱中24 h，滴加TUNEL檢測液(含TdT酶2 μl、熒光標記液48 μl)，避光孵育，熒光顯微鏡下觀察細胞情況，測定OD值，每張圖片取5個視野，在400倍下完成凋亡細胞核計數(shù)，獲得凋亡率。

1.6HeLa細胞周期 將生長良好的HeLa細胞濃度調(diào)整至1 × 105個/ml，接種至6孔板，24 h后更換培養(yǎng)基，48 h后加0.25%胰蛋白酶消化懸浮(無EDTA)，收集細胞。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，加3 ml乙醇(經(jīng)-20℃預(yù)冷)，混勻后與-20℃冰箱靜置1 d。測定前離心10 min(1 500 r/min，PBS沖洗2次，重懸于200 μl 0.1 mmol/L EDTA 溶液中，30 min避光孵育后加入35 μl 2% Tritonx-100、114 μl 150 μg/ml碘化丙啶(PI)溶液，充分混合后避光反應(yīng)10 min，測定細胞周期。

1.7HeLa細胞凋亡形態(tài) A、B、C、D組細胞離心10 min后去除上層清液，加入10 g/L蘇木素-伊紅(HE)染色液，避光10 min后去除染液，PBS 洗滌2次后涂片，晾干后在熒光顯微鏡下觀察形態(tài)。

1.8P53、Bax、Caspase-3 mRNA表達 提取P53、Bax、Caspase-3 RNA，RT-PCR測P53、Bax、Caspase-3 mRNA表達，引物序列P53：正義鏈5′-GCCAGTCTGATTTGTGGGCC-3′，反義鏈5′-GCCAGTTGTTTTTC TGCCAC-3′；Bax：正義鏈5′-GACTCCAAGCGCTGA GAATG-3′，反義鏈5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′；Caspase-3：正義鏈5′-TCCAGGCCGTATAG ATCCTFFTACA-3′，反義鏈5′-TCCAGGGCCGTATAGATATGGTACA-3′；β-actin：正義鏈5′-GGCACAC TCCAAGCGCTGAG-3′，反義鏈5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。設(shè)定PCR條件為30℃，10 min；42℃，30 min；99℃，5 min；5℃，5 min，連續(xù)進行35個循環(huán)，最后在72℃下完成10 min延長。擴增產(chǎn)物放入1.5%瓊脂凝膠中電泳，完畢后采用UVP凝膠圖像完成灰度值的測定，以β-actin為內(nèi)參。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件進行F檢驗。

2 結(jié) 果

2.1HeLa細胞增殖活力及凋亡率 A、B、C、D組細胞增殖活力隨竹節(jié)參水提取物濃度增加而逐漸減弱(P<0.001)；A、B、C、D組細胞凋亡率隨竹節(jié)參水提取物濃度增加而逐漸上升(P<0.001)，見圖1、表1。

圖1 HeLa細胞凋亡率

表1 HeLa細胞增殖活力

2.2HeLa細胞周期 隨著竹節(jié)參水提取物的濃度增加，Hela細胞G0/G1期顯著增加，S期顯著下降(P<0.001)，見表2。

表2 Hela細胞周期變化

2.3HeLa細胞凋亡形態(tài) A組未添加竹節(jié)參水提取物，HeLa細胞細胞核形態(tài)為卵圓狀，染色也較為均勻；B組添加竹節(jié)參水提取物后，部分HeLa細胞細胞核形態(tài)改變，出現(xiàn)縮小和濃縮現(xiàn)象，熒光現(xiàn)象也增強；C、D組細胞因提取物濃度增加，細胞核形態(tài)改變加劇，熒光亮度攀升，細胞核邊緣破碎，見圖2。

圖2 HeLa細胞凋亡形態(tài)(HE染色，×400)

2.4各組P53、Bax、Caspase-3 mRNA表達 P53、Bax、Caspase-3 mRNA表達隨竹節(jié)參水提取物濃度增加而顯著增加(均P<0.001)，見表3，圖3。

表3 各組P53、Bax、Caspase-3 mRNA表達

圖3 各組P53、Bax、Caspase-3 mRNA表達

3 討 論

現(xiàn)階段，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率逐漸攀升，患者也出現(xiàn)年輕化趨勢，呈現(xiàn)高患病率、高致死率和低治愈率的特征〔12〕。宮頸癌的發(fā)病機制較為復(fù)雜，與免疫功能低下、過早性行為、多個性伴侶、吸煙、多孕、多產(chǎn)等都有關(guān)?，F(xiàn)階段，臨床常用的治療宮頸癌的手段還是手術(shù)，同時患者可能接受放療或化療治療，雖然對這種治療方式對宮頸癌患者起到了一定的效果，但也存在一些局限性，手術(shù)切除后，部分患者可能出現(xiàn)病情復(fù)發(fā)，無法徹底治愈，遠期生存率較低等問題，而放化療則會出現(xiàn)復(fù)副作用大，患者不耐受以及耐藥性等問題〔13〕。近年來，多數(shù)研究人員發(fā)現(xiàn)中藥對于腫瘤的預(yù)防和治療具有較好效果，且副作用小，所以，中藥治療宮頸癌成為研究人員的研究重點。竹節(jié)參在臨床常用于治療跌打損傷、身體虧虛、咳嗽咯痰患者，是一種常見的中藥材。相關(guān)文獻記載，竹節(jié)參對于多種癌癥具有較好的抑制作用〔14～16〕。除此之外，竹節(jié)參水提取物能抑制血管的形成，有助于增強機體免疫功能。有研究表明〔17〕，竹節(jié)參具有抗炎及潛在的抗腫瘤作用，其水提取物能顯著增強機體免疫水平，能抑制腫瘤細胞的生長。

本研究結(jié)果表明，HeLa細胞的增殖活力隨竹節(jié)參水提取物劑量的增加而降低，即竹節(jié)參水提取物的濃度越高，HeLa細胞的增殖活力越弱，這提示竹節(jié)參水提取物可以抑制HeLa細胞的增殖活力，王開元等〔15〕在竹節(jié)參的化學(xué)成分與藥理活性研究進展中也有提到，竹節(jié)參提取物可以抑制胃癌細胞的增殖，這與本研究結(jié)果相類似。本研究結(jié)果提示竹節(jié)參水提取物能夠誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡，且其濃度越大，誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡的能力越強，并且關(guān)于竹節(jié)參水提取物誘導(dǎo)癌細胞凋亡這一觀點，在張瑩等〔18〕關(guān)于竹節(jié)參與胃癌的研究中也有提到。本研究流式細胞儀測定結(jié)果說明竹節(jié)參水提取物多作用于細胞生長初期，這與劉瀅等〔19〕研究結(jié)果相一致。本文還通過HE染色觀察細胞形態(tài)，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)竹節(jié)參水提取物作用的HeLa細胞細胞核形態(tài)為卵圓狀，染色也較為均勻；而經(jīng)竹節(jié)參水提取物作用后，HeLa細胞細胞核形態(tài)改變，濃度越高，縮小、濃縮、熒光現(xiàn)象越明顯，細胞核的染色質(zhì)的凝聚增強，甚至部分細胞核邊緣化，裂解,出現(xiàn)凋亡小體，這在劉瀅等〔19〕研究中也有提及，證實了竹節(jié)參水提取物誘導(dǎo)細胞凋亡的作用。

細胞凋亡區(qū)別于細胞壞死，其過程不是被動的過程，而是主動的過程，多涉及基因的激活、表達與調(diào)控作用，是為了更好地適應(yīng)生存而主動爭取的一種死亡過程〔20〕。而癌細胞是種變異的細胞，與正常細胞不同，它可以無限增殖、遷移、侵襲，破壞機體平衡，導(dǎo)致細胞凋亡紊亂，危害患者生命安全。P53是抑癌基因，其能夠促進癌細胞凋亡，阻止正常細胞發(fā)生癌變。但P53易發(fā)生突變，突變型P53起原癌基因的作用，抑制細胞凋亡并促進細胞惡性轉(zhuǎn)化〔21〕。Bax 基因是細胞凋亡的促進基因，也是機體內(nèi)重要的凋亡基因。Caspase-3與細胞凋亡密切相關(guān)，其容易活化，在CTL細胞殺死中占據(jù)重要位置。本研究結(jié)果提示竹節(jié)參水提取物可以增加凋亡基因表達，推進腫瘤細胞凋亡進程。