miRNA在膿毒癥治療中研究進(jìn)展

孫文杰 霍景瑞 賈力 劉英富

(1滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校,河北 滄州 061000；2滄州市納米抗體技術(shù)創(chuàng)新中心)

最新膿毒癥國際共識定義為機(jī)體對感染的反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致的危及生命器官功能障礙〔1〕。膿毒癥是一個(gè)全球性公共衛(wèi)生問題，是感染導(dǎo)致死亡的主要原因，據(jù)統(tǒng)計(jì)在ICU中膿毒癥的死亡率要高達(dá)20%～45%〔2〕。膿毒癥的高死亡率與延遲診斷和治療不當(dāng)有直接關(guān)系。膿毒癥的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且尚未完全明確，目前其治療手段以抗感染、液體復(fù)蘇、血流動(dòng)力學(xué)支持等為主。免疫治療相關(guān)靶點(diǎn)藥物，包括腫瘤壞死因子(TNF)-α拮抗劑、程序性死亡分子(PD)-1、白介素(IL)-7、干擾素(IFN)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、高遷移率族蛋白(HMG)B1等在實(shí)驗(yàn)階段取得了一定進(jìn)展，但是臨床療效還未明確〔3〕。微小RNA(miRNA)在細(xì)胞和體液中廣泛存在，廣泛調(diào)控免疫細(xì)胞的行為及免疫、炎癥反應(yīng)、臟器損傷等多種生理病理過程〔4,5〕，在膿毒癥的各個(gè)階段發(fā)揮調(diào)控作用，有可能成為新型膿毒癥治療靶點(diǎn)，具有重要的研究意義。

1 miRNA的特征及疾病中的應(yīng)用

miRNAs是一類21～25個(gè)核苷酸組成的小分子非編碼RNA，在細(xì)胞質(zhì)中合成，以核糖體蛋白復(fù)合物、脂質(zhì)囊泡、外泌體等形式釋放到細(xì)胞外，不被核糖核酸酶(RNase)消化，在一些體液中穩(wěn)定存在〔6〕。miRNAs通過囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)或蛋白載體機(jī)制被細(xì)胞輸出或輸入，介導(dǎo)組織間的旁分泌和內(nèi)分泌的通訊，從而調(diào)節(jié)遠(yuǎn)端細(xì)胞功能。大部分miRNAs靶向mRNA，抑制mRNA轉(zhuǎn)錄后翻譯或降解mRNA使基因沉默〔7〕，也有少部分誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄或上調(diào)蛋白的表達(dá)〔8〕。

目前在人類基因組中已發(fā)現(xiàn)2 000～3 000個(gè)miRNAs，廣泛調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖、凋亡途徑，參與調(diào)節(jié)代謝、造血分化、免疫及炎癥反應(yīng)等多種生理過程。miRNAs臨床應(yīng)用需要搭載有效的載體，保護(hù)其免受RNase降解并遞送至感染部位。生物體內(nèi)miRNAs的理想載體是外泌體，干細(xì)胞來源的外泌體有望代替干細(xì)胞移植療法用于疾病治療〔9〕，而miRNAs的人工載體包括無機(jī)材料載體、脂質(zhì)納米載體等也取得了一定進(jìn)展〔10〕。目前miRNAs的研究領(lǐng)域逐漸擴(kuò)大，涉及腫瘤、帕金森病、阿爾茨海默病、肥胖、糖尿病、心血管疾病、膿毒癥等多種疾病〔4,5〕，miRNAs具有成為新型藥物靶點(diǎn)的潛力，成為多種疾病研究的熱點(diǎn)。

2 miRNA與膿毒癥的治療

膿毒癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，除了病原微生物及其毒素的直接損傷作用，感染導(dǎo)致機(jī)體炎癥激活狀態(tài)和免疫功能紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致器官功能障礙甚至危及生命。目前膿毒癥的治療手段和治療藥物都收效有限〔2,3〕。膿毒癥中多種miRNAs異常表達(dá)，通過介導(dǎo)細(xì)胞間信息傳遞和調(diào)控基因表達(dá)，調(diào)控免疫細(xì)胞等增殖、分化、凋亡過程，并調(diào)控抗體產(chǎn)生、炎癥介質(zhì)釋放等過程。miRNAs對膿毒癥過程中通過調(diào)控Toll樣受體(TLR)信號傳導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)炎癥因子的產(chǎn)生〔11,12〕。miRNAs可調(diào)節(jié)膿毒癥中內(nèi)皮細(xì)胞的功能，減輕微血管功能障礙，減輕組織器官損傷〔13,14〕。miRNAs參與膿毒癥的固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答〔15〕免疫抑制及抗感染作用。miRNAs在膿毒癥的各個(gè)階段發(fā)揮調(diào)控作用，有潛力成為新型膿毒癥治療靶點(diǎn)。

2.1miRNA與抗炎作用 膿毒癥的主要機(jī)制之一是感染激活炎癥反應(yīng)，經(jīng)一系列炎癥因子級聯(lián)瀑布反應(yīng)，形成過度炎癥狀態(tài)。miR-146a是脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和器官損傷的有效負(fù)調(diào)節(jié)劑。在LPS誘導(dǎo)膿毒癥模型中，miR-146a過表達(dá)通過靶向酪氨酸蛋白激酶受體(ErbB)4基因，抑制IL-1受體相關(guān)激酶(IRAK)1和TNF-α受體相關(guān)因子(TRAF)6的表達(dá)，抑制核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)的活化，降低TNF-α和IL-1β等促炎因子水平，減少細(xì)胞損傷和凋亡，減輕LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和心肌功能障礙〔16〕。LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中，miR-146a水平升高，通過靶向跨膜受體Noth蛋白(Notch)1基因，降低IL-1β、IL-6和趨化因子配體(CCL)-2水平，抑制NF-κB激活，減輕炎癥反應(yīng)及臟器損傷〔17〕。

miR-23b在膿毒癥中也具有抗炎和保護(hù)臟器的作用。在膿毒癥患者外周血單核細(xì)胞和LPS誘導(dǎo)的單核細(xì)胞中miR-23b表達(dá)下調(diào)，miR-23b通過靶向金屬蛋白酶(ADAM)10基因，抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡，減輕炎癥反應(yīng)〔18〕。Cao等〔19〕發(fā)現(xiàn)膿毒癥性心肌病患者早期miR-23b上調(diào)，miR-23b過表達(dá)通過靶向髓樣分化因子初次應(yīng)答基因(MyD)88基因調(diào)控TRAF6和NF-κB抑制物激酶(Iκκ)β，抑制NF-κB活化，減少心肌細(xì)胞凋亡和炎性因子分泌，減輕炎癥反應(yīng)，提高生存率，是在膿毒癥性心肌病的潛在早期療法。

miR-223、miR-718、miR-181a通過多靶標(biāo)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。Wang等〔20〕發(fā)現(xiàn)，在盲腸結(jié)扎穿刺(CLP)膿毒癥模型中，miR-223-3p和miR-223-5p顯著下調(diào)，miR-223通過負(fù)向調(diào)控信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子(STAT)-3和IL-6，抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)膿毒癥性心肌損傷。miR-718通過靶向腫瘤抑制性磷酸酶與張力蛋白同源性基因(PTEN)基因，調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇激酶/絲氨酸激酶(PI3K/Akt)信號，促進(jìn)Akt磷酸化，抑制促炎因子IRAK1和NF-κB的產(chǎn)生，而且磷酸化的Akt誘導(dǎo)miR-let-7e表達(dá)，下調(diào)TLR并弱化促炎信號，減輕炎癥反應(yīng)〔11〕。miR-181a通過直接抑制TLR4的表達(dá)、抑制NF-κB活化和活性氧的積累，減少炎癥因子的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎作用〔12〕。

此外，還有很多miRNA在膿毒癥中具有調(diào)控炎癥反應(yīng)的作用。miR-15a/16抑制LPS誘導(dǎo)膿毒癥炎癥途徑的關(guān)鍵分子TLR4和IRAK-1，在新生兒膿毒癥的炎癥反應(yīng)調(diào)控中起重要作用〔21〕。Xu等〔22〕研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者血清中的miR-19b-3p水平比健康對照組顯著降低，而存活組的膿毒癥患者與非存活組相比miR-19b-3p水平顯著較高。miR-19b-3p的過表達(dá)可以降低IL-6和TNF-α水平，減輕LPS誘導(dǎo)的膿毒癥炎癥反應(yīng)，可能是膿毒癥患者診斷和預(yù)后的潛在靶標(biāo)。

2.2miRNA與增強(qiáng)免疫功能 在膿毒癥進(jìn)程中，免疫抑制狀態(tài)長時(shí)間持續(xù)存在，固有免疫失衡，樹突細(xì)胞(DC)和巨噬細(xì)胞的抗原提呈能力降低，T細(xì)胞和免疫抑制細(xì)胞因子在損傷部位大量聚集，患者極易受到繼發(fā)性感染〔23〕，與膿毒癥后期的高死亡率直接相關(guān)。因此，增強(qiáng)免疫功能對膿毒癥治療尤為重要。

miR-155是調(diào)節(jié)免疫抑制的潛在靶點(diǎn)。精氨酸酶(Arg)2是DC中主要的酶，miR-155靶向Arg2 mRNA抑制其表達(dá)，通過控制細(xì)胞外精氨酸的利用來調(diào)控T細(xì)胞活化〔24〕。CD39+T細(xì)胞具有免疫抑制的作用。miR-155可以誘導(dǎo)CD39+T細(xì)胞增加，增強(qiáng)免疫抑制，而抑制miR-155可以減少CD39+T細(xì)胞，改善免疫抑制狀態(tài)〔15〕。

髓樣抑制細(xì)胞(MDSC)可以促進(jìn)免疫抑制狀態(tài)。在膿毒癥中miR-21和miR-181b通過誘導(dǎo)髓系祖細(xì)胞成熟分化，增加MDSC數(shù)量，抑制miR-21和miR-181b可減少M(fèi)DSC，改善免疫抑制狀態(tài)〔25〕。還有研究發(fā)現(xiàn)，miR-375通過阻斷酪氨酸激酶(JAK)2-STAT3途徑，下調(diào)miR-21水平，調(diào)控MDSC數(shù)量，削弱免疫抑制，參與晚期膿毒癥的調(diào)節(jié)〔26〕。

miRNAs還具有調(diào)控T細(xì)胞功能的作用。在膿毒癥中，miR-31調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡狀態(tài)，miR-31表達(dá)下調(diào)促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Th2表型轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)高炎癥狀態(tài)到免疫抑制狀態(tài)的轉(zhuǎn)變〔27〕。miR-31在敗血性CD4+T細(xì)胞中的作用，有助于免疫制劑機(jī)制的研究和開發(fā)miRNA對膿毒癥診療的新方法。

2.3miRNA與器官保護(hù)作用 膿毒癥通常會導(dǎo)致器官功能受損，多器官功能障礙綜合征是主要致死原因，而器官保護(hù)是治療膿毒癥的一個(gè)重要原因。

短暫性缺血引起的缺血預(yù)處理是器官保護(hù)的先天機(jī)制。腎臟缺血預(yù)處理可誘導(dǎo)miR-21上調(diào)，miR-21在外泌體和遠(yuǎn)端器官中表達(dá)增加，減少對應(yīng)器官中的細(xì)胞凋亡和炎癥因子的產(chǎn)生〔28〕。外泌體遞送miR-21在膿毒癥急性腎損傷中具有抗炎、抗細(xì)胞凋亡、保護(hù)臟器的作用〔29〕，是其有效的治療策略。

膿毒癥誘導(dǎo)心肌損傷的潛在機(jī)制包括心肌收縮力受損、過度炎癥、氧化應(yīng)激、心肌細(xì)胞凋亡等。miR-30a-3p過表達(dá)通過PTEN/PI3K/AKT信號途徑減少膿毒癥誘導(dǎo)心肌細(xì)胞和肺組織細(xì)胞的凋亡，具有保護(hù)膿毒癥性心肌病和肺損傷的作用〔30,31〕。miR-18a-5p過表達(dá)通過下調(diào)Notch2表達(dá)，抑制內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和心臟纖維化〔13〕。內(nèi)皮祖細(xì)胞來源的外泌體通過體外遞送miR-126-3p和miR-126-5p抑制內(nèi)皮細(xì)胞中HMGB1及血管細(xì)胞黏附分子(VCAM)-1水平，減輕膿毒癥性器官損傷，預(yù)防微血管功能障礙〔14〕。Zheng等〔32〕研究發(fā)現(xiàn)在膿毒癥患者血清中miR-135a上調(diào)，通過p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/NF-κB途徑加重了膿毒癥誘導(dǎo)的心肌炎癥反應(yīng)和心臟功能障礙，而miR-135a抑制劑通過調(diào)節(jié)p38 MAPK/NF-κB途徑，能夠改善膿毒癥誘導(dǎo)的心肌性疾病。在CLP膿毒癥模型中miR-214表達(dá)上調(diào)、miR-214過表達(dá)、減輕炎癥反應(yīng)和心肌細(xì)胞凋亡，對膿毒癥誘發(fā)心肌損傷具有保護(hù)作用〔33〕。

2.4miRNA與抗感染作用 miRNAs可以調(diào)節(jié)宿主對抗微生物感染的防御能力，對繼發(fā)性膿毒癥患者抗感染的防治有重要意義。

miRNAs具有抗細(xì)菌作用。結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)miR-125a-3p上調(diào)，靶向巨噬相關(guān)基因(UVRAG)基因，抑制吞噬體的成熟和自噬，而抑制miR-125a的表達(dá)可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能和殺菌活性〔34〕。沙門菌通過上調(diào)腸道上皮miR-128的表達(dá)，抑制M-CSF及其介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞募集，促進(jìn)細(xì)菌存活，而抑制miR-128可增加巨噬細(xì)胞募集，抑制沙門氏菌感染〔35〕。

miRNAs具有抗真菌作用。miR-132-5p和miR-212-5p在煙曲霉和白色念珠菌感染期間調(diào)節(jié)靶基因FK506結(jié)合蛋白(FKBP)1B基因、Kruppel樣因子(KLF)4基因、多殺菌素合成基因(SPN)的表達(dá)，調(diào)控自然殺傷細(xì)胞(NK)和DC等先天免疫細(xì)胞抗真菌的免疫作用〔36〕。miR-204和miR-211通過負(fù)調(diào)控血紅素加氧酶(Hmx)1表達(dá)，介導(dǎo)了機(jī)體免疫抑制和念珠菌感染型膿毒癥引起的腎臟損傷，而miR-204/miR-211模擬物可以顯著下調(diào)Hmx1，改善念珠菌引起的腎臟損傷〔37〕。

miRNAs還具有抗病毒作用。腸道病毒(EV)-71通過誘導(dǎo)宿主細(xì)胞中miRNA-146a上調(diào)，抑制IFN產(chǎn)生，而抑制miR-146a可上調(diào)IRAK1和TRAF6的表達(dá)，增加IFNβ的產(chǎn)生，抑制病毒繁殖并提高感染小鼠的存活率，用于防治EV感染〔38〕。寡核苷酸抑制劑(RG)-101靶向miR-122，通過調(diào)控NK細(xì)胞，調(diào)控IFN水平，顯著降低丙型肝炎病毒載量，發(fā)揮抗病毒作用〔39〕。miR-134通過調(diào)控RAS相關(guān)核蛋白(RAN)調(diào)節(jié)脊髓灰質(zhì)炎病毒、EV71等病毒的復(fù)制〔40〕，為抗病毒感染提供了一種新方法。

2.5miRNA的載體 基于miRNAs的療法可能是抗過度炎癥反應(yīng)、增強(qiáng)免疫應(yīng)答、抗微生物治療、保護(hù)臟器功能的有效手段，miRNAs有潛力成為治療膿毒癥的新型靶點(diǎn)，但其臨床使用仍存在一些問題，包括核酸的陰離子電荷、親水性及給藥方法和藥物設(shè)計(jì)需要保護(hù)miRNA模擬物/拮抗劑免受循環(huán)RNase降解、遞送系統(tǒng)須確保將miRNAs有效遞送至感染部位等。天然存在的miRNAs可以通過液囊或與其相連的蛋白質(zhì)來保護(hù)其免受RNase降解，但治療性引入的miRNAs需要搭載有效的載體，才能順利進(jìn)入細(xì)胞并發(fā)揮治療效果。

在生物體，外泌體是miRNAs的理想載體。外泌體是一類由細(xì)胞產(chǎn)生的30～100 nm的胞外囊泡，具有穩(wěn)定、兩親特性、免疫原性低、跨生物屏障等特點(diǎn)，可以作為miRNAs的輸送載體轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞間的miRNAs等發(fā)揮細(xì)胞間通訊作用〔41〕。外泌體可以用于膿毒癥及其相關(guān)臟器損傷的治療，在炎癥反應(yīng)、免疫抑制、抗原呈遞、抗體產(chǎn)生及血管修復(fù)等過程中起重要的調(diào)節(jié)作用〔9，41〕。而且，從間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)純化的外泌體可起到與MSC相似的治療效果，有望代替MSC干細(xì)胞移植療法治療膿毒癥〔9〕。Zhang等〔42〕通過研究證明，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體通過上調(diào)miR-146b水平降低IRAK1表達(dá)，導(dǎo)致NF-κB活性受到抑制，并最終減輕膿毒癥性腎損傷并改善膿毒癥小鼠的存活率，可能成為治療膿毒癥相關(guān)腎損傷的新型治療藥物。Wang等〔43〕研究發(fā)現(xiàn)野生型間充質(zhì)干細(xì)胞含有miR-223的外泌體通過miR-223向受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移而減輕膿毒癥觸發(fā)的心肌抑制，下調(diào)信號素(Sema)3A和Stat3的表達(dá)，從而減少炎癥反應(yīng)和細(xì)胞死亡，可對膿毒癥小鼠提供心臟保護(hù)作用。

miRNAs的人工合成載體也取得一定進(jìn)展。據(jù)研究，脫乙?；木?N-乙?；咸前?DEAC-pGlcNAc)納米載體具有良好的生物相容性和非特異性的抗菌性，可以作為miRNAs 載體，在膿毒癥小鼠模型中有效地遞送miRNA-126-5p免受RNase的破壞，并通過熒光標(biāo)記成功將其傳遞到細(xì)胞核中，顯著提高膿毒癥小鼠的存活率〔44〕。此外，miRNAs的病毒載體、無機(jī)材料載體、脂質(zhì)納米載體、樹狀聚合物的載體、細(xì)胞衍生膜囊泡、3D支架載體在多種疾病研究中都取得了一定進(jìn)展〔10〕，為miRNAs作為新的膿毒癥治療靶點(diǎn)和治療途徑奠定了基礎(chǔ)。

綜上，膿毒癥是ICU患者高死亡率的主要原因，大量研究證實(shí)miRNAs在膿毒癥的抗炎、抗感染、增強(qiáng)免疫功能及臟器保護(hù)方面具有重要的調(diào)節(jié)作用，但其潛在機(jī)制還不明確。研究結(jié)果之間存在差異，可能是由于研究多在ICU或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行，研究設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)樣本等存在差異。miRNAs種類繁多，廣泛參與細(xì)胞活動(dòng)，涉及很多信號通路，同一個(gè)miRNA可能在感染的不同階段調(diào)節(jié)不同的靶標(biāo)，或同時(shí)靶向多靶標(biāo)產(chǎn)生不同的功能，因此miRNAs的應(yīng)用中可能產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，限制其療效和安全性，需要探索其確切機(jī)制提高研究的可重復(fù)性。患病時(shí)長的差異也會在數(shù)據(jù)中產(chǎn)生干擾，miRNAs水平的縱向研究將提供膿毒癥進(jìn)程中miRNAs表達(dá)譜的變化，還需要實(shí)驗(yàn)研究區(qū)分出最有效的干預(yù)靶點(diǎn)，并探討如何隨著疾病進(jìn)展交替調(diào)節(jié)miRNAs治療膿毒癥。隨著研究的深入，miRNAs可能會成為新型的膿毒癥治療靶標(biāo)，通過調(diào)控炎癥反應(yīng)和免疫功能等，改善患者預(yù)后、降低死亡率、改變膿毒癥的治療策略。