CircRNA影響NSCLC增殖、侵襲相關(guān)信號通路研究進(jìn)展

高圣鈺 劉爽 魏微微 李萌 陳思宇 孟凡石

(佳木斯大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院普外一科，黑龍江 佳木斯 154002；2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

肺癌(LC)患病率和病死率在全球范圍內(nèi)呈逐年遞增趨勢。2018年全球癌癥協(xié)會統(tǒng)計全球新增病例約有209萬和死亡病例約有176萬〔1〕。LC現(xiàn)在已經(jīng)成為全球最常見的惡性腫瘤和致死原因之一〔2〕。依據(jù)組織病理學(xué)可以將LC分為占80%～85%非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)及占15%～20%小細(xì)胞肺癌(SCLC)〔3〕。雖然近代醫(yī)學(xué)在診斷技術(shù)及治療手段 (包括手術(shù)、放療和化療)方面不斷進(jìn)步，但大部分LC患者就診時已進(jìn)入晚期〔4〕。Sun等〔4〕報道早期LC可以治愈，所以確定LC生物標(biāo)志物或治療靶點對降低死亡率和改善臨床預(yù)后具有重大意義。隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析技術(shù)的發(fā)展，許多研究表明環(huán)狀RNA(CircRNA)在癌癥中影響細(xì)胞侵襲、遷移和增殖。Yao等〔5〕通過分析來自寧波第二醫(yī)院的94例肺腺癌(LUAD)組織和臨近正常組織發(fā)現(xiàn)，circ-0006427在LUAD中表達(dá)活躍，調(diào)高Dicckkopf相關(guān)蛋白(DKK)1的表達(dá)量，可以使Wnt/β-catenin信號通路失活，抑制LUAD的增殖、遷移和侵襲。CircRNAs是蛋白質(zhì)編碼基因的完整外顯子產(chǎn)生的，其通過反向剪接的過程生成。由于缺少游離的3′或5′末端，CircRNAs的半衰期較長，這使其對線性RNA衰變的常規(guī)機(jī)制具有抵抗力。此外有研究表明CricRNAs可以通過信號通路影響癌組織的轉(zhuǎn)移、增殖及侵襲，可以為LC的治療提供新的靶點。然而CircRNAs通過影響信號通路調(diào)節(jié)LC的分子機(jī)制尚未完全明確。本文就CircRNAs通過信號通路影響NSCLC發(fā)生發(fā)展的進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)。

1 CircRNA的生物學(xué)功能

CircRNAs是一種特殊的非編碼RNA分子，CircRNAs的結(jié)構(gòu)是共價封閉的環(huán)，在3′端沒有聚腺苷酸尾，在5′端沒有帽狀結(jié)構(gòu)，其大小為100 bp至4 kb〔6～9〕。CircRNA的特殊結(jié)構(gòu)使它更耐核糖核酸酶(RNase)或RNA外核酶降解。CircRNAs的功能是可以作為miRNA的海綿參與細(xì)胞的生物學(xué)過程，還可以調(diào)節(jié)親本基因的轉(zhuǎn)錄，同時能作為蛋白質(zhì)之間的銜接子發(fā)揮作用及具有蛋白質(zhì)翻譯功能〔2，7，10，11〕。Militello等〔12〕研究表明CircRNAs可能是腫瘤中的特殊分子標(biāo)記物。

2 CircRNAs調(diào)控信號通路參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展

2.1CircRNA與Wnt信號通路 Wnt/β-catenin是經(jīng)典的信號通路〔13〕。Peng等〔14〕報道circRNAs通過影響Wnt通路的激活與失活調(diào)節(jié)癌癥的發(fā)生進(jìn)展。Wan等〔15〕對隸屬于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院的同濟(jì)醫(yī)院病理科，經(jīng)病理確診的78例NSCLC患者癌與癌旁組織及NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、NCI-H460進(jìn)行熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-qPCR)定量檢測，結(jié)果顯示circ-E3泛素化蛋白鏈接酶(ITCH)在NSCLC組織和NSCLC細(xì)胞系(A549、NCI-H460)中表達(dá)量降低。通過調(diào)高體外NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549和NCI-H460中circ-ITCH表達(dá)量，circ-ITCH可以競爭性的抑制miR-7和miR-214與ITCH相結(jié)合，促進(jìn)ITCH表達(dá)水平增高。而ITCH是E3泛素連接酶的成員，該酶可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、免疫反應(yīng)及癌癥的進(jìn)展。所以當(dāng)ITCH表達(dá)活躍后可以促進(jìn)磷酸化蓬亂蛋白(Dvl)2的降解使Wnt/β-catenin信號失活〔16〕，導(dǎo)致通路下游調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附的β-catenin、參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞生長的原癌基因(c-Myc)及參與調(diào)控細(xì)胞周期的細(xì)胞周期素D1表達(dá)失活，從而抑制NSCLC細(xì)胞增殖。Yao等〔17〕通過對寧波市第二醫(yī)院收集的72對原發(fā)性LVAD患者的癌與癌旁組織進(jìn)行微陣列分析，發(fā)現(xiàn)circ-0001946表達(dá)量升高。同時應(yīng)用RT-qPCR對LUAD細(xì)胞系(H1299、A549、Calu3、 SPC-A1)中circ-0001946的含量進(jìn)行測定，結(jié)果表明circ-0001946在四組細(xì)胞系中表達(dá)活躍。應(yīng)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)降低A549和H1299細(xì)胞系中circ-0001946表達(dá)量可以明顯抑制LAC體外細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而后通過生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測miR-135a-5p的下游靶基因為沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)1，而SIRT1是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性脫乙酰基酶，可以調(diào)節(jié)Wnt信號通路的激活〔18〕。所以當(dāng)circ-0001946與miR-135a-5p結(jié)合，SIRT1表達(dá)活躍使Wnt/β-catenin通路激活，導(dǎo)致通路下游調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附的β-catenin、參與細(xì)胞增殖和細(xì)胞生長的原癌基因(c-Myc)及調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的細(xì)胞周期素D1表達(dá)活躍，從而促進(jìn)LUAD的增殖。Gao等〔19〕應(yīng)用微陣列分析技術(shù)和RT-qPCR技術(shù)分別檢測從吉林大學(xué)中日聯(lián)合醫(yī)院收集的LUAD癌組織及其臨近的正常組織及LUAD細(xì)胞系(A549、SPC-A1、H1299、PC-9)中circ-SOX4的表達(dá)量，結(jié)果表明circ-SOX4在LUAD組織和細(xì)胞系中表達(dá)活躍。當(dāng)circ-SOX4表達(dá)下調(diào)后，miR-1270與多形性腺瘤基因樣(PLAGL)2相結(jié)合，導(dǎo)致PLAGL2表達(dá)量降低，而PLAGL2是一個假定C2h2鋅指轉(zhuǎn)錄因子，其異常激活可以調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路激活導(dǎo)致細(xì)胞增殖失調(diào)，促進(jìn)癌癥的發(fā)生〔20〕，所以PLAGL2表達(dá)失調(diào)后抑制Wnt通路激活，抑制其下游調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和黏附的連環(huán)蛋白β1、參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的細(xì)胞周期蛋白(CCND)1、同樣起調(diào)節(jié)細(xì)胞周期作用的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)2及調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的原癌基因c-Myc和影響癌細(xì)胞侵襲性的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2的表達(dá)，從而抑制LUAD中細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和腫瘤生長。此外在A549和H299細(xì)胞株中上調(diào)circ-SOX4的表達(dá)量，可以抑制miR-1270活性，增加PLAGL2表達(dá)量，同時提高CD44和N-鈣黏蛋白的蛋白質(zhì)水平，降低E-鈣黏蛋白的水平，繼而促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。

2.2CircRNA與PI3K信號通路 PI3K/PKB又稱磷酸肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路，其可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡，PI3K/PKB通路的異常激活可能與惡性腫瘤密切相關(guān)〔21〕。Wu等〔21〕通過研究檢測60例NSCLC癌與癌旁組織中circ-環(huán)乙酰輔酶A羧化酶α(ACACA)的表達(dá)量，結(jié)果顯示其表達(dá)量上調(diào)。通過抑制體外細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299中circ-ACACA的表達(dá)。circ-ACACA活性降低誘導(dǎo)磷酸酶和張力蛋白同系物(PTEN)激活，而PTEN作用機(jī)制是通過抑制PI3K途徑下調(diào)信號傳導(dǎo)的能力，繼而抑制腫瘤細(xì)胞的發(fā)展〔22〕。所以PTEN表達(dá)活躍抑制PI3K/PKB信號通路下游靶基因p-PI3K/t-PI3K和p-PKB/t-PKB表達(dá)，從而抑制NSCLC的增殖和遷移。此外，circ-ACACA與miR-1183有結(jié)合位點，調(diào)高體外A549和H1299細(xì)胞系中circ-ACACA的表達(dá)量，導(dǎo)致miR-1184的活性降低，導(dǎo)致NSCLC細(xì)胞系中與細(xì)胞分化有關(guān)的c-Myc、與細(xì)胞遷移有關(guān)的明膠酶MMP9和與糖醇解有關(guān)的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT)-1的蛋白水平升高，結(jié)果顯示circ-ACACA的表達(dá)上調(diào)顯著激活c-Myc、MMP9、GLUT-1蛋白活性，從而促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖和遷移并增強(qiáng)了瓦伯格效應(yīng)。Bai等〔23〕對收集于煙臺市玉皇頂醫(yī)院的51例經(jīng)病理確診的NSCLC組織和鄰近正常組織及購買于首爾國立大學(xué)醫(yī)學(xué)院的A549、H1299細(xì)胞株進(jìn)行RT-qPCR測量，結(jié)果顯示circ蛋白激酶Cα(PRKCA)在NSCLC組織和A549、H1299細(xì)胞系中表達(dá)活躍。通過沉默NSCLC細(xì)胞系中circPRKCA表達(dá)，導(dǎo)致miR-330-5p活躍。而miR-330-5p可以與3-磷酸肌醇依賴性激酶(PDK)-1 3′非翻譯編碼區(qū)(UTR)結(jié)合，削弱PDK1的表達(dá)。而PDK1屬于AGC激酶家族，代表PI3K途徑的關(guān)鍵節(jié)點〔24〕。所以PDK1活躍度降低抑制PI3K/PKB信號通路激活，導(dǎo)致其下游PKB磷酸化水平降低，從而抑制NSCLC細(xì)胞外活力、遷移、侵襲。

2.3CircRNA與核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號通路 NF-κB信號通路在癌癥的進(jìn)展中起重要作用，NF-κB可以參與調(diào)節(jié)癌癥基因的表達(dá)，影響癌細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡〔25〕。Zhou等〔26〕對收集于中國科學(xué)院大學(xué)腫瘤醫(yī)院的32例LUAD組織和鄰近正常組織進(jìn)行檢測，結(jié)果表明circ_cMras在LUAD組織中表達(dá)降低。熒光定量PCR技術(shù)測得LUAD細(xì)胞系A(chǔ)549、HCC827中circ_cMras水平降低。表明通過使A549、HCC827細(xì)胞系中circ_cMras異常表達(dá)，可以降低LUAD細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，加快細(xì)胞凋亡。其機(jī)制是通過轉(zhuǎn)染調(diào)高細(xì)胞系A(chǔ)549、HCC827中circ_cMras表達(dá)量，使ABHD5活躍，而ABHD5是含α-β水解酶結(jié)構(gòu)域5，是脂肪甘油三酸酯脂肪酶(ATGL)介導(dǎo)的脂解的高度保守的調(diào)節(jié)劑〔27〕。ABHD5可以通過脂多糖依賴性激活相關(guān)通路抑制癌細(xì)胞的合成代謝〔10〕。所以當(dāng)ABHD5表達(dá)上調(diào)，ABHD5作為ATGL的共激活因子協(xié)同上調(diào)，從而抑制NF-κB通路激活，使其下游p-P65磷酸化活性下降，抑制LUAD細(xì)胞的遷移、增殖，加速細(xì)胞凋亡。

2.4CircRNA與絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路 CircRNA通過調(diào)節(jié)MAPK信號通路激活或失活，影響細(xì)胞分化、凋亡、血管生成、增殖和腫瘤擴(kuò)散〔28〕。circ-ZKSCAN1(hsa_circ_0001727) 是 一 種 來 源 于 ZKSCAN1基因第二和第三外顯子(全長668 bp)的RNA〔29〕。Wang等〔29〕通過對收集于青島大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科的107例NSCLC癌與癌旁組織進(jìn)行RT-qPCR檢測，結(jié)果表明circ-ZKSCAN1在NSCLC組織中表達(dá)量增高。同時在NSCLC細(xì)胞系(A549、H1299)中circ-ZKSCAN1也同樣檢測到其水平升高。表明在細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299中敲除Circ-ZKSCAN1，可以減慢細(xì)胞增殖、遷移，同時加快細(xì)胞的凋亡。此外，circ-ZKSCAN1高表達(dá)可以與miR-330-5p結(jié)合，抑制miR-330-5p與FAM83A的3′UTR區(qū)域結(jié)合。而FAM83A是具有序列相似性家族成員A，其位于8號染色體上參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡〔28，29〕。FAM83A可以通過抑制MAPK通路發(fā)揮作用，所以當(dāng)FAM83A表達(dá)活躍，導(dǎo)致MAPK通路失活。其下游參與細(xì)胞凋亡的c-Jun氨基末端激酶(JNK)和同樣參與細(xì)胞凋亡的促分裂原激活的蛋白激酶(p38)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)表達(dá)量降低，從而促進(jìn)NSCLC增殖分化、遷移及減緩細(xì)胞凋亡。

2.5CircRNA與Janus激酶(JAK)2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活(STAT)3信號通路 JAK2/STAT3信號通路的失調(diào)與許多癌癥的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)〔30，31〕。Li等〔31〕研究發(fā)現(xiàn)Circ_ZNF124在肺癌細(xì)胞系(A549、H1975、H1299、HCC827)中高表達(dá)。隨機(jī)選取A549、H975細(xì)胞系通過轉(zhuǎn)染敲低circ_ZNF124表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其可以誘導(dǎo)A549、H1975細(xì)胞周期停滯，降低其細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的能力。降低circ_ZNF124在細(xì)胞系A(chǔ)549和H1975中的表達(dá)量，導(dǎo)致miR-337-3p水平活躍，作為miR-337-3p下游靶基因的JAK2和STAT3活性被抑制，使JAK2/STAT3信號通路失活，其參與細(xì)胞凋亡的B細(xì)胞淋巴瘤(BCL)2、參與細(xì)胞分化、增殖、存活、缺氧的原癌基因(c-FOS)和參與糖醇解的異二聚體轉(zhuǎn)錄因子低氧誘導(dǎo)因子(HIF)1的亞基(HIF1a)的靶基因活性受到抑制，導(dǎo)致NSCLC細(xì)胞遷移、增殖被抑制，同時促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上，CircRNAs可以通過Wnt/β-catenin、PI3K/AKT、NF-κB、MAPK、JAK2/STAT3信號通路影響LC的遷移、增殖、侵襲，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。同時發(fā)現(xiàn)在甲狀腺癌35、乳腺癌36等惡性腫瘤中CircRNAs也可以通過信號通路調(diào)控細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲。遺憾的是CircRNA目前種類眾多，還存在有尚未完善的信號通路，如AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)/哺乳動物雷帕霉素蛋白(mTOR)、Notch、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)等信號通路。研究CircRNA通過信號通路影響LC增殖、侵襲的分子機(jī)制可能為LC的治療提供新的思路。