鄧少華,劉娟娟,陳丹鳳,崔 強(qiáng),2,肖穩(wěn)運(yùn),張海霞,2
(1.郴州市林業(yè)科學(xué)研究所,湖南 郴州 423000;2.郴州市林下經(jīng)濟(jì)植物資源培育與利用技術(shù)研發(fā)中心,湖南 郴州 423000)
黃精(Polygonatumcyrtonema) 又名“姜形黃精”,為百合科(Liliaceae)黃精屬(Polygonatum)多年生草本植物。自然分布于河南、安徽、浙江、江西、湖南和貴州等省,多生長于林下、灌叢或山坡陰處。黃精根莖既供藥用,又可食用,以其干燥根莖入藥[1~3]。現(xiàn)代研究表明,黃精富含多糖、皂苷、黃酮等化學(xué)成分[4~6]。黃精是傳統(tǒng)藥食兩用的補(bǔ)益類藥材,隨著市場需求日益增長,野生資源過度采挖,加之生態(tài)環(huán)境的破壞,導(dǎo)致其野生資源日益枯竭,人工種植是解決其資源匱乏的重要途徑之一[7],而當(dāng)前黃精繁殖方法主要有種子繁殖 (有性繁殖) 和根狀莖分株繁殖 (無性繁殖),種子繁殖存在收集難度大、發(fā)芽率低、育苗周期長和后代性狀分化嚴(yán)重等問題[8];根狀莖繁殖存在繁殖率低和易積累病毒等缺點(diǎn)[9],因此黃精的組培快繁研究極具意義,既豐富了繁殖方式,又滿足了種苗供應(yīng)。劉紅美等[10]與李鶯等[11]通過系統(tǒng)試驗(yàn), 初步建立了黃精組培快繁技術(shù)。目前有關(guān)黃精的組織培養(yǎng)和快速繁殖研究主要集中在芽的分化誘導(dǎo)和生根培養(yǎng)等方面,而組培苗移栽種植過程中的問題也逐漸暴露,如成活率不高、出苗時(shí)間長等等。本試驗(yàn)以黃精帶芽根莖為材料, 優(yōu)化黃精組培快繁體系,以期為黃精工廠化育苗提供技術(shù)支持。
采自湖南郴州境內(nèi)原生地野生的自然生長發(fā)育的黃精根莖,將其用自封袋裝好于4℃保存?zhèn)溆?,用帶芽根莖為組織培養(yǎng)的試驗(yàn)材料。該種野生黃精花期開白色花。
2.2.1 外植體的選擇與表面消毒條件的篩選
選取新鮮無病蟲害的完整植株,剝?nèi)ト~片,剪去下部須狀根,用自來水反復(fù)清洗根莖。用解剖刀切取帶芽根莖,用多菌靈水浸泡30 min 左右進(jìn)行表面清洗,再置于流水下沖洗2 h,將預(yù)處理過的帶芽根莖放在超凈工作臺上用 75% 酒精浸泡 20 s,用無菌水沖洗3~4 次,再用0.1% 的升汞HgCl2溶液分別消毒浸泡12、15、18 min,然后用無菌水沖洗5~6 次,濾去無菌水后用無菌濾紙吸干備用。再次剝?nèi)ネ獍娜~片,保留基部包含生長點(diǎn)的幼芽,將里面的嫩芽接種到制備好的培養(yǎng)基上培養(yǎng),每處理12瓶,重復(fù)3次,每瓶接1個(gè)芽,15 d后統(tǒng)計(jì)污染數(shù)和生長情況。
2.2.2 培養(yǎng)條件
培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基,固定成分為蔗糖30 g,瓊脂粉4.7 g,pH值5.8~6.0。培養(yǎng)室培養(yǎng)條件為室溫23~25℃ ,光照強(qiáng)度為2 000lx左右,光照12 h/d。
2.2.3 芽誘導(dǎo)培養(yǎng)
以MS為基本培養(yǎng)基,將外植體接種于不同激素配比的培養(yǎng)基 M1 ~ M3 上(表1) ,共3個(gè)處理,每處理30瓶,每瓶3個(gè)芽。30 d 后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
表1 不同激素配比的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基
2.2.4 增殖、生根培養(yǎng)
將誘導(dǎo)出的芽轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基M4 ~M7上誘導(dǎo)增殖(表2),共4個(gè)處理,每處理30瓶,每瓶接3個(gè)芽。30 d 后統(tǒng)計(jì)不定芽的增殖數(shù)及生長狀況。
表2 不同激素配比的增殖生根培養(yǎng)基
2.2.5 煉苗與移栽
選取根數(shù)達(dá)3~4條,根長大于1 cm且長勢良好的黃精組培苗120株進(jìn)行煉苗。移栽前將組培苗在大棚室內(nèi)煉苗7 d,前4 d緊閉瓶蓋,后3 d逐漸松蓋,提高抗性和適應(yīng)性。將小苗根部的培養(yǎng)基清洗干凈,移栽到黃心土∶泥炭土=1∶1的基質(zhì)中,用0.1%的多菌靈溶液提前噴灑基質(zhì)進(jìn)行消毒,于溫室中培養(yǎng),適度遮蔭,每隔2 d澆水一次,濕度保持在80%以上,待組培移栽苗新葉展開和新根長出后,即可按常規(guī)管理。90 d后統(tǒng)計(jì)成活率。
各相關(guān)指標(biāo)按如下公式計(jì)算:
污染率 = 污染個(gè)數(shù)/接種個(gè)數(shù);
萌發(fā)率 = 萌發(fā)個(gè)數(shù)/接種個(gè)數(shù);
增殖系數(shù)=增殖芽總數(shù)/接種外植體總數(shù);
生根率 = 生根苗數(shù)/接種苗數(shù)。
0.1%HgCl2溶液的消毒時(shí)間對黃精帶芽莖根的影響結(jié)果見表3。試驗(yàn)結(jié)果表明:消毒時(shí)間短,萌發(fā)率高, 但污染較嚴(yán)重,外植體消毒時(shí)間長,污染率雖較低,但外植體出現(xiàn)白化死亡苗的現(xiàn)象。因此,HgCl2對黃精外植體消毒時(shí)間在15 min較適宜。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長15 d后,芽開始生長,基部明顯膨大,27 d后開始分化出不定芽。
表3 不同消毒時(shí)間對外植體誘導(dǎo)存活影響
通過不同成分配比培養(yǎng)基的試驗(yàn)比較,認(rèn)真觀察記錄各個(gè)階段黃精在培養(yǎng)基上生長表現(xiàn)狀況,根據(jù)黃精組培苗在各個(gè)階段不同培養(yǎng)基的生長表現(xiàn)狀況,進(jìn)行綜合評價(jià)分析(表4),表現(xiàn)好的用 “++++”表示,較好的用“+++”表示,一般的用 “++” 表示,相對較差的用 “+” 表示。
表4 黃精組培各階段不同培養(yǎng)基表現(xiàn)情況
結(jié)果表明:在相同培養(yǎng)條件下,黃精帶芽莖根誘導(dǎo)芽的成活率及長勢對比可見M1>M2、M3,隨6-BA濃度升高處理M3芽誘導(dǎo)率和多芽率也逐漸提高,但隨著IBA濃度升高,且濃度為0.8 mg/L時(shí)會出現(xiàn)較多愈傷,不利于芽的誘導(dǎo),說明在6-BA濃度1.0~2.0 mg/L和IBA濃度0.2~0.8 mg/L范圍內(nèi),這2種外源激素共同作用下,濃度較低時(shí)更有利于芽的分化。
叢生芽在原瓶中能正常生長,但長勢慢,將原莖根誘導(dǎo)產(chǎn)生的約2 cm 高叢生芽分別接種至不同增殖培養(yǎng)基中繼代增殖,即可產(chǎn)生小苗。組培苗在不同處理培養(yǎng)基中長勢M7>M5>M4、M6,6-BA濃度3.0 mg/L和花寶1號濃度1 g/L時(shí)對叢生芽增殖影響最大,平均增值系數(shù)為8.5,分化芽直接成苗,苗長勢良好、健壯,葉片呈深綠色,且在接種45 d后可誘導(dǎo)生根,誘導(dǎo)出來的根多且長、較粗壯,植株生根率為100%,平均根數(shù)為16.8 ,平均根長為10.82 cm;但處理M4和M6中能分化芽直接成苗,但其組培苗易白化且生長緩慢,無根分化,此現(xiàn)象表明花寶1號對促進(jìn)增殖生長的影響要強(qiáng)于NAA,由此可確定能夠有效誘導(dǎo)黃精增殖的激素組合是6-BA 、IBA 和花寶1號。組培苗移栽后成活率達(dá)到了90%以上(圖1)。
圖1 黃精莖芽組培各階段
(1)植物組培快繁技術(shù)能有效的解決藥用植物資源短缺的問題[12]。本研究以MS為基本培養(yǎng)基比較各階段不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果,與前人研究表明黃精屬植物誘芽、增殖適用于MS培養(yǎng)基一致,而以1/2MS基本培養(yǎng)基培養(yǎng)黃精屬組培苗生根與本研究結(jié)果不一致[13~17]。相較于周新華[9]建立的多花黃精組培生根技術(shù),本研究選擇的最優(yōu)培養(yǎng)方法可將增殖和生根同時(shí)在同一培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)時(shí)間縮短45 d,且生根率高、根數(shù)多且長。
(2)不同的外源激素及不同的濃度對黃精組培各階段的影響都不同,且在培養(yǎng)基內(nèi)加入適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)添加物,能夠增強(qiáng)培養(yǎng)物的生長、分化效應(yīng)[18,19]。本研究誘導(dǎo)叢生芽形成的最適培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+ 0.2 mg/L NAA,最適合叢生芽增殖分化、生根的培養(yǎng)基為MS+3.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA+1.0 g/L花寶1號,生根率達(dá)100%。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn) 6-BA 能顯著增加黃精叢生芽的分化率,與徐忠傳等[20]研究一致。李慧敏等[21]研究發(fā)現(xiàn),添加花寶1號能促進(jìn)白芨假鱗莖的誘導(dǎo),本研究中適當(dāng)添加花寶1號更有利于苗的生長,這可能與花寶1號培養(yǎng)基中的氮、磷、鉀的配比更適合黃精叢生芽增殖和根的誘導(dǎo)。建議有條件時(shí)做更多的栽培基質(zhì)及其配比試驗(yàn),并增加供試株數(shù),以探索更多更好地適合湘南地區(qū)黃精生長發(fā)育的栽培基質(zhì),為黃精栽培提供更為準(zhǔn)確的試驗(yàn)結(jié)果。本研究建立的黃精組培快繁體系,為實(shí)現(xiàn)工廠化育苗提供了技術(shù)支持。