一株抗革蘭陽性菌的戈登氏菌WA4-43 全基因組測(cè)序與分析

和夢(mèng)穎 劉文彬 林震鳴 黎爾彤 汪潔 金小寶

（廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院 廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006）

目前使用的大多數(shù)抗生素均來源于鏈霉菌，但是鏈霉菌分離得到的次級(jí)代謝產(chǎn)物大多是已知重復(fù)的［1］。目前關(guān)于稀有放線菌產(chǎn)生生物活性物質(zhì)的相關(guān)研究較少［2］。但已有研究從Mycobacteriumspecies分 離 獲 得asukamycin 和 apramycin［3］， 從Amycolatopsis species分離獲得rifamorpholines 等抗生素［4］。因此，稀有放線菌的抗生素生產(chǎn)潛力未得到充分利用，值得進(jìn)一步深入研究［5］。

戈登氏菌是一種稀有放線菌。戈登氏菌常見應(yīng)用于產(chǎn)生類胡蘿卜素［6］，降解含油廢水［7］，以及吸附重金屬等［8］，而有關(guān)戈登氏菌抗菌活性和物質(zhì)的研究較少。課題組前期從蜚蠊腸道中分離得到15 株戈登氏放線菌，并從WA8-44 菌株中分離出Actinomycin D、Actinomycin X2、Collismycin A 等 對(duì)真菌和細(xì)菌都有活性的化合物［9］；從菌株WA4-31中分離出Actinomycin X2、Mojavensin A 等有一定抗真菌、抗腫瘤活性的化合物等［10］。

自天藍(lán)色鏈霉菌完成全基因組測(cè)序以來［11］，基因組測(cè)序技術(shù)與生物學(xué)信息分析技術(shù)越來越成熟，利用基因組挖掘可以幫助我們更好地預(yù)測(cè)編碼基因和基因功能，預(yù)測(cè)出次級(jí)生物合成基因簇?cái)?shù)量，具體基因功能以及與已知化合物同源性等。由于大多數(shù)基因在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)條件下處于沉默狀態(tài)，不表達(dá)或表達(dá)量低。除了常規(guī)的改變培養(yǎng)基參數(shù)，如添加化學(xué)誘導(dǎo)劑，共培養(yǎng)等方法可以激活沉默基因簇外［12］，在全基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上，以基因組為導(dǎo)向的天然產(chǎn)物挖掘技術(shù)，基因組挖掘技術(shù)避免了傳統(tǒng)挖掘方法的繁瑣和隨機(jī)，大大增加了新型天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)概率。采用基因組挖掘分析其生物合成基因簇，添加啟動(dòng)子、異源表達(dá)等方法能更好地發(fā)現(xiàn)新天然產(chǎn)物，避免不必要的浪費(fèi)［13］。

本文在前期研究基礎(chǔ)上，選取一株具抗革蘭陽性菌的菌株WA4-43 進(jìn)行全基因組測(cè)序，并分析其基因組數(shù)據(jù)和生物合成基因簇，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 菌株WA4-43 為本課題組前期從蜚蠊腸道中分離獲得并保存于本室。白色念珠菌（ATCC 10231）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（ATCC 43300）、金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）、枯草芽孢桿菌（ATCC 6633）、表皮葡萄球菌（ATCC 25989）、大腸埃希氏菌（ATCC 25922）、肺炎克雷伯氏菌（ATCC 13883）和銅綠假單胞菌（ATCC 25924）均購置至于廣東省微生物研究所。

1.1.2 主要試劑及儀器 2×Taq PCR Master Mix，TaKaRa 公司；瓊脂糖凝膠，biowest 公司；EZUP 柱式細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒，上海生工生物工程股份有限公司；T100TM PCR 儀，Bio-Rad 公司； LB培養(yǎng)基、PDA 培養(yǎng)基、PDB 培養(yǎng)基、高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基、ISP-1 和ISP-2 培養(yǎng)基均購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株WA4-43 培養(yǎng)及培養(yǎng)特征 將菌株WA4-43 接種于高氏一號(hào)固體平板上，28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 5-8 d，觀察菌落形態(tài)、色素和產(chǎn)孢情況等特征，接種ISP-1，于28℃、180 r/min 搖菌 2 d。

1.2.2 16S rRNA 基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析 根據(jù)EZUP 柱式細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒步驟提取菌株基因組DNA，使用16S rRNA 基因的通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTAGGACTT-3′）［14］PCR 擴(kuò)增16S rRNA。PCR 反 應(yīng) 體 系（50 μL）: DNA 模 板2 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL， 引 物27F（10 μmol/L）和引物1492R（10 μmol/L）各 1 μL，ddH2O 21 μL。PCR 產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否有相應(yīng)大小條帶，送至北京六合華大基因科技有限公司廣州分公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast 同源序列比對(duì)，下載NCBI 數(shù)據(jù)庫中親緣較近的40 株不同種類的戈登氏菌16S rRNA 基因核心序列，利用MEGA5.0［15］中的最大似然值法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌株WA4-43 粗提物抗菌活性測(cè)定 接種ISP-1，于 28℃、180 r/min 搖菌 2 d，以5%的接種量接種ISP-2 發(fā)酵液，于28℃、180 r/min 發(fā)酵14 d。發(fā)酵液離心得到上清液，上清液分別使用乙酸乙酯和正丁醇萃取3 次，減壓濃縮。粗提物用甲醇配置成10 mg/mL 樣品備用。采用管碟法［16］測(cè)定樣品對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌和白色念珠菌的抑菌活性。

1.2.4 菌株WA4-43 全基因組測(cè)序與組裝 全基因組測(cè)序由北京百邁客生物科技有限公司完成。首先使用Canu v1.5［17］軟件組合裝配過濾后的subreads，再通過Racon v3.4.3 軟件對(duì)組裝的結(jié)果進(jìn)行矯正，后通過Circlator v1.5.5 軟件進(jìn)行環(huán)化和調(diào)整起始位點(diǎn)，最后用Pilon v1.22 軟件進(jìn)一步進(jìn)行糾錯(cuò)，以此來得到準(zhǔn)確度更高的基因組序列。

1.2.5 菌株WA4-43 的基因組組分分析與基因組功能注釋 使用Rfam［18］數(shù)據(jù)庫、tRNAscan-SE v2.0［19］軟 件、Nr［20］數(shù) 據(jù) 庫、GO［21］數(shù) 據(jù) 庫、eggNOG［22］數(shù)據(jù)庫、Pfam［23］數(shù)據(jù)庫、COG 數(shù)據(jù)庫［24］和KEGG［25］等數(shù)據(jù)庫對(duì)基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析，獲得注釋信息以及功能；通過軟件Prodigal v2.6.3［26］動(dòng)態(tài)編程算法較準(zhǔn)確預(yù)測(cè)基因組中的編碼基因；使用antiSMASH v6.0.1［27］進(jìn)行菌株WA4-43 生物合成基因簇（biosynthetic gene clusters, BGCs）分析；利用PRISM 4［28］完成生物合成基因簇化合物的預(yù)測(cè)。

1.2.6 菌株WA4-43 的比較基因組分析 GenBank中下載2022年3月之前所有Gorclonia terrae菌屬全基因組數(shù)據(jù)，進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 菌株WA4-43培養(yǎng)特征

菌株WA4-43 在高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基上生長良好，生長周期7 d 左右。菌落呈粉橘色，表面干燥不透明，呈不規(guī)則小圓型。經(jīng)革蘭染色可見，菌株WA4-43 為短小棒狀革蘭陽性菌，掃描電鏡顯示菌絲呈短桿狀，無縱膈，如圖1 所示。

圖1 菌株WA4-43 菌株特征Fig. 1 Characteristics of strain WA4-43

2.2 菌株WA4-43分子生物學(xué)鑒定

2.2.1 菌株WA4-43 歸屬及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 通過PCR 擴(kuò)增16S rRNA 基因并測(cè)序用于菌株WA4-43鑒定，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序?yàn)? 372 bp 的16S rRNA序列。將序列上傳至GenBank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast同源性比對(duì)，選取較相似的40 個(gè)戈登氏菌代表性菌株多序列比對(duì)，利用MEGA 5.0 中的最大似然值法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果，如圖2 所示。結(jié)果表示該菌株與G. terraestrain DSM 43249 處于同一分支，其16S rRNA 基因相似度為100%，與G. lacunaestrain BS2 基因相似度為98.91%，結(jié)合菌株生理生化特征［29-30］（表1）和16S rRNA 基因分析，初步鑒定菌株WA4-43 為Gordonia terrae。

表1 菌株WA4-43 生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain WA4-43

圖2 菌株WA4-43 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of strain WA4-43

2.2.2 菌株WA4-43 次級(jí)代謝產(chǎn)物抗菌活性初步測(cè)定 菌株WA4-43 乙酸乙酯部位對(duì)4 種革蘭陽性菌：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和表皮葡萄球菌均有抑制作用（圖3），抑菌圈分別為（19.0±0.47）cm、（19.7±1.25）cm、（21.0±0.82）cm、（15.0±0.47）cm。菌株乙酸乙酯粗提物對(duì)大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌和白色念珠菌無活性。此外菌株正丁醇部位對(duì)上述菌株均無活性。

2.2.3 菌株WA4-43 全基因組測(cè)序與分析 將菌株WA4-43 全基因序列上傳至GenBank 獲得登錄號(hào)：CP084736.1。菌株WA4-43 基因全長5 438 735 bp，含有Contig 數(shù)量1 個(gè)，Contig N50 為5 438 735 bp，Contig N90 為5 438 735 bp，GC 含量為67.76%，基因組中包含4 963 個(gè)蛋白編碼基因，其余數(shù)據(jù)庫注釋基因如表2 所示。非編碼RNA 常具有特殊的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中rRNA 9 個(gè)，包括23S rRNA 3 個(gè)，5S rRNA 3 個(gè)，16S rRNA 3 個(gè)；tRNA49 個(gè)；other ncRNA 40 個(gè)。

表2 菌株WA4-43 功能注釋的基因數(shù)量和大小Table 2 Number and size of functionally annotated genes in strain WA4-43

利用菌株WA4-43 全基因序列預(yù)測(cè)得到的tRNA、rRNA、重復(fù)序列、GC 含量等信息，制作基因組圈圖如圖4 所示，可視化地看出基因組各組分在全基因組上的各種位置關(guān)系。

圖4 菌株WA4-43 基因組圈圖Fig. 4 Genome circle map of strain WA4-43

2.3.1 GO 功能注釋 在菌株WA4-43 中，有3 563個(gè)基因在GO數(shù)據(jù)庫得到注釋，注釋結(jié)果包含三大類，細(xì)胞組分（cellular component）、分子功能（molecular function）、生物過程（biological process），分析基因組各種功能注釋信息，如圖5 所示。藍(lán)色: 細(xì)胞組分;紅色: 分子功能;綠色: 生物過程。在細(xì)胞組分分類中共有9 類功能基因得到注釋，其中基因比例較大的為membrane 和membrane part。在分子功能

圖5 菌株WA4-43 基因組GO 功能注釋Fig. 5 GO functional annotation on the genome of strain WA4-43

2.3 菌株WA4-43基因組注釋

分類類別中共有11 類基因得到注釋，參與catalytic activity 和binding 的獨(dú)立基因比較多。在生物過程這個(gè)分子功能中，有10 類基因得到注釋，其中參與metabolic process、cellular process 和single-organism process 過程的獨(dú)立基因較多。

2.3.2 KEGG 功能注釋 菌株WA4-43 共有1 870 個(gè)基因在KEGG 數(shù)據(jù)庫中得到注釋，如圖6 所示，紅色，生物遺傳信息；紫色，環(huán)境因素；綠色，新陳代謝。共有3 大類代謝通路分別為genetic information processing、environmental information processing 和metabolism，分別有5、2、41 個(gè)小類。主要參與ribosme（59 kos），abc transporters（106 kos），biosynthesis of amino acids（129 kos）等代謝過程。

圖6 菌株WA4-43 基因組KEGG 的功能注釋Fig. 6 KEGG functional annotation of strain WA4-43 genome

2.3.3 COG 功能注釋 通過將菌株WA4-43 基因信息于COG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，共有4 178 個(gè)基因獲得注釋，共有22 類，如圖7 所示，其中function unknown 和general function prediction only 類 別 基 因數(shù)量最多分別為1 069 個(gè)和417 個(gè)，占注釋基因的25.22%和9.84%。其余功能基因占比較高的、大于5% 的 分 類 有energy production and conversion（253個(gè)，占比5.97%）、amino acid transport and metabolism（271 個(gè)，占比6.39%）、lipid transport and metabolism（224 個(gè)，占比5.29%）、transcription（321 個(gè)，占比7.57%）、replication，recombination and repair（283 個(gè)，占 比6.68%）、inorganic ion transport and metabolism（232 個(gè)，占比5.47%）。占比較少的類別為RNA processing and modification（1 個(gè)，占比0.02%）、cytoskeleton（1 個(gè)，占比0.02%）。

圖7 菌株WA4-43 基因組COG 功能注釋Fig. 7 Functional annotation of COG in the genome of strain WA4-43

2.3.4 次級(jí)代謝基因簇預(yù)測(cè) 使用軟件AntiSMASH對(duì)菌株WA4-43 全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，如表3 所示，菌株WA4-43 有13 個(gè)次級(jí)代謝生物合成基因簇，包括四氫嘧啶類（ectoine）、萜烯類（terpene）、非核糖體多肽類（NRPS）、鐵載體（siderophore）、核糖體合成和翻譯后修飾肽（RiPPs）等，共預(yù)測(cè)到6 種可能的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其中，同源性大于等于75%的次級(jí)代謝基因簇預(yù)測(cè)產(chǎn)物的有ectoine；同源性低于75%的預(yù)測(cè)產(chǎn)物有SF2575、ishigamide、oxalomycin B、kanglemycin A / kanglemycin V1/kanglemycin V2 和desferrioxamine。

表3 菌株WA4-43 基因組中次級(jí)代謝基因簇的預(yù)測(cè)Table 3 Prediction of secondary metabolic gene clusters in the genome of strain WA4-43

基因簇使用軟件PRISM 4 可以預(yù)測(cè)出BGC4、5、6、7、11、12 化合物分子式，如圖8 所示。

圖8 菌株WA4-43 生物合成基因簇化合物預(yù)測(cè)Fig. 8 Prediction of biosynthetic gene cluster compounds of strain WA4-43

BGC10 中包含核心生物合成基因1 個(gè)，轉(zhuǎn)運(yùn)基因2 個(gè)，額外生物合成基因1 個(gè)，其他基因3 個(gè)，如表4 所示，其中核心生物合成基因GE002626 全長810 bp，通過Blast 對(duì)菌株WA4-43 蛋白序列與Nr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，該基因與Nocardia farcinica中對(duì)應(yīng)基因相似，GO 數(shù)據(jù)庫分析顯示其生物過程與蛋白質(zhì)水解有關(guān)，也與細(xì)菌的防御反應(yīng)有關(guān)；分子功能與肽酶活性有關(guān)。

表4 BGC10 基因預(yù)測(cè)及數(shù)據(jù)庫分析Table 4 BGC10 gene prediction and database analysis

2.3.5 比較基因組分析 將菌株WA4-43 與9 株G.terrae全基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，它們基因組大小范圍為：5.17-5.71 Mb，其中基因組最大的為土壤來源的G. terraeNCTC10669 和G. terraeNRRL B-16283，最小的為G. terraeC-6；編碼蛋白范圍為：4 480-5 007 個(gè)，GC 含量范圍為：67.7%-68%，均低于70%，其中GC 含量最高的為G. terraeK，最低的為G.terraeUMB0777。多數(shù)G. terrae為環(huán)狀染色體，包括G.terraeWA4-43、G. terraeNCTC10669、G. terraeNRRL B-16283 等，如表5 所示。

經(jīng)antiSMASH 預(yù) 測(cè) 和 分 析，10 株G. terrae次級(jí)代謝基因簇類型較少，但同源性均非常低。有154 個(gè)次級(jí)代謝基因簇，83 個(gè)次級(jí)代謝基因簇預(yù)測(cè)有已知化合物，如表5 所示，每個(gè)菌株都有RiPPlike 類化合物分別為pimaricin 和kanglemycin A /kanglemycin V1 / kanglemycin V2，都 有NRPS 類 的ishigamide 和ectoine 類的ectoine。

表5 10 種Gordonia terrae 基因組特征比對(duì)Table 5 Comparison of genomic characteristics of 10 Gordonia terrae species

比較G. terrae與6 種其他類型的戈登氏菌，可以看出，所有戈登氏菌均有ectoine 類的ectoine 同源性為75%，其他專有的預(yù)測(cè)化合物有，G. namibiensis有NRPS 類的atratumycin 同源性為7%，有PKS 類的GE81112 同 源 性 為7%；G. lacunae有NRPS 類的mycobactin 和glycinocin 同 源 性 分 別 為30% 和4%；G. ankookensis有NRPS 類 的pepticinnamin E 和pyxidicycline A、pyxidicycline B 同源性分別為10%和6%等，如圖9 所示。

圖9 AntiSMASH 預(yù)測(cè)Gordonia 生物合成基因簇Fig. 9 Predicting the Gordonia biosynthetic gene cluster by AntiSMASH

3 討論

戈登氏菌次級(jí)代謝產(chǎn)物首次發(fā)現(xiàn)僅抗革蘭陽性菌。通過菌株WA4-43 全基因測(cè)序分析及antiSMASH次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇預(yù)測(cè)，可以知道菌株WA4-43 較鏈霉菌基因組較小，次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇種類數(shù)量較少［31］，有7 個(gè)假定基因簇，預(yù)測(cè)基因簇與已知分離出化合物合成基因簇相似度均小于等于75%，表明菌株WA4-43 有研究意義，具有合成新穎化合物的潛力。

BGC1 與四氫嘧啶類型的ectoine 的相似性為75%，ectoine 是重要的應(yīng)對(duì)外界環(huán)境變化的相容性 溶 質(zhì)［32］；BGC2 與萜烯類型 的SF2575相似性為6%，SF2575 對(duì)多種癌細(xì)胞系具有抗癌活性，可以抑制DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶［33］； BGC9 與萜烯類型的oxalomycin B 相似性為6%，oxalomycin B 具有抗腫瘤，抗病毒的作用，以及關(guān)于HIV 抑制劑方面的研究［34］；BGC12 與非核糖體多肽類、鐵載體類型的desferrioxamine 相似性33%等［35］；BGC10 核糖體合成和翻譯后修飾肽類型的Kanglemycin A/kanglemycin V1 /kanglemycin V2［36］，相似性為5%，預(yù)測(cè)化合物最早由Amycolatopsis vancoresmycinaDSM 44592 菌株產(chǎn)生，是利福平同系物，對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌等革蘭氏陽性菌有抑制活性，與菌株WA4-43 乙酸乙酯粗提物活性相似，但是同源性低，提示菌株有發(fā)現(xiàn)新抗革蘭陽性菌藥物的潛能。這些基因簇同源性均很低，預(yù)測(cè)到至少有3 種抗生素。

10 株G. terrae共有48 473 個(gè)蛋白編碼基因，其核心基因可能涉及菌體的基礎(chǔ)代謝以及適應(yīng)環(huán)境等來維持其基本生命特征。如菌株WA4-43 COG 數(shù)據(jù)庫分析所示，多為未知功能，提示菌種具有新穎性，多參與轉(zhuǎn)錄、DNA 復(fù)制、結(jié)合和修復(fù)、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、能源的產(chǎn)生交換、無機(jī)離子運(yùn)輸與代謝等使菌株具有基礎(chǔ)的代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)功能，使細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境來維持最基本的生命特征。G. terrae菌株之間次級(jí)代謝基因簇的差異可能與它們生活環(huán)境不同有關(guān)，是它們適應(yīng)不同生長環(huán)境的表現(xiàn)。

比較不用類型的戈登氏菌，其中RiPP-like 類型 的pimaricin、kanglemycin A /kanglemycin V1/kanglemycin V2 至少有一個(gè)，pimaricin 對(duì)霉菌、酵母菌和真菌都有極強(qiáng)的抑制能力，但對(duì)細(xì)菌、病毒等其他微生物沒有抑制作用［37］，因?yàn)镻iPP 類型天然產(chǎn)物是由遺傳編碼的前體肽及其同源修飾酶組成的［38］，可能說明RiPP-like 類型的化合物可能決定戈登氏菌的抗菌專一性；特殊預(yù)測(cè)化合物一般是NRPS 類型，如NRPS 類 ishigamideG. terrae中均有且同源性為11%、5 株有NRPS 類oxalomycin B 而其他幾類戈登氏菌沒有，說明這兩個(gè)基因簇有區(qū)別于其他菌株的特性，有研究意義。

4 結(jié)論

菌株WA4-43 是首次發(fā)現(xiàn)的具有抗革蘭陽性菌戈登氏菌。該菌株生物合成基因簇新穎，具有合成獨(dú)特結(jié)構(gòu)化合物的潛能。前期研究發(fā)現(xiàn)菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量較低，提示我們后續(xù)可通過異源表達(dá)等手段進(jìn)行天然產(chǎn)物的研究。