大腸桿菌型奶牛乳房炎對產(chǎn)奶性狀相關基因表達的影響

李彥霞 王晉鵬 馮芬 包斌武 董益聞 王興平 羅仍卓么

（1. 寧夏大學農(nóng)學院，銀川 750021；2. 寧夏回族自治區(qū)反芻動物分子細胞育種重點實驗室，銀川 750021）

大腸桿菌（Escherichia coli）是引起奶牛乳房炎的主要病原菌之一，感染奶牛乳房時會引起急性臨床乳房炎，造成奶牛乳腺上皮細胞（bovine mammary epithelial cells，bMECs）的乳合成能力和分泌功能障礙，導致牛奶品質顯著下降［1-3］。研究表明，即使患病奶牛的臨床癥狀和致病菌消失，其乳腺也不會迅速恢復到原狀［4］，這將導致產(chǎn)奶量持續(xù)受到影響。除了上述影響，乳房炎的致病菌還會誘導炎癥因子表達，產(chǎn)生炎癥反應。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作為E.coli表面的活性成分，是E.coli型乳房炎的主要致病因子［5］，它可以引起腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和白細胞介素-1β（interleukin 1β，IL-1β）等基因在奶牛乳腺組織和bMECs 炎癥過程中表達量升高［6］。此外，乳房炎也可引起外周血液［7］和乳腺組織［8］的基因表達量發(fā)生變化，進而嚴重影響了奶牛的產(chǎn)奶量和乳品質。因此，從分子和細胞水平上研究抑制產(chǎn)奶量減少和乳品質下降的原因，是當下學者們研究的熱點領域，為高產(chǎn)優(yōu)質奶牛的分子育種奠定基礎。

在奶牛產(chǎn)奶性狀方面，學者們挖掘了許多與奶牛產(chǎn)奶量、乳蛋白率和乳脂率相關的基因，如脂肪酸結合蛋白3（fatty acid binding protein 3，F(xiàn)ABP3）、脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）、α-酪蛋白家族（casein alpha-S1，CSN1S1）、β-酪蛋白（casein beta，CSN2）、α-乳白蛋白（lactalbumin alpha，LALBA）、乳脂球表皮生長因子8（milk fat globule-EGF factor 8 protein，MFGE8） 基因。FABP3和LPL主要與乳脂相關，其中FABP3調控乳脂主要合成通道，LPL參與乳脂合成過程和代謝過程［9-10］；牛奶蛋白主要由4 種酪蛋白和乳清蛋白組成，CSN1S1和CSN2是乳蛋白組成成分中的兩種酪蛋白，而LALBA是乳蛋白組成成分中的乳清蛋白［11］。MFGE8主要與炎癥以及產(chǎn)奶量相關［12-13］。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)上述基因在奶牛乳合成中發(fā)揮著重要作用，但是對于它們在E.coli型奶牛乳房炎和bMECs 炎癥反應中的表達模式目前還尚不清楚，有待進一步研究。

因此，本研究采用qPCR 技術檢測了CSN1S1、CSN2、LALBA、FABP3、LPL和MFGE8基因在E.coli型乳房炎奶牛乳腺組織和bMECs 炎癥反應中的表達模式，以期為解析E.coli型乳房炎奶牛的產(chǎn)奶量、乳蛋白率及乳脂率下降的原因，以及為高產(chǎn)優(yōu)質奶牛的分子育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗所用的乳腺組織為2-3 歲健康奶牛和E.coli誘導乳房炎的荷斯坦奶牛的乳腺組織，為實驗室前期采集、鑒定和凍存［8］。其中E.coli誘導乳房炎的荷斯坦奶牛的乳腺組織是采用無菌手術法活體采集奶牛的乳腺組織，主要步驟：將E.coli凍干粉溶解，擴大培養(yǎng)，用PBS 稀釋，用通乳針將E.coli懸浮液經(jīng)乳導管一次性注入到試驗組奶牛的右后乳房中，在接種后的第7 天，采集其乳腺組織［14］；bMECs 為課題組前期鑒定并保存于液氮罐中的細胞［15］。

實驗所用的主要儀器：CO2培養(yǎng)箱（Thermo，美國）、CFX96 實時熒光定量PCR 儀（Bio-Rad，美國）、高壓滅菌鍋（普和希，日本）、電熱恒溫水浴鍋（一恒，上海）、普通PCR 儀（Bio-Rad，美國）。

實驗所用的主要試劑：DMEM/F12 細胞培養(yǎng)基（Hyclone，美國）、0.25%的胰酶消化液（Hyclone，美國）、PBS 緩沖液（Hyclone，美國）、胎牛血清（BI，以色列）、脂多糖（Sigma，美國）、Real time-熒光定量PCR 試劑盒（聚合美，北京）、逆轉錄試劑盒（TaKaRa，北京）、TriZol 試劑（TaKaRa，北京）、RNase-free H2O（天根，北京）。

1.2 方法

1.2.1 bMECs 的復蘇與傳代培養(yǎng) 從液氮中取出bMECs，37℃水浴鍋解凍；接種在含有10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)液中，在37℃、5% CO2和100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細胞融合度為90%時傳代，即用PBS 漂洗細胞1-2 遍，再用胰酶消化液吹打消化2-3 min，加入2 mL 培養(yǎng)基終止消化；轉移至15 mL 離心管中，1 000 r/min 離心5 min；棄上清，加入1 mL 培養(yǎng)基吹打混勻后，接種到新培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.2 bMECs 炎癥模型的建立 將bMECs 接種于6孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，待細胞融合度達60%-70%時，向每孔細胞中滴加LPS 溶液（終濃度為50 ng/μL），誘導細胞產(chǎn)生炎癥反應［16］。在LPS 誘導的0、3、6、12 和24 h，分別收集細胞，用于RNA 提取。通過檢測細胞炎癥因子mRNA 的表達量，判斷炎性細胞模型是否構建成功。

1.2.3 RNA 提 取 與cDNA 合 成 采 用TriZol 法 分別提取約1 cm3的健康奶牛右后乳區(qū)的乳腺組織和E.coli誘導乳房炎奶牛右后乳區(qū)的乳腺組織，以及LPS 誘導不同時間（0、3、6、12 和24 h）bMECs的RNA。電泳檢測RNA 的完整性，全波長酶標儀檢測RNA 的濃度與純度（1.8 < OD260/280< 2.0）。

采用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser 逆轉錄試劑盒，按照說明書，通過兩步反應（去除基因組DNA 反應和反轉錄）合成cDNA，以此cDNA 為模板，進行下一步實驗。多功能酶標儀檢測cDNA 的濃度，稀釋至100 ng/μL，-20℃凍存。

1.2.4 qPCR 反應 參照GenBank 數(shù)據(jù)庫中各mRNA的序列信息，利用Primer premier 5.0 軟件設計qPCR引物（表1），委托通用生物（安徽）有限公司合成，RNase free H2O 溶解。

表1 qPCR 引物信息Table1 qPCR primer information

qPCR 的反應體系：2×M5 Hiper SYBR Premix Es Taq (with Tli RNaseH） 10.0 μL，100 μmol/L 的 上下游引物各0.8 μL，DNA 模板1.5 μL，加滅菌去離子水至20.0 μL。qPCR 的反應程序：（預變性95℃30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s）40 個 循 環(huán)；95℃ 10 s，65℃ 5 s。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用2-△△ct方法計算基因的相對表達量（n=3），所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差”表示。利用GraphPad 8.3 軟件的單因素方差（one-way AVONA）進行組間基因表達水平的差異顯著性分析，P< 0.05 表示差異顯著，有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 候選基因在E.coli型乳房炎奶牛的乳腺組織中的表達分析

2.1.1 乳蛋白和泌乳量相關候選基因在奶牛乳腺組織中的表達分析 利用qPCR 技術檢測了乳蛋白和泌乳量相關的CSN1S1、CSN2和LALBA基因在健康奶牛和E.coli型乳房炎奶牛的乳腺組織中的表達量。結果表明，與健康奶牛相比，乳蛋白相關的CSN1S1、CSN2和LALBA基因在E.coli型乳房炎奶牛的乳腺組織中的mRNA 表達量均極顯著下調（P<0.000 1）（圖1）。該結果提示，在奶牛E.coli型乳房炎發(fā)生后，上述3 個基因表達量下降可能導致牛奶的乳蛋白含量及泌乳量減少。

圖1 CSN1S1、CSN2 和LALBA 基因在E.coli 型乳房炎奶牛的乳腺組織中的表達量Fig. 1 Expressions of CSN1S1, CSN2 and LALBA gene in the cow mammary tissues of dairy cows with E.coli type mastitis

2.1.2 乳脂調控相關候選基因在奶牛乳腺組織中的表達分析 利用qPCR 技術檢測了乳脂調控相關的FABP3和LPL基因在健康奶牛和E.coli型乳房炎奶牛的乳腺組織中的表達量。結果表明，與健康奶牛相比，上述2 個基因在E.coli型乳房炎的乳腺組織中的表達量都極顯著下調（P< 0.000 1）（圖2）。上述結果提示，F(xiàn)ABP3和LPL基因表達量下調可能導致了在E.coli型乳房炎奶牛分泌的牛奶乳脂減少和乳脂率降低。

圖2 FABP3 和LPL 基因在E.coli 型乳房炎奶牛的乳腺組織中的表達量Fig. 2 Expressions of FABP3 and LPL gene in the mammary tissues of dairy cows with E.coli mastitis

2.1.3 炎癥和泌乳量相關MFGE8基因在奶牛乳腺組織中的表達分析 利用qPCR 技術檢測了MFGE8基因在健康奶牛和E.coli型乳房炎奶牛的乳腺組織中的表達量。結果表明，與健康奶牛相比，MFGE8基因在E.coli型乳房炎的乳腺組織中的表達量都極顯著下調（P< 0.000 1）（圖3）。結果提示，MFGE8基因的表達量降低導致抗炎反應減弱，炎癥反應加劇，最終乳腺組織的功能減弱，導致產(chǎn)奶量減少。

圖3 MFGE8 基因在E.coli 型乳房炎奶牛的乳腺組織中的表達量Fig. 3 Expression of MFGE8 gene in mammary tissue of dairy cows with E.coli mastitis

2.2 bMECs炎癥模型構建的驗證結果

本研究通過體外培養(yǎng)bMECs（圖4-A），利用LPS 誘導bMECs 構建細胞炎癥模型。為驗證炎癥細胞模型的可靠性，利用qPCR 技術檢測了LPS 誘導不同時間細胞內主要炎癥因子基因的表達情況。結果表明，與0 h（對照組）相比，炎癥因子TNF-α在6 h 的表達量極顯著上調（P< 0.000 1）（圖4-B）；炎癥因子IL-6在3、6 和12 h 時的表達量極顯著上調（P< 0.01）（圖4-C）；炎癥因子IL-8在6 h、12 h 和24 h 的表達量極顯著上調（P< 0.01）（圖4-D），說明本實驗成功構建了bMECs 炎癥模型。

圖4 主要炎癥因子基因在LPS 誘導bMECs 不同時間的表達量Fig. 4 Expression of main inflammatory factor genes in LPS-induced bMECs at different times

2.3 候選基因在LPS誘導bMECs炎癥反應中的表達分析

2.3.1 乳蛋白和泌乳量相關候選基因在bMECs 炎癥反應中的表達量 為揭示乳蛋白和泌乳量相關的CSN1S1、CSN2及LALBA基因在bMECs 炎癥反應中的動態(tài)表達情況，采用qPCR 技術檢測了它們在LPS誘導bMECs 產(chǎn)生炎癥反應不同時間的表達量。結果表明，與對照組（0 h）相比，CSN1S1、CSN2及LALBA基因的表達量都顯著降低，其中CSN1S1在LPS 誘導3、6、12、24 h 后的表達量都極顯著下調（P< 0.000 1）（圖5-A）；CSN2在LPS 誘 導3 h 后表達量降低，但未達到顯著效果，當LPS 誘導6、12、24 h 時，CSN2的表達量極顯著下調（P<0.000 1）（圖5-B）；LALBA在LPS 誘 導3、6、12 h表達量顯著下調（P< 0.05），而24 h 時表達量降低，但差異不顯著（P> 0.05）（圖5-C）。結果提示，在LPS 誘導細胞產(chǎn)生炎癥后，下調了上述基因的表達，可能降低了bMECs 中乳蛋白的合成與乳汁分泌量。

圖5 乳蛋白相關基因在LPS 誘導bMECs 不同時間的表達量Fig. 5 Expressions of milk protein-related genes in LPSinduced bMECs at different times

2.3.2 乳脂調控相關候選基因在bMECs 炎癥反應中的表達量 為探討乳脂相關基因FABP3和LPL在bMECs 炎癥反應中的動態(tài)表達情況，采用qPCR 技術檢測了它們在LPS 誘導bMECs 不同時間的表達量，結果表明，與對照組（0 h）相比，F(xiàn)ABP3和LPL在LPS 誘導bMECs 產(chǎn)生炎癥反應的3、6、12和24 h 的表達量均顯著下調，其中FABP3在3、6、12 和24 h 的表達量極顯著下調（P< 0.000 1）（圖6-A）；LPL在3 h 的表達量顯著下調（P< 0.05），在6、12 和24 h 的表達量極顯著下調（P< 0.000 1）（圖6-B）。結果提示，在LPS 誘導bMECs 產(chǎn)生炎癥過程中上述基因表達量下調，可能導致了乳中的乳脂率降低。

圖6 乳脂調控相關基因在LPS 誘導bMECs 不同時間的表達量Fig. 6 Expressions of milk fat regulation related genes in LPS-induced bMECs at different times

2.3.3MFGE8基因在bMECs 炎癥反應中的表達量 為探討基因MFGE8在bMECs 炎癥反應中的動態(tài)表達情況，采用qPCR 技術檢測了其在LPS 誘導bMECs 不同時間的表達量，結果表明，與對照組（0 h）相比，MFGE8在3、12 和24 h 的表達量極顯著下調（P< 0.001），在6 h 的表達量也極顯著下調（P< 0.000 1）（圖7）。結果提示，MFGE8表達量降低，吞噬凋亡細胞的能力下降，抗炎反應減弱，導致bMECs 炎癥反應的抵抗力下降，乳合成能力和泌乳量減少。

圖7 MFGE8 基因在LPS 誘導bMECs 不同時間的表達量Fig. 7 Expressions of MFGE8 gene in LPS-induced bMECs at different times

3 討論

乳房炎作為奶牛最常見的疾病之一，患病后奶牛健康狀況急劇下降，泌乳量減少，但是其分子層面的原因尚不清楚。乳腺組織是奶牛泌乳的主要功能器官，而bMECs 是泌乳的主要功能細胞，也是乳腺防御病原菌入侵的第一道防線。LPS 作為E.coli的主要毒力因子，可誘導bMECs 產(chǎn)生固有免疫應答和炎癥反應，并且可導致細胞損傷和凋亡［19］。當奶牛乳腺組織受到E.coli刺激時，其生理狀態(tài)發(fā)生改變，表現(xiàn)出乳房炎臨床癥狀，產(chǎn)奶量明顯降低，牛奶體細胞數(shù)上升［20］。值得一提的是，乳腺組織發(fā)生炎癥反應時，除了bMECs 之外，其他免疫細胞也參與炎癥反應［14］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，LPS 誘導的乳房炎癥反應可影響乳蛋白和乳脂的合成［21-22］。因此，為全面探討E.coli型乳房炎中泌乳量、乳蛋白和乳脂率下降的原因，本研究從組織水平（E.coli型乳房炎奶牛和健康奶牛的乳腺組織）和細胞水平（LPS誘導的bMECs）2 個層面研究了6 個泌乳性狀相關候選基因（CSN1S1、CSN2、LALBA、FABP3、LPL和MFGE8）的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)上述6 個候選基因在炎癥前后的組織水平和細胞水平的表達量變化是完全一致的，說明這6 個基因參與了乳腺組織和bMECs 的泌乳或炎癥反應過程。

據(jù)報道，牛奶中酪蛋白編碼的基因CSN1S1、CSN2和LALBA的表達量與產(chǎn)奶量顯著相關［23］。CSN1S1和CSN2是奶牛泌乳性狀的關鍵基因［24］，兩者相互作用、相互影響。Wu 等［25］研究發(fā)現(xiàn)，在肽聚糖（peptidoglycan, PGN）和脂磷壁酸（lipoteichoic acid, LTA）引起的奶牛乳房炎中，CSN1S1和CSN2基因的mRNA 表達量降低，并通過降低組蛋白H3乙酰化，減少了泌乳量。LALBA是泌乳期的bMECs產(chǎn)生的一種對牛奶和乳腺具有特異性的牛奶蛋白［26］，與溶菌酶具有高度同源性［27］，可以通過催化乳糖合成進而調控乳產(chǎn)量［28］。在小鼠乳腺中注射LPS 24 h 內，LALBA的表達量顯著降低，其表達量降低可能是通過LPS 誘導核因子-κB（NF-κB）和細胞因子的產(chǎn)生來介導［29］。本研究中也發(fā)現(xiàn)CSN1S1、CSN2和LALBA基因在E.coli型乳房炎奶牛乳腺組織和炎性細胞模型中的表達量顯著降低。結合上述前人的研究結果，推測CSN1S1、CSN2和LALBA基因的表達量降低，可能是引起E.coli型乳房炎產(chǎn)奶量和乳蛋白率降低的原因。

乳脂是牛奶的主要成分，也是乳品質的主要檢測指標之一。在乳脂代謝調節(jié)的研究中，學者們發(fā)現(xiàn)LPL和FABP3是參與乳脂合成與分解代謝過程中的關鍵蛋白［30-31］。FABP3作為結合脂肪酸的FABP家族成員之一，可協(xié)同其他基因形成一個調控奶牛乳腺脂肪酸向乳脂合成的通道［9］。已有研究表明，F(xiàn)ABP3與乳脂合成信號通路中的相關轉錄因子成正相關關系［32］。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP3在E.coli型乳房炎奶牛的乳腺組織和炎癥細胞模型中的表達量顯著下調。結合前人的研究結果，推測在E.coli型奶牛乳房炎中，F(xiàn)ABP3基因表達下調，抑制了乳脂合成，降低了牛奶的乳脂率。

LPL 是脂肪代謝的關鍵酶，催化產(chǎn)生甘油三酯，并將脂蛋白水解為脂肪酸和單甘油三酯，參與了脂肪酸合成和組織吸收利用的整個過程［10,33-34］。乳腺上皮細胞可以生成LPL，哺乳期LPL的酶活性較高，增加了乳腺中脂肪酸的釋放［31］。與健康奶牛的乳汁相比，乳房炎奶牛的乳汁中游離脂肪酸含量較高，但LPL活性較低［35］。與上述研究結果一致，本研究中LPL基因在E.coli型乳房炎奶牛的乳腺組織和炎性細胞模型中的表達量也顯著降低，這可能導致E.coli型乳房炎奶牛的乳腺中LPL的活性降低，抑制了脂肪酸的釋放，使得牛奶的乳脂率降低。

MFGE8基因在乳腺組織、乳腺上皮細胞及巨噬細胞中均存在［36］，但在乳腺上皮細胞中以乳糖蛋白的形式大量存在，且與泌乳量密切相關。此外，它還具有抗菌和抗病毒作用，在乳腺退化期間可清除凋亡的乳腺上皮細胞［12-13］。當缺乏MFGE8時，導致bMECs 凋亡和MFGs 的清除功能延遲，以及乳腺開始退化和產(chǎn)生炎癥反應［37］。以上研究表明，MFGE8在乳腺組織中發(fā)揮著重要作用。該結果與本實驗結果相似，即在E.coli型乳房炎發(fā)生或在bMECs 產(chǎn)生炎癥后，乳腺組織和bMECs 中MFGE8的表達量顯著降低。結合前人結果，推測MFGE8的表達量降低可能使得吞噬細胞凋亡能力降低，抗炎反應減弱，炎癥反應加劇，最終乳腺組織的功能減弱，導致乳脂合成和產(chǎn)奶量減少。

4 結論

E.coli型奶牛乳房炎發(fā)生和LPS 誘導bMECs 產(chǎn)生炎癥后，產(chǎn)奶相關基因CSN1S1、CSN2、LALBA、FABP3、LPL和MFGE8的表達量均顯著下降，可能導致乳蛋白合成減少、脂肪酸釋放降低和產(chǎn)奶量下降，解釋了E.coli型乳房炎發(fā)生過程中產(chǎn)奶量減少和乳脂率降低的原因，研究結果可為高產(chǎn)優(yōu)質的奶牛分子育種提供參考。