CHO 細(xì)胞多基因工程改造策略的建立及應(yīng)用

程靜雯 曹磊 張艷敏 葉倩 陳敏 譚文松 趙亮，

（1.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237；2.上海倍諳基生物科技有限公司，上海 201203）

CHO 細(xì)胞作為目前生物制藥工業(yè)領(lǐng)域生產(chǎn)重組蛋白的“主力軍”，擁有諸多優(yōu)勢(shì)，如生長(zhǎng)快速、易于適應(yīng)無(wú)血清懸浮培養(yǎng)、易于放大、生產(chǎn)工藝成熟、易轉(zhuǎn)染以及安全性高等［1-3］。盡管CHO 細(xì)胞獲得了廣泛的應(yīng)用，但其存在代謝效率低、代謝行為難以調(diào)控、產(chǎn)品質(zhì)量控制困難、細(xì)胞株遺傳不穩(wěn)定等諸多特點(diǎn)［4-8］，在某種程度上限制了治療性重組蛋白工業(yè)化生產(chǎn)效率的進(jìn)一步提升。長(zhǎng)期以來(lái)，建立適合工業(yè)應(yīng)用的高效表達(dá)重組蛋白的CHO 工程細(xì)胞株面臨著重大挑戰(zhàn)。近來(lái)，人們經(jīng)常在基因組上引入有利于細(xì)胞生長(zhǎng)維持或目標(biāo)蛋白表達(dá)的基因來(lái)提高CHO 細(xì)胞的性能［9］。但傳統(tǒng)隨機(jī)整合的方法存在許多根本性問(wèn)題，如整合位點(diǎn)不可控而帶來(lái)的不確定性。通過(guò)定點(diǎn)整合（site-specific integration, SSI）將目的基因（gene of interest, GOI）整合在基因組特異性位點(diǎn)處，能夠有效避免隨機(jī)整合帶來(lái)的不穩(wěn)定性。隨著基因編輯工具的高速發(fā)展，CRISPR/Cas9技術(shù)憑借成本效益高、易于使用、設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，獲得了廣泛的應(yīng)用，其中以基因敲入和基因敲除最為常見(jiàn)［10］。由于CHO 細(xì)胞生物信息學(xué)數(shù)據(jù)的不斷完善，基因組定點(diǎn)編輯在CHO 細(xì)胞中已有成功的嘗試［11-13］。

近年來(lái)，通過(guò)單次基因過(guò)表達(dá)或破壞基因表達(dá)來(lái)改變CHO 細(xì)胞某個(gè)單一功能的工程改造方法日趨成熟。如在提高細(xì)胞抗凋亡水平方面，Safari 等［14］在基因組Caspase7位點(diǎn)敲入EGFP基因以破壞Caspase7 蛋白的表達(dá)，Tan 等［15］過(guò)表達(dá)HSP27 蛋白，這兩種方式均獲得了具備抗凋亡能力的細(xì)胞株。然而，往往單個(gè)基因的改造只能改變單一表型甚至無(wú)法改變表型。因此，多基因同步改造成為具有卓越性能的下一代工程細(xì)胞株構(gòu)建的必經(jīng)之路。在一項(xiàng)對(duì)CHO 細(xì)胞懸浮適應(yīng)的研究中，Lee 等［16］利用CRISPR/Cas9 技術(shù)同步敲除5 個(gè)基因，結(jié)果表明Igfbp4基因和AqpI基因的功能缺失加速了CHO-K1細(xì)胞的懸浮適應(yīng)。目前，多基因同步改造主要用于多基因敲除或單基因片段刪除［17］。然而迄今為止，多基因同步改造仍缺少將破壞基因和過(guò)表達(dá)基因結(jié)合的同步改造方法。目前改造后細(xì)胞的特性往往僅源于敲入的基因或敲除的基因，這導(dǎo)致細(xì)胞功能單一，并且限制了多基因同步改造的廣泛應(yīng)用。

本研究選取細(xì)胞凋亡途徑中抗凋亡基因Bcl-2和蛋白巖藻糖基化通路中巖藻糖合成的關(guān)鍵酶基因FUT8作為模型基因，以此建立適合工業(yè)應(yīng)用工程細(xì)胞株構(gòu)建的定點(diǎn)同步敲入敲除基因編輯策略，并驗(yàn)證、評(píng)估其應(yīng)用潛力和可行性。這將促進(jìn)應(yīng)用于生物制藥工業(yè)領(lǐng)域的下一代工程細(xì)胞株的產(chǎn)生，既可節(jié)省多個(gè)重復(fù)步驟堆疊的時(shí)間，加速工程細(xì)胞株改造進(jìn)程，又能大大提升表型調(diào)控的成功率。

1 材料與方法

1.1 材料

pSpCas9（BB）-2A-Puro（PX459）V2.0 來(lái) 源 于Addgene，E.coliDH5α 感受態(tài)購(gòu)自擎科生物科技有限公司，所需引物均由擎科生物科技有限公司合成，CHO-K1 細(xì)胞系源自美國(guó)ATCC 公司，血液/組織/細(xì)胞基因組提取試劑盒、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒均購(gòu)自天根生化科技有限公司，BbsI-HF、NotI-HF、XmaI-HF、AflII-HF、MfeI-HF、T7EI、T4 連接酶均購(gòu)自NEB，DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自上海倍諳基生物科技有限公司，胎牛血清購(gòu)自上海BIOSUN 公司，胰酶購(gòu)自美國(guó)GIBCO 公司，高保真酶DNA 聚合酶、無(wú)縫重組克隆試劑盒均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒、cDNA 合成試劑盒、通用型qPCR 預(yù)混液、CCK-8 試劑盒均購(gòu)自翌圣生物科技股份有限公司，LCA Dylight 649 購(gòu)自美國(guó)Vectorlab 公司，重組Anti-Bcl-2 抗體購(gòu)自Abcam 公司，HRP-labeled Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）、嘌呤霉素、上樣緩沖液均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，10% SDS-PAGE、ECL 發(fā)光液均購(gòu)自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA/Cas9 表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及sgRNA 基因編輯效率檢測(cè) 由NCBI 網(wǎng)站在線工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）查找到CHO-K1 細(xì)胞基因組FUT8基因序列（Gene ID: 100751648），選擇FUT8基因外顯子1 和外顯子2 作為靶序列。根據(jù)網(wǎng)站（http://crispr.mit.edu/）中CRISPOR 系統(tǒng)對(duì)sgRNA 有效性與潛在脫靶位點(diǎn)的預(yù)測(cè)，設(shè)計(jì)了3 條sgRNA 并合成相應(yīng)寡核苷酸鏈，如表1 所示。先將寡核苷酸鏈退火結(jié)合，再用BbsI-HF 酶切PX459 質(zhì)粒載體，利用T4連接酶將退火產(chǎn)物和酶切載體連接起來(lái)，經(jīng)轉(zhuǎn)化和測(cè)序得到陽(yáng)性單菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，即得sgRNA/Cas9 表達(dá)質(zhì)粒。將構(gòu)建好的sgRNA/Cas9 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染CHO-K1 細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)染細(xì)胞池。提取該細(xì)胞池的基因組，以提取到的基因組為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，PCR 所用引物如表2 所示。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行退火反應(yīng)，在退火產(chǎn)物中加入1 μLT7EI酶，于37℃下反應(yīng)30 min，反應(yīng)產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 sgRNA 寡核苷酸鏈Table 1 sgRNA oligos

表2 T7E I 酶切實(shí)驗(yàn)引物Table 2 PCR primers for T7E I enzymatic digestion assay

1.2.2 供體表達(dá)盒的設(shè)計(jì)與構(gòu)建 供體表達(dá)盒中各元件包括啟動(dòng)子、目的基因、報(bào)告基因、連接子、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和靶點(diǎn)上下約800 bp 同源序列。人源Bcl-2基因（Gene ID: 596）由基因合成所得，其他各元件片段均采用高保真DNA 聚合酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)獲取，片段與酶切載體之間連接均采用無(wú)縫重組克隆試劑盒中重組酶進(jìn)行，再經(jīng)轉(zhuǎn)化、測(cè)序后提取質(zhì)粒。同源序列選取sgRNA2 5′-ATAAAACAATAAGGTCCCCC-3′引導(dǎo)Cas9 切割位置的上下游長(zhǎng)約800 bp 片段，稱之為同源臂（arm）。供體表達(dá)盒的結(jié)構(gòu)為5′arm-CMV（E+P）-Bcl2 -T2AEGFP-bGH poly（A）-3′arm，質(zhì)粒圖譜如圖1 所示。

圖1 供體質(zhì)粒的圖譜Fig. 1 Map of donor plasmid

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建 將細(xì)胞提前以4×105cells/well 接種于六孔板中。待細(xì)胞匯合度約80%-90%，將供體表達(dá)盒線性化片段和sgRNA/Cas9表達(dá)質(zhì)粒以摩爾比1∶1 共轉(zhuǎn)染CHO-K1 細(xì)胞。供體表達(dá)盒線性化片段是以Bcl-2 供體質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)獲得的，經(jīng)純化后使用。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后傳2-3 代，收集細(xì)胞，利用流式分選儀將表達(dá)增強(qiáng)綠色熒光蛋白的（enhanced green fluorescent protein, EGFP）單克隆細(xì)胞分選出來(lái)，接種至96 孔板里，每孔含有200 μL 生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

1.2.4 基因分子水平檢測(cè) 提取EGFP 陽(yáng)性單克隆細(xì)胞基因組，以提取的基因組為模板，反應(yīng)條件如下：95℃ 3 min；35X：95℃ 15 s；62℃ 15 s；72℃ 45 s/kb；72℃ 5 min，進(jìn)行5′ junction PCR、3′ junction PCR 和out-out PCR 三輪PCR 鑒定，所需引物如表3 所示。5′junction PCR 和3′ junction PCR 是檢測(cè)基因定點(diǎn)整合情況，out-out PCR 是鑒定單克隆細(xì)胞是純合子還是雜合子。

表3 定點(diǎn)整合驗(yàn)證所需引物Table 3 Primers for site-specific integration

提取目標(biāo)單克隆細(xì)胞的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，利用qPCR 檢測(cè)內(nèi)源性Bcl-2基因、外源性Bcl-2基因和FUT8基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)量。所需引物如表4 所示，結(jié)果使用2-△△CT計(jì)算得到mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

表4 qPCR 引物序列Table 4 Primers for qPCR

1.2.5 目的蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 使用流式細(xì)胞術(shù)分析熒光比例及強(qiáng)度對(duì)EGFP 蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，均以野生型CHO-K1 細(xì)胞為陰性對(duì)照。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)前，細(xì)胞需用PBS 緩沖溶液洗滌幾遍，并用其重懸至密度約為1×106cells/mL。Bcl-2 蛋白檢測(cè)采用Western blot 方法。取100 μL 裂解液裂解1×106個(gè)細(xì)胞沉淀，4℃ 12 000 r/min 離心30 min，收上清。樣品于95℃沸水煮5 min。將制備好的樣品加進(jìn)10% SDS-PAGE 膠孔里，濃縮膠80 V 跑15 min，分離膠恒壓120 V跑75 min。電泳結(jié)束后，以恒壓120 V，100 min 的條件進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。PVDF 膜于封閉液中室溫下緩慢搖晃1 h。之后，一抗孵育2 h，4℃過(guò)夜。次日，二抗孵育1 h，最后用多功能凝膠成像分析儀獲得圖像。

1.2.6 無(wú)血清條件培養(yǎng)下細(xì)胞活力檢測(cè) 以每孔8 000 個(gè)細(xì)胞接種在96 孔板中，每孔100 μL 培養(yǎng)基，以野生型CHO-K1 細(xì)胞作為對(duì)照組，設(shè)置不加細(xì)胞的空白組。培養(yǎng)18 h，將培養(yǎng)基更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)72 h 和96 h，用CCK-8 試劑檢測(cè)72 h和96 h 的細(xì)胞活率。

1.2.7 細(xì)胞FUT8 蛋白酶功能檢測(cè) 利用小扁豆凝集素（lens culinaris lectin, LCA）與細(xì)胞膜N-聚糖上的核心巖藻糖特異性的結(jié)合驗(yàn)證FUT8 蛋白酶功能。以每孔4×105個(gè)細(xì)胞接種于六孔板中培養(yǎng)18-24 h。每孔加入終濃度為20 μg/mL 熒光標(biāo)記的小扁豆凝集素（Dylight 649-LCA），室溫反應(yīng)45 min。反應(yīng)結(jié)束，使用流式熒光術(shù)檢測(cè)熒光比例。

1.2.8 細(xì)胞抗凋亡性能評(píng)估 嘌呤霉素可以應(yīng)用于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。以每孔3×105個(gè)細(xì)胞接種于六孔板中培養(yǎng)18-24 h，更換培養(yǎng)基為帶有終濃度為10 μg/mL 嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基。24 h 后，消化收集細(xì)胞，通過(guò)雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡分布的比例。

2 結(jié)果

2.1 sgRNA基因編輯有效性檢測(cè)

在CHO-K1 細(xì)胞基因組FUT8基因外顯子1 和外顯子2 共設(shè)計(jì)了3 條sgRNA。通過(guò)T7EI 酶切實(shí)驗(yàn)檢測(cè)sgRNA 在CHO-K1 細(xì)胞內(nèi)實(shí)際基因編輯效率。若細(xì)胞池內(nèi)發(fā)生了基因編輯事件，那么Cas9切割雙鏈DNA 形成了缺口，在缺口處會(huì)發(fā)生堿基錯(cuò)配，則T7EI 酶能特異性識(shí)別并切割錯(cuò)配的雙鏈DNA。T7EI 酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2，每個(gè)泳道中紅色箭頭標(biāo)注的條帶即為T(mén)7EI 酶切后形成，說(shuō)明sgRNA 在靶點(diǎn)處能夠有效編輯。對(duì)圖中條帶灰度值進(jìn)行分析，得到sgRNA 的有效編輯效率，分別為9.85%、10.1%和3.02%，因此后續(xù)均使用sgRNA2 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖2 sgRNA 基因編輯效率檢測(cè)結(jié)果Fig. 2 Results of sgRNA gene editing efficiency

2.2 定點(diǎn)同步敲入敲除基因編輯策略的建立

2.2.1 定點(diǎn)同步雙敲細(xì)胞株的獲得 根據(jù)定點(diǎn)同步敲入敲除基因編輯策略原理圖（圖3），通過(guò)該策略成功發(fā)生定點(diǎn)整合事件的細(xì)胞株能夠表達(dá)綠色熒光，未發(fā)生定點(diǎn)整合事件的細(xì)胞株則無(wú)法表達(dá)綠色熒光。將供體表達(dá)盒線性化片段與sgRNA/Cas9 表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，收集共轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞株，利用流式分選儀分選出EGFP 陽(yáng)性的單克隆細(xì)胞，接種于96 孔板中，培養(yǎng)12-14 d。

圖3 定點(diǎn)同步敲入敲除基因編輯策略原理圖Fig. 3 Schematic diagram of the site-specific synchronous knock-in and knock-out gene editing strategy

在熒光顯微鏡下標(biāo)記表達(dá)綠色熒光的單克隆細(xì)胞并提取其基因組DNA。以提取的基因組為模板，進(jìn)行5′ junction PCR、3′ junction PCR 和out-out PCR 3 輪PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。通過(guò)3 輪反應(yīng)，從36 個(gè)表達(dá)綠色熒光的單克隆細(xì)胞中，篩選出3 個(gè)在FUT8 靶基因處成功整合供體表達(dá)盒片段的單克隆細(xì)胞，故成功實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)整合的占比為8.3%，剩下33 個(gè)表達(dá)綠色熒光的單克隆細(xì)胞為隨機(jī)整合細(xì)胞，占比為91.7%。如圖4 所示為其中一株成功實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)整合的單克隆細(xì)胞株的鑒定結(jié)果，從圖中可知，該單克隆細(xì)胞的基因組DNA 經(jīng)5′ junction PCR 和3′ junction PCR 均擴(kuò)增出一條明顯條帶。由測(cè)序結(jié)果顯示5′端同源臂以及CMV（E+P）片段缺失了部分序列，但剩余CMV（E+P）片段仍能作為啟動(dòng)子使用。3′junction PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的序列基本符合預(yù)期設(shè)計(jì)。由此驗(yàn)證了供體表達(dá)盒片段被精確整合到FUT8基因靶點(diǎn)處。Out-out PCR 產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示，野生型細(xì)胞擴(kuò)增片段大約2 200 bp，成功定點(diǎn)整合的單克隆細(xì)胞擴(kuò)增片段約4 700 bp，符合預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物的大小且條帶單一、明亮，表明該單克隆細(xì)胞株為純合子，即為通過(guò)定點(diǎn)同步敲入敲除基因編輯策略構(gòu)建的工程細(xì)胞株，簡(jiǎn)稱為定點(diǎn)同步雙敲細(xì)胞株。

圖4 定點(diǎn)同步雙敲細(xì)胞分子鑒定結(jié)果Fig. 4 Molecular identification results of the site-specific synchronous double-knock cell

2.2.2 定點(diǎn)同步雙敲細(xì)胞株敲入和敲除基因的表達(dá)水平 供體表達(dá)盒片段成功整合于CHO-K1 細(xì)胞FUT8基因靶點(diǎn)處，可通過(guò)qPCR、Western blot 和流式細(xì)胞術(shù)鑒定表達(dá)盒中基因的表達(dá)水平。由圖5-A-C結(jié)果顯示（****P<0.000 1，**P<0.01，n=3），當(dāng)內(nèi)源性Bcl-2基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平幾乎無(wú)差異時(shí)，細(xì)胞外源性Bcl-2基因的mRNA 表達(dá)量遠(yuǎn)高于野生型CHO-K1 細(xì)胞，說(shuō)明外源Bcl-2基因在CHO-K1 細(xì)胞內(nèi)成功過(guò)表達(dá)。由于供體表達(dá)盒上存在轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)元件，故FUT8基因靶點(diǎn)后序列沒(méi)有成功轉(zhuǎn)錄。經(jīng)過(guò)Western blot 和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，如圖5-D, E 所示，說(shuō)明了EGFP 綠色熒光蛋白和Bcl-2 蛋白過(guò)表達(dá)成功。

當(dāng)細(xì)胞中FUT8 酶的功能喪失后，細(xì)胞就不能正常合成含有核心巖藻糖的N-聚糖的膜蛋白，則不能與LCA 結(jié)合。如圖5-F 所示，與野生型CHO-K1細(xì)胞相比，定點(diǎn)同步雙敲細(xì)胞無(wú)法與LCA 相結(jié)合，在熒光通道下不顯示熒光，F(xiàn)UT8 酶蛋白功能性喪失，F(xiàn)UT8基因敲除成功。

圖5 定點(diǎn)同步雙敲細(xì)胞基因表達(dá)水平Fig. 5 Gene expressions of the site-specific synchronous double-knock cell

2.3 定點(diǎn)同步敲入敲除基因編輯策略的可行性評(píng)估

2.3.1 定點(diǎn)同步雙敲細(xì)胞株基因表達(dá)穩(wěn)定性評(píng)估 對(duì)細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)，利用流式熒光儀對(duì)傳代40 d 和60 d 的細(xì)胞的綠色熒光蛋白表達(dá)比例與熒光強(qiáng)度定量分析。如圖6 結(jié)果所示，定點(diǎn)雙敲細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白的比例及熒光強(qiáng)度經(jīng)傳代培養(yǎng)維持穩(wěn)定，表明通過(guò)定點(diǎn)同步敲入敲除基因編輯策略構(gòu)建的工程細(xì)胞株能夠至少維持60 d 基因表達(dá)穩(wěn)定。

圖6 基因表達(dá)穩(wěn)定性結(jié)果Fig. 6 Stability results of gene expression

2.3.2 定點(diǎn)同步雙敲細(xì)胞株在無(wú)血清培養(yǎng)基下的活力 在無(wú)血清培養(yǎng)條件下，如圖7 所示，定點(diǎn)同步雙敲細(xì)胞的活細(xì)胞比例均比野生型細(xì)胞提高了約30%（*P<0.05，n=3）?？梢?jiàn)在無(wú)血清條件下，定點(diǎn)同步雙敲細(xì)胞由于Bcl-2 蛋白過(guò)表達(dá)賦予了細(xì)胞在缺少生長(zhǎng)因子時(shí)的自我保護(hù)能力，展現(xiàn)出對(duì)血清剝奪的耐受度更強(qiáng)。

圖7 無(wú)血清條件下細(xì)胞活率Fig. 7 Cell viability under serum-free condition

2.3.3 定點(diǎn)同步雙敲細(xì)胞株抗凋亡性能鑒定 將細(xì)胞處于10 μg/mL 嘌呤霉素條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h 后，如圖8 結(jié)果所示（*P<0.05，**P<0.01，n=3），定點(diǎn)同步雙敲細(xì)胞無(wú)論是晚期凋亡還是早期凋亡水平，均低于野生型細(xì)胞。在活細(xì)胞水平上，定點(diǎn)同步雙敲細(xì)胞高于野生型細(xì)胞約30%。該結(jié)果表明，Bcl-2蛋白過(guò)表達(dá)能夠使細(xì)胞抵御由凋亡誘導(dǎo)劑引發(fā)的細(xì)胞凋亡，對(duì)于細(xì)胞具有一定程度抗凋亡的保護(hù)作用。

圖8 定點(diǎn)同步雙敲細(xì)胞抗凋亡性能評(píng)估Fig. 8 Evaluation on the anti-apoptotic properties of the site-specific synchronous double-knock cell

3 討論

近年來(lái)，關(guān)于如何進(jìn)一步提升CHO 細(xì)胞工業(yè)化生產(chǎn)效率的問(wèn)題，研究員們已經(jīng)進(jìn)行了多方面的嘗試。其中，通過(guò)各類(lèi)基因工程技術(shù)改變宿主細(xì)胞特性以獲得更強(qiáng)健的工程細(xì)胞株的方式，獲得了廣泛應(yīng)用。但經(jīng)基因工程改造后的細(xì)胞株仍可能存在各種問(wèn)題，例如，表型沒(méi)有明顯變化導(dǎo)致無(wú)法達(dá)到預(yù)期效果、穩(wěn)定性欠佳等，這些問(wèn)題成為限制其進(jìn)一步工業(yè)化應(yīng)用的主要障礙。本研究通過(guò)合理的設(shè)計(jì)，建立了可行的適合工業(yè)應(yīng)用工程細(xì)胞株構(gòu)建的定點(diǎn)同步敲入敲除基因編輯策略，該策略中敲入和敲除的基因均能夠發(fā)揮作用，一次操作賦予細(xì)胞多個(gè)新的特性。

對(duì)于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)治療性蛋白而言，將CHO 細(xì)胞適應(yīng)于無(wú)血清懸浮培養(yǎng)是一個(gè)必不可少的環(huán)節(jié)。本研究構(gòu)建的定點(diǎn)同步雙敲細(xì)胞株具備較好的抗凋亡性能，該細(xì)胞株對(duì)血清剝奪的耐受性更高，有望在細(xì)胞懸浮適應(yīng)中表現(xiàn)出更大的優(yōu)勢(shì)，有應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的潛力。FUT8 蛋白是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中巖藻糖合成途徑的關(guān)鍵酶，破壞FUT8 蛋白表達(dá)有利于細(xì)胞表達(dá)低巖藻糖或無(wú)巖藻糖的重組抗體。據(jù)報(bào)道，巖藻糖的存在會(huì)抑制抗體重鏈 Fc 區(qū)與NK細(xì)胞膜上FcγRIIIa 受體的結(jié)合，可顯著影響抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC）的活性［18］，而去除巖藻糖的重組抗體則擁有更高的ADCC 活性。因此，定點(diǎn)同步雙敲細(xì)胞株可應(yīng)用于生產(chǎn)低巖藻糖或無(wú)巖藻糖的治療性蛋白，由此也說(shuō)明定點(diǎn)同步敲入敲除基因編輯策略具有可行性與潛在的應(yīng)用價(jià)值。

本研究結(jié)果表明，定點(diǎn)同步雙敲細(xì)胞株5′端表達(dá)盒和同源臂部分的連接屬于不完整連接，其丟失了表達(dá)盒的部分序列。這種不完整連接可能是由于使用了線性化DNA 片段轉(zhuǎn)染細(xì)胞，而在核酸外切酶的作用下以及染色體末端切除，可能會(huì)導(dǎo)致在細(xì)胞內(nèi)供體表達(dá)盒DNA 片段末端發(fā)生降解，因此，基于避免不完整連接發(fā)生的基因敲入方式的研究具有重要意義。除了通過(guò)同源定向修復(fù)（homology-dependent recombination, HDR）介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)了基因敲入外［19］，Wang 等［20］以非同源末端連接（non-homologous end joining, NHEJ）介導(dǎo)的方式也能夠達(dá)到基因敲入的目的，實(shí)現(xiàn)多基因整合。與HDR 途徑相比，NHEJ 途徑可活躍于整個(gè)細(xì)胞周期內(nèi)［21］，但應(yīng)用于基因敲入時(shí)可能會(huì)存在表達(dá)盒插入方向的問(wèn)題［22］，故用于提高基因敲入效率的基于不同修復(fù)途徑的供體載體模板的設(shè)計(jì)仍待進(jìn)一步優(yōu)化。除了供體載體的優(yōu)化能夠影響基因整合效率外［23-24］，使用如NHEJ 途徑抑制劑等化學(xué)處理方式通過(guò)影響NHEJ 途徑或HDR 途徑，從而改善基因敲入水平［25］。但有研究表明，化學(xué)處理并沒(méi)有改善HDR 介導(dǎo)的靶向整合［26］，說(shuō)明CHO 細(xì)胞對(duì)這類(lèi)試劑不敏感，因此對(duì)于調(diào)節(jié)通路的試劑還可以進(jìn)一步篩選與嘗試。

4 結(jié)論

本研究建立了定點(diǎn)同步敲入敲除基因編輯策略，該策略構(gòu)建的CHO 雙功能細(xì)胞株，不僅具備較好的抗凋亡性能，且FUT8 蛋白酶功能也遭到破壞。由此表明該策略具備較好的可行性和實(shí)際工業(yè)應(yīng)用潛力。