萊茵衣藻藍(lán)光受體植物類型隱花色素CRY 突變體的表型鑒定

李旺寧 張豪杰 李亞男 梁夢(mèng)靜 季春麗 張春輝 李潤植崔玉琳 秦松 崔紅利

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，太谷 030801；2. 中國科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所 海岸帶生物學(xué)與生物資源保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，煙臺(tái) 264003）

光不僅能提供光合作用的驅(qū)動(dòng)力，其自身蘊(yùn)含的光信息對(duì)植物生長、發(fā)育、代謝及適應(yīng)環(huán)境均具有重要作用［1］，而且還作為光信號(hào)參與調(diào)控植物生長發(fā)育的各個(gè)方面，如種子萌發(fā)［2］、器官生長方向［3-4］、葉片和繁殖器官在空間上的排列方式［5］、葉綠體運(yùn)動(dòng)［6］及開花時(shí)間等［7］。因此，植物進(jìn)化出一套針對(duì)不同波段太陽光并由光受體介導(dǎo)的光感知與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。

光受體是介導(dǎo)植物對(duì)光信號(hào)作出反應(yīng)的一類生物大分子物質(zhì)，可以感知光強(qiáng)、波長以及方向等，從而調(diào)控植物作出相應(yīng)的生理反應(yīng)，最終引起植物個(gè)體表型上的變化［8］。根據(jù)感受不同的光質(zhì)，目前發(fā)現(xiàn)的光受體類型包括紅光/遠(yuǎn)紅光受體——光敏色素（phytochrome, PHY）、藍(lán)光受體——隱花色素（cryptochrome, CRY）、向光素（phototropin, PHOT）和紫外光受體-UV（UV-B）。植物依靠藍(lán)光受體隱花色素（CRY）和向光素（PHOT）感知藍(lán)光信號(hào)，并通過復(fù)雜的接收和轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，進(jìn)而與體內(nèi)其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑耦聯(lián)，最終調(diào)控藍(lán)光響應(yīng)生理過程，藍(lán)光在高等和低等植物生長發(fā)育過程中十分重要，能夠調(diào)控光形態(tài)發(fā)生、葉綠體運(yùn)動(dòng)、下胚軸生長、開花時(shí)間、生物鐘、生物節(jié)律、趨光性及次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成等［9］。

隱花色素（CRY）是一類光裂合酶的黃素蛋白，其作用是調(diào)控藍(lán)光下一些基因的表達(dá)及調(diào)控植物的光形態(tài)建成［10-12］。CRY 蛋白包括N 端光裂合酶同源結(jié)構(gòu)域（photolyase homologous region, PHR）和C 端延伸的羧基端延伸結(jié)構(gòu)域（CRYC-terminal extension, CCE）［13］。PHR 結(jié)構(gòu)域由光裂解酶進(jìn)化而來氨基酸序列比較保守，負(fù)責(zé)黃素腺嘌呤核苷酸（flavin adenine dinucleotide, FAD）和甲基四氫葉酸（N5-methyltetrahydrofolicacid, MTHF）的結(jié)合，CCE結(jié)構(gòu)域氨基酸序列多變有很大差異，但具有相同的DAS（DQXVP-Acidic-STAESSS）基序［11］，被認(rèn)為是光信號(hào)傳遞的主要結(jié)構(gòu)域［14］。研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中有2 個(gè)植物類型CRYs（CRY1 和CRY2）、1 個(gè)動(dòng)物類型CRY［15］和1 個(gè)DASH（Drosophila、Arabidopsis、Synechocystis和Homo） 類 型CRY［16］。3 種 類 型CRYs 的細(xì)胞定位、表達(dá)模式、功能及作用機(jī)制都不完全相同［17］。

CRY 在真核微藻中分布廣泛，并存在多個(gè)基因拷貝。真核微藻來源的CRY 主要包括動(dòng)物類型（aCRY）、DASH 類型（dashCRY）和植物類型（pCRY）3 大類。在硅藻（Diatom）［18］和褐藻（Brown algae）［19］中發(fā)現(xiàn)了aCRY。海洋來源綠藻（Ostreococcus tauri）中分別發(fā)現(xiàn)了aCRY（OtCPF1）［20］和dashCRY（OtCPF2）［21］，并在另一株海洋綠藻（Ostreococcus lucimarinus）中發(fā)現(xiàn)了5 個(gè)編碼CPF 的基因，但這兩株綠藻中都沒有發(fā)現(xiàn)pCRY［21］。據(jù)報(bào)道，紅藻（Cyanidioschyzon merolae）［22］和等鞭藻（Isochrysis galbana）［23］中存在pCRY，在團(tuán)藻（Volvox carteri）和萊茵衣藻中分別發(fā)現(xiàn)了4 個(gè)CRYs，1 個(gè)植物類型pCRY、1 個(gè)動(dòng)物類型aCRY 和2 個(gè)DASH 類型［24-25］。團(tuán)藻pCRY 在體細(xì)胞中大量表達(dá)，而在生殖細(xì)胞中很少表達(dá)［24］。萊茵衣藻中aCRY 不但可以感受藍(lán)光信號(hào)，同時(shí)可以感受部分紅光信號(hào)，通過構(gòu)建萊茵衣藻aCRY 的突變株，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期循環(huán)、節(jié)律調(diào)節(jié)、葉綠素及類胡蘿卜素合成相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平上受到其調(diào)控［26］。pCRY 在黑暗下積累，在藍(lán)光和紅光條件下通過光依賴性蛋白酶迅速降解，其對(duì)藍(lán)光響應(yīng)的光譜特征已經(jīng)在體外進(jìn)行驗(yàn)證［24-25,27］。

關(guān)于向光素以及aCRY 的突變以及突變之后的表型變化已有文獻(xiàn)報(bào)道，但pCRY 還未見報(bào)道。結(jié)合前人研究，海洋綠藻和淡水綠藻在2 種不同環(huán)境下的諸多生理差異以及不同藻株之間可能存在差異，對(duì)不同來源萊茵衣藻及CRY 突變株的表型也有待進(jìn)一步的研究。

本研究以衣藻野生株CC5325 和突變株crcry為研究對(duì)象，對(duì)野生株CC5325 和突變株crcry藻株進(jìn)行比較分析，從生長、色素、光合及油脂合成等方面比較其在正常光照CK（Control）與藍(lán)光BL（Blue light）培養(yǎng)條件下的表型差異，以期評(píng)估cry在萊茵衣藻藍(lán)光響應(yīng)過程中所發(fā)揮的功能，為進(jìn)一步生物學(xué)功能及調(diào)控機(jī)制的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種 試驗(yàn)所用的萊茵衣藻野生株CC5325和突變株crcry（Cre.06.g295200）均購自衣藻資源中心［28］，現(xiàn)保存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所。

1.1.2 培養(yǎng)條件 藻株培養(yǎng)條件設(shè)置為溫度（24±1）℃， 光12 h/ 暗12 h、20 μmol/（m2·s），采用TAP（Tris-Acetate-Phosphate medium）培養(yǎng)基，crcry添加濃度為10 μg/mL 的巴龍霉素培養(yǎng)，每天定時(shí)手動(dòng)搖瓶3-4 次，防止細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)至藻細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)期。搖勻，取CC5325 和crcry各3 mL 至250 mL 錐形瓶中（含100 mL TAP 液體培養(yǎng)基），將裝有CC5325 和crcry的錐形瓶放置黑暗中適應(yīng)24 h，之后置于CK 條件和BL 條件下，每隔2 d 定時(shí)取樣用于各項(xiàng)生理指標(biāo)的測(cè)定。

1.1.3 光質(zhì) 試驗(yàn)中分別設(shè)置正常（白光）和藍(lán)光培養(yǎng)條件，以白光作為對(duì)照，連續(xù)24 h 光照。采用歐普照明LED 白光和藍(lán)光2 種光質(zhì)的燈具（40 W方形30 cm×30 cm，光照強(qiáng)度為1 100 lx，藍(lán)光波普范圍550 nm），光源安裝在培養(yǎng)架兩側(cè)，每塊LED燈板包括160 個(gè)LED 燈。通過移動(dòng)錐形瓶與LED 燈的距離來調(diào)節(jié)強(qiáng)度，光強(qiáng)使用TES 1332A 勒克斯計(jì)測(cè)量，在試驗(yàn)前連續(xù)照射24 h 使系統(tǒng)穩(wěn)定。每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1crcry突變體的分子鑒定 收集培養(yǎng)對(duì)數(shù)期的藻液離心備用，以CC5325 和crcry基因組DNA 和cDNA 為模板進(jìn)行PCR。采用CTAB 法提取CC5325和crcry的基因組DNA，根據(jù)ChlaMmeSeq 方法［29］，擴(kuò)增3 個(gè)片段用于測(cè)序，以確定crcry的確切插入位點(diǎn)。（1）用基因cry引物F+R 預(yù)測(cè)插入位點(diǎn)；（2）F+C1（插入盒下游引物）與引物對(duì)的5′插入盒基因組連接；（3）（插入盒上游引物）C2+R 與引物對(duì)的3′插入盒基因組連接。采用Trizol（杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司）試劑提取CC5325 和crcry總RNA，參照TaKaRa 公司的試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser）將RNA 反 轉(zhuǎn) 錄 成cDNA，用引物Actin-F+Actin-R 和cry-F+cry-R 驗(yàn)證。所有用于PCR 鑒定的引物見表1。反應(yīng)體系如表2所示，反應(yīng)程序?yàn)?8℃ 5 min；98℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30 個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

表1 引物信息Table 1 Primers information

表2 PCR 反應(yīng)體系Table 2 PCR reaction system

1.2.2 細(xì)胞密度的測(cè)定 每天定時(shí)吸取10 μL 搖勻的藻液，置于視野為40×10 倍的光學(xué)顯微鏡下觀察，采用血球計(jì)數(shù)板（25×16 型）對(duì)萊茵衣藻細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

細(xì) 胞 密 度（cells·mL-1）=80 小 格 內(nèi) 細(xì) 胞 個(gè)數(shù)/（80×400×10 000×稀釋倍數(shù)）

1.2.3 單位細(xì)胞色素含量的測(cè)定 取5 mL 藻液4 500 r/min 離心10 min，棄上清液后向沉淀中加入與藻液等體積的95%乙醇充分混勻，75℃水浴15 min，冷卻后4 500 r/min 離心10 min，用分光光度計(jì)測(cè)上清液在665、649 和470 nm 的OD 值，根據(jù)公式［30］計(jì)算藻細(xì)胞中葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素的濃度Chla、Chlb 和Car（mg/L）含量。

Chla=13.95×OD665-6.88×OD649

Chlb=24.96×OD649-7.32×OD665

Car=（1 000×OD470-2.05×Chla-114.8×Chlb）/245

單位細(xì)胞色素含量（ng/cell）＝［色素含量（mg/L）/細(xì)胞密度（cells·mL-1）］×107

1.2.4 光合作用活性的測(cè)定 使用MINI-PAM-II 葉綠素?zé)晒鈨x（H. Walz. Effeltrich, Germany）測(cè)定藻細(xì)胞的光化學(xué)活性（光化光設(shè)置為72 μmol/（m2·s））。藻液避光暗處理20 min，再檢測(cè)光合生理指標(biāo)的變化。實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率（effective photo-chemical quantum yield of PSII, Y（II））、最大光能轉(zhuǎn)換效率（maximum photochemical quantum yield of PSII, Fv/Fm）、光化學(xué)淬滅系數(shù)（coefficient of photochemical fluorescence quenching, qP） 和非光化學(xué)淬滅系數(shù)（non-photochemical quenching, NPQ）。 光 處 理5 min 后測(cè)定Y（II）和PAR 值，根據(jù)公式ETR=Y（II）×PAR×0.5×0.84 計(jì)算相對(duì)電子傳遞速率（electron transport rate, ETR）值。

1.2.5 總脂含量的測(cè)定 總脂含量的測(cè)定參照邵雪梅［31］方法，稱取冷凍干燥后的藻粉50 mg，每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。藻粉中加入2.5 mL 氯仿、5 mL 甲醇，在37℃搖床中抽提24 h 后離心收集上層有機(jī)相，剩余藻粉殘?jiān)貜?fù)抽提2 次。合并3 次所得的上層有機(jī)相，加入5 mL 氯仿和9 mL 氯化鈉溶液（10 g/L），離心后收集下層有機(jī)相到玻璃管中，用氮吹儀吹干樣品至恒重。

總脂含量（%）=（總脂重量/藻粉重量）×100%

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 對(duì)照組和處理組均設(shè)置3 個(gè)平行，采用excel（2019）和SPSS 25.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析法進(jìn)行顯著性分析（P<0.05），繪圖采用Origin9 軟件（OriginLab Corporation, USA）。

2 結(jié)果

2.1 萊茵衣藻crcry突變體的鑒定

根據(jù)衣藻庫（Clip）（https://www.chlamylibrary）對(duì)突變株crcry的描述，cry在其CDS 編碼區(qū)有一個(gè)盒反向插入（圖1-a）。為了驗(yàn)證該插入，分別在DNA 水平和RNA 水平進(jìn)行驗(yàn)證。DNA 水平上用3對(duì)引物（cry-F+cry-R、cry-F+Cassette-C1 和Cassette-C2+cry-R，引物見表1）進(jìn)行PCR。F（正向）和R（反向）分別位于假定插入位點(diǎn)的上游和下游，C1（反向）和C2（正向）分別位于盒的3′和5′端（圖1-a）。以CC5325 基因組DNA 為模板，只有F+R 產(chǎn)生PCR產(chǎn)物（300-400 bp）。相反，以cry基因組DNA 為模板，F(xiàn)+R 沒有產(chǎn)生PCR 產(chǎn)物，而F+C1 和C2+R 各有一條PCR 產(chǎn)物（F+C1：300-400 bp，C2+R：700-1 000 bp）（圖1-b）。RNA 水平上用引物（Actin-F 與Actin-R 和cry-F 與cry-R，引物見表1）進(jìn)行PCR，分別以CC5325 和crcry的cDNA 為模板，Actin-F 和Actin-R 各有一條PCR 產(chǎn)物（300-400 bp），cry-F 和cry-R 之間野生株CC5325 有一個(gè)PCR 產(chǎn)物（300-400 bp），相反，突變株crcry沒有產(chǎn)生PCR 產(chǎn)物（圖1-c）。表明盒成功插入并且表達(dá)。對(duì)這兩個(gè)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果證實(shí)該盒以反義方向插入crcry的CDS編碼區(qū)中，保持其完整的5′和3′端（圖1-a）。

對(duì)野生株CC5325 和突變株crcry進(jìn)行固體平板以及液體篩選驗(yàn)證。萊茵衣藻CC5325 不具有巴龍霉素抗性，在含10 μg/mL 巴龍霉素的TAP 篩選平板上不能生長；突變株crcry有巴龍霉素抗性基因，能夠在含巴龍霉素的篩選平板上正常生長。將CC5325和crcry涂布于含有巴龍霉素的TAP 固體平板上（圖1-d），弱光培養(yǎng)一周左右，可以看出CC5325 在含有巴龍霉素的平板上變白，而crcry生長出綠色單藻落。之后在含有巴龍霉素的TAP 液體培養(yǎng)體系中再次進(jìn)行驗(yàn)證（圖1-e），與圖1-d 結(jié)果相同，CC5325 藻株在含有巴龍霉素的培養(yǎng)基中不能生長，但crcry能夠正常生長。以上結(jié)果證明crcry突變株中AphVIII抗性基因成功表達(dá)，隨后在TAP 液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 萊茵衣藻crcry 突變體的鑒定Fig.1 Identification of C. Reinhardtii crcry mutant

2.2 藍(lán)光對(duì)萊茵衣藻野生株CC5325和突變株crcry生長的影響

用細(xì)胞密度來表示萊茵衣藻的生長情況。從圖2 可以看出，正常光與藍(lán)光條件下CC5325 存在差異，且在藍(lán)光條件下生長較快。2 種光照條件下，crcry生長存在很大差異，藍(lán)光下crcry生長明顯受到抑制。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞密度均在第6 天達(dá)到最大，CK-CC5325、CK-crcry、BL-CC5325 和BL-crcry的細(xì)胞數(shù)分別為2.124×107、2.249×107、2.423×107和1.563×107cells·mL-1，藍(lán)光下CC5325 細(xì)胞數(shù)目是正常光下的1.14 倍，crcry是0.69 倍（圖2）。培養(yǎng)到第8 天，正常光照條件下，CC5325 與crcry顏色差異不顯著，較前期相比，藻液顏色變黃；藍(lán)光條件下，CC5325 與crcry顏色差異較顯著，CC5325長勢(shì)比crcry好。在正常光與藍(lán)光條件下，CC5325差異不顯著，crcry差異顯著，藍(lán)光條件下crcry顏色較黃。結(jié)果表明，正常光對(duì)衣藻CC5325 和crcry影響不大，然而藍(lán)光條件對(duì)衣藻CC5325 和crcry影響較明顯。

圖2 藍(lán)光對(duì)萊茵衣藻CC5325 和crcry 生長的影響Fig. 2 Effects of blue light on the growth of C. reinhardtii CC5325 and crcry

2.3 藍(lán)光對(duì)萊茵衣藻野生株CC5325和突變株crcry單位細(xì)胞色素的影響

由圖3 可知，藍(lán)光輻射對(duì)萊茵衣藻單位細(xì)胞內(nèi)色素的積累影響較大，且影響效果與處理時(shí)間有關(guān)。無論在正常光還是藍(lán)光條件下，CC5325 與crcry的單位細(xì)胞色素含量前期均呈上升趨勢(shì)，后期趨于平緩乃至降低。培養(yǎng)至第4 天，CC5325 與crcry在正常光下顏色差異不明顯，但在藍(lán)光下差異非常顯著。CC5325 與crcry的單位細(xì)胞葉綠素a、葉綠素b 和總?cè)~綠素含量均無明顯差異。藍(lán)光下crcry顯著低于CC5325，其單位細(xì)胞葉綠素a 的含量為3.92×10-4ng/cell（圖3-a）、葉綠素b 為2.26×10-4ng/cell（圖3-b）、總 葉 綠 素 為6.12×10-4ng/cell（圖3-c），與CC5325 相比，crcry的葉綠素a、葉綠素b 和總?cè)~綠素分別下降了48.97%、64.53%和67.44%。在正常光下單位細(xì)胞中類胡蘿卜素差異不顯著，但在藍(lán)光下，crcry中類胡蘿卜素顯著高于CC5325，含量為1.97×10-4ng/cell（圖3-d），與CC5325 相比，增高了65.27%。單位細(xì)胞總色素在正常光下也沒有差異，在藍(lán)光下差異顯著，CC5325 與crcry細(xì)胞中總色素含量分別為11.44×10-4和7.95×10-4ng/cell（圖3-e），與CC5325 相比，crcry降低30.65%。單位細(xì)胞總色素的含量取決于總?cè)~綠素和類胡蘿卜素，盡管crcry類胡蘿卜素含量高，但由于葉綠素含量所占的比例較大，所以crcry總色素仍然低于CC5325。正常光下類胡蘿卜素與總?cè)~綠素的比值隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長變化不顯著，與正常光相比，藍(lán)光下的野生株CC5325 顯著降低，然而突變株crcry相反，顯著高于正常光及藍(lán)光下的CC5325（圖3-f）。色素含量均在第6 天得到積累達(dá)到峰值，隨后降低。

圖3 藍(lán)光對(duì)萊茵衣藻CC5325 和crcry 單位細(xì)胞色素的影響Fig. 3 Effects of blue light on the single cell pigments of C. reinhardtii CC5325 and crcry

以上結(jié)果表明，正常光條件對(duì)CC5325 和crcry的色素含量影響不明顯，藍(lán)光條件對(duì)CC5325 和crcry色素含量影響較大。且藍(lán)光條件能夠促進(jìn)CC5325 色素的積累，不利于突變株crcry色素的積累，尤其是葉綠素。

2.4 藍(lán)光對(duì)萊茵衣藻野生株CC5325和突變株crcry光合作用的影響

實(shí)際光化學(xué)效率Y（II）表示用于光化學(xué)反應(yīng)的能量。從圖4-a 中可以看出，Y（II）隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加呈先上升再下降的趨勢(shì)，在第4 天達(dá)到最大，第6-8 天逐漸趨于穩(wěn)定。正常光和藍(lán)光條件下，CC5325 與crcry之間差異不明顯，但藍(lán)光條件下，Y（II）低于正常光條件。說明藍(lán)光能夠影響PSII 的光合性能。

最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）用來表示植物潛在的最大光合活性（圖4-b）。萊茵衣藻的Fv/Fm 受環(huán)境中光質(zhì)的影響，在不同光質(zhì)下，萊茵衣藻Fv/Fm 隨培養(yǎng)時(shí)間增加均呈下降趨勢(shì)，其中，藍(lán)光的影響最大，尤其是對(duì)突變株crcry。Fv/Fm<0.6 表明藻細(xì)胞受到抑制，正常光條件下，培養(yǎng)至第3 天后，開始抑制藻細(xì)胞生長；而在藍(lán)光條件下，培養(yǎng)1 d 已開始抑制細(xì)胞生長，并且藻細(xì)胞受到的抑制隨培養(yǎng)時(shí)間延長而加強(qiáng)，藍(lán)光影響更顯著。

相對(duì)電子傳遞速率（rETR）可以用來反映植物對(duì)光強(qiáng)的耐受能力（圖4-c）。萊茵衣藻的相對(duì)電子傳遞速率（rETR）隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加先升高后下降，培養(yǎng)到第4 天，相對(duì)電子傳遞速率（rETR）達(dá)到最大，隨后呈下降趨勢(shì)。且藍(lán)光下rETR 低于正常光條件，CC5325 與crcry相比較，在受到強(qiáng)光輻射后rETR 降低更快。crcry中細(xì)胞的光保護(hù)受損使ETR 降低，表明CRY 是這種藻類光保護(hù)的中心角色。

非光化學(xué)淬滅系數(shù)（NPQ）表示將過剩的光能以熱的形式耗散掉的能力（圖4-d）。在此過程中NPQ 都相應(yīng)的增加，并且在第4 天達(dá)到最大值，表明在此條件下已發(fā)生熱耗散，但隨著處理時(shí)間的增加，NPQ 恢復(fù)到正常狀態(tài)。NPQ 在CC5325 與crcry之間存在差異，藍(lán)光條件下明顯低于正常光條件。這表明在短期內(nèi)藍(lán)光可使萊茵衣藻產(chǎn)生脅迫誘導(dǎo)，但隨著時(shí)間的延長，衣藻能夠適應(yīng)不同光質(zhì)的環(huán)境。

光化學(xué)淬滅系數(shù)（qP）反映了PSII 反應(yīng)中心的開放程度（圖4-e）。白光及藍(lán)光條件下，qP 先上升后下降，同樣在第4 天達(dá)到最大，之后4-8 d 趨于穩(wěn)定。CC5325 與crcry之間的qP 存在差異，藍(lán)光條件下略低于正常光條件。

圖4 藍(lán)光對(duì)萊茵衣藻CC5325 和crcry 光合作用的影響Fig. 4 Effects of blue light on the photosynthesis of C. Reinhardtii CC5325 and crcry

2.5 藍(lán)光對(duì)萊茵衣藻野生株CC5325和突變株crcry總脂的影響

培養(yǎng)結(jié)束時(shí)（第8 天），檢測(cè)在正常光和藍(lán)光條件下衣藻CC5325 和crcry的總脂含量（圖5）發(fā)現(xiàn)，正常光條件下，CC5325 與crcry的總脂差異不顯著，含量分別是38.16%和38.74%；藍(lán)光條件下，CC5325 與crcry總脂差異明顯，含量分別是42.15%和15.96%。相比于正常光，藍(lán)光能促進(jìn)CC5325 總脂積累，增加了12.34%；而抑制crcry總脂積累，下降了58.80%。表明藍(lán)光有利于萊茵衣藻中總脂的積累，但不利于隱花色素破壞型的突變株中總脂的積累。

圖5 藍(lán)光對(duì)萊茵衣藻CC5325 和crcry 總脂的影響Fig. 5 Effects of blue light on the total lipid of C. Reinhardtii CC5325 and crcry

3 討論

植物通過光受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑響應(yīng)光信號(hào)。藍(lán)光受體隱花色素能感知藍(lán)光信號(hào)，在植物的藍(lán)光響應(yīng)中發(fā)揮重要的作用。隱花色素基因在擬南芥中被克隆以后，在番茄、蕨類以及苔蘚乃至人體中都進(jìn)行了相關(guān)研究［32-34］。研究表明，擬南芥中CRY1 和CRY2 對(duì)光形態(tài)建成起著重要的調(diào)控作用，其中，CRY1 在藍(lán)光下主要抑制下胚軸的伸長，CRY2 主要控制光周期調(diào)控開花。

藍(lán)光對(duì)微藻的生長具有顯著的影響。Das 等［35］研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)光下微擬球藻（Vannochloropsissp）的比生長率有所提高，Gon?alves 等［36］發(fā)現(xiàn)藍(lán)光有利于Tetradesmussp. 的生長。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常光培養(yǎng)條件相比，CC5325 在藍(lán)光下的生長較快，而突變株crcry的生長受到明顯抑制，暗示cry在該藻株的生長過程中發(fā)揮重要作用。

藍(lán)光對(duì)微藻新陳代謝的影響較大，有研究表明紅光會(huì)引起細(xì)胞損傷，而藍(lán)光能夠明顯提高藻類光合色素的含量［37］。本研究結(jié)果表明，藍(lán)光下CC5325 葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素及總色素含量高于正常光，這與沈銀武等［38］研究結(jié)果一致，藍(lán)光對(duì)中華植生藻中葉綠素b 和類胡蘿卜素合成有促進(jìn)作用。crcry在藍(lán)光下的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素及總色素含量均低于CC5325。同時(shí)發(fā)現(xiàn)正常光下，CC5325 與crcry類胡蘿卜素的含量差異不明顯；在藍(lán)光下兩者之間類胡蘿卜素差異非常顯著，crcry顯著高于CC5325，而Im 等［39］研究發(fā)現(xiàn)，暴露于連續(xù)低強(qiáng)度藍(lán)光可提高LHCBM6、GSAT 和PDS 轉(zhuǎn)錄水平，但在突變株（Ri20, PHOT 水平<10%的野生類型藻株）中的轉(zhuǎn)錄水平較野生株（CC-124）相比積累較少，造成這一現(xiàn)象的原因可能是藍(lán)光強(qiáng)度差異以及突變株的不同。本研究發(fā)現(xiàn)正常光條件下，CC5325 及crcry的類胡蘿卜素比葉綠素的比值相對(duì)穩(wěn)定；藍(lán)光條件下，CC5325 類胡蘿卜素比葉綠素的比值略微降低，crcry恰恰相反，顯著升高。暗示藻細(xì)胞在不同光質(zhì)條件下，類胡蘿卜素比葉綠素的比值變化，是響應(yīng)光質(zhì)很重要的一個(gè)指標(biāo)，進(jìn)一步證明萊茵衣藻在藍(lán)光的響應(yīng)過程中，cry介導(dǎo)調(diào)控了葉綠素與類胡蘿卜素的合成，來導(dǎo)致比率的變化，進(jìn)而響應(yīng)藍(lán)光光質(zhì)。

光質(zhì)可以對(duì)植物的生長、品質(zhì)及產(chǎn)量產(chǎn)生影響，這與光質(zhì)可調(diào)控植物的光合作用密切相關(guān)［40］。結(jié)合葉綠素?zé)晒馇€圖和具體參數(shù)，發(fā)現(xiàn)藍(lán)光輻射引起了PSII 反應(yīng)中心的變化。本研究通過葉綠素?zé)晒鈪?shù)來反映不同光質(zhì)（正常光、藍(lán)光）下萊茵衣藻的光合性能發(fā)現(xiàn)，藍(lán)光下藻細(xì)胞Y（II）、Fv/Fm、rETR、NPQ 和qP 值均低于正常光，且藍(lán)光下crcry低于CC5325。Y（II）實(shí)際光化學(xué)效率前期呈上升趨勢(shì)，第4 天達(dá)到最大，之后下降至穩(wěn)定；Fv/Fm 均呈下降趨勢(shì)，該結(jié)果與前人對(duì)斜生柵藻（Scenedesmus obliqnusFACHB-1986）和銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）的研究結(jié)果相類似［41］；rETR 也是先上升后下降，藍(lán)光下低于正常光，推測(cè)可能在這種條件下，更多的光能可能用于類胡蘿卜素的合成；NPQ 均低于正常光,這與高光下結(jié)果相一致，表明過量的光能超過藻細(xì)胞自身的承受能力,不能以熱的形式耗散掉；qP 的變化趨勢(shì)NPQ 幾乎是一致的，均先上升后下降。

藍(lán)光是促進(jìn)微藻細(xì)胞積累關(guān)鍵產(chǎn)物的有效刺激因子，同時(shí)對(duì)油脂的積累也有非常重要的影響。周玉嬌等［42］研究表明，小球藻突變株油脂含量與野生型相比有所提高。本研究亦發(fā)現(xiàn)正常光下突變株crcry總脂稍高于野生株CC5325；相反，藍(lán)光下crcry總脂含量遠(yuǎn)低于CC5325。同時(shí)，與正常光相比，藍(lán)光促進(jìn)了CC5325 藻細(xì)胞中油脂的積累，這與小球藻［43］、微擬球藻［44］和雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）［45］等微藻積累油脂結(jié)果一致；藍(lán)光抑制了crcry中油脂的積累，Beel 等［26］發(fā)現(xiàn)藍(lán)光條件下aCRY 突變體中的大多數(shù)與代謝相關(guān)的基因，以及編碼細(xì)胞周期成分的基因都受到aCRY 調(diào)節(jié)。本研究推測(cè)，藍(lán)光條件下crcry含量較低可能與油脂代謝相關(guān)基因受pCRY 調(diào)節(jié)相關(guān)，由于基因片段插入cry，導(dǎo)致該基因在轉(zhuǎn)錄水平上中斷，從而不能響應(yīng)藍(lán)光輻射，因此藍(lán)光下crcry中油脂含量比較低。

4 結(jié)論

crcry表現(xiàn)出生長差、顏色黃、類胡蘿卜素含量增高、葉綠素、光合指標(biāo)及總脂降低。cry參與了萊茵衣藻藍(lán)光響應(yīng)的過程。