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    菊芋WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族基因的鑒定及分析

    2023-03-07 12:55:08趙孟良郭怡婷任延靖
    生物技術(shù)通報(bào) 2023年2期
    關(guān)鍵詞:菊芋基序萵苣

    趙孟良 郭怡婷 任延靖

    (1. 青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院 青海省蔬菜遺傳與生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西寧 810016;2. 青海大學(xué)三江源生態(tài)和高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西寧 810016)

    菊芋(Helianthus tuberosusL.)又名洋姜,鬼子姜,屬菊科向日葵屬多年生草本植物[1],原產(chǎn)自北美,18 世紀(jì)末傳入我國(guó),常規(guī)用于腌制咸菜,隨著其開(kāi)發(fā)利用價(jià)值的發(fā)掘,菊芋已被廣泛應(yīng)用于食品開(kāi)發(fā)、藥用、工業(yè)、綠化觀賞等領(lǐng)域[2-7]。同時(shí)菊芋又具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性,它可以在干旱地、沙荒地、鹽堿地等不同類型的土壤中種植,且能夠正常生長(zhǎng)[8-10],并產(chǎn)生相當(dāng)可觀的生物量。由于菊芋對(duì)貧瘠土地較強(qiáng)的適應(yīng)性,已被廣泛應(yīng)用于生態(tài)治理等領(lǐng)域[11-13]。除此之外,菊芋還可用于菊粉的提取以及功能食品[14]、動(dòng)物飼料[15]等的開(kāi)發(fā)。

    WRKY 轉(zhuǎn)錄因子作為植物中最常見(jiàn)的一類轉(zhuǎn)錄因子家族之一,具有高度的保守序列和特殊功能,能夠參與植物響應(yīng)生物和非生物脅迫[16]。研究發(fā)現(xiàn),OsWRKY67 參與調(diào)控水稻(Oryza sativaL.)響應(yīng)多種非生物脅迫,通過(guò)ABA 信號(hào)通路介導(dǎo)負(fù)向調(diào)控水稻苗期耐旱性[17],而過(guò)表達(dá)水稻OsWRKY6能提高水稻對(duì)病原物的抵抗性[18]。在牛耳草(Boea hygrometrica(Bunge)R. Br.)中,BhWRKY11 轉(zhuǎn) 錄因子可通過(guò)調(diào)控BhGolS1基因的表達(dá),促進(jìn)轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)干旱脅迫的耐受性[19];在小麥中TaWRKYK2可與STZ和下游的抗旱基因RD29B啟動(dòng)子結(jié)合,對(duì)干旱脅迫有積極的調(diào)控作用。

    截至目前,空心菜(Ipomoea aquatica)[20]、睡蓮(Nymphaea colorata)[21]等WRKY 轉(zhuǎn)錄因子已有相關(guān)研究,但未見(jiàn)到有關(guān)菊芋WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族的相關(guān)研究。

    本研究以菊芋的葉片為材料,進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序,通過(guò)分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族,對(duì)其進(jìn)行鑒定及表達(dá)分析,以期明晰與菊芋響應(yīng)干旱脅迫密切相關(guān)的WRKY 基因,為今后菊芋WRKY基因的克隆及功能驗(yàn)證奠定理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    選取前期進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組與代謝組測(cè)序的青芋2 號(hào)菊芋品種為研究材料,于2020年4月種植于青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院園藝研究所試驗(yàn)基地,正常田間肥水管理,9月下旬于開(kāi)花期進(jìn)行取樣,選取盛花時(shí)期的7 個(gè)組織(包括根、塊莖、花莖、葉、花瓣、管狀花和幼嫩種子),液氮速凍后,置于-80℃貯藏備用,每個(gè)樣品選取3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

    同時(shí),采用25% PEG-6000 模擬干旱脅迫,分別選取處理0、18、24 和36 h 的菊芋葉片與幼根,液氮速凍后,置于-80℃貯藏備用,每個(gè)樣品選取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

    1.2 方法

    1.2.1 RNA 的提取及第一鏈cDNA 合成 采用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit 提取總RNA,用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 純度及完整性,微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度及質(zhì)量,采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 合成cDNA,將cDNA 溶液稀釋為100 ng/μL,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2HtWRKY基因的篩選 根據(jù)干旱脅迫下菊芋葉片的轉(zhuǎn)錄組信息(SUB8106956)、轉(zhuǎn)錄組組裝結(jié)果以及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序注釋文件,以WRKY 為關(guān)鍵詞,依次在NR、Swissprot、Tremble 和KEGG 注釋文件中進(jìn)行搜索,根據(jù)搜索到的測(cè)序序列Cluster 編號(hào)查找序列信息,將查找到的Cluster 序列提交至NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),進(jìn)行在線BLAST 分析,再將獲得的比對(duì)序列提交至在線工具ExPASy-ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/) 中分析其序列特征,采用MEME3.0 分析序列的motif結(jié)構(gòu)域。

    根據(jù)Cluster 電子序列及NCBI 的比對(duì)結(jié)果,采用DNAMAN 9.0 軟件進(jìn)行序列相似度分析,選取重疊區(qū)域,利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物,并且通過(guò)奧科(楊凌)生物工程股份有限公司合成引物,引物序列見(jiàn)附表1。

    1.2.3 進(jìn)化樹(shù)分析 選取能夠比對(duì)到NCBI 中的74個(gè)菊芋的Cluster 片段,以及NCBI 中下載的30 個(gè)擬南芥、30 個(gè)向日葵、40 個(gè)萵苣的WRKY 基因,采用MEGA X 軟件的最大似然方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

    1.2.4 組織差異表達(dá)分析與干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)分析 通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)基因的表達(dá)情況,以25sRNA和Clath-3為內(nèi)參基因,RTqPCR 反應(yīng)體系為2 × Unique AptamerTMqPCR SYBR Green Master Mix(No Rox)10 μL、上下游引物各0.8 μL、模板cDNA(200 ng/μL)1 μL 和雙蒸水7.4 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 15 min;95℃ 10 s,58℃ 20 s,72℃ 20 s,40 個(gè)循環(huán)。熔解曲線:95℃ 15 s,60℃1 min,95℃ 1 min,30 個(gè)循環(huán),降溫:40℃ 30 s。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

    2 結(jié)果

    2.1 HtWRKY基因家族成員的鑒定及蛋白結(jié)構(gòu)分析

    通過(guò)篩選轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),共發(fā)現(xiàn)117 個(gè)WRKY 基因,與NCBI 中WRKY 基因比對(duì),發(fā)現(xiàn)部分Cluster序列比對(duì)到同一個(gè)WRKY 基因,綜合整理后,共鑒定出74 個(gè)WRKY 基因(附表2)。Expasy 分析顯示,序列長(zhǎng)度為510-2 040 bp,平均序列長(zhǎng)度為1 105 bp,編碼氨基酸數(shù)量為169-679 個(gè),平均367 個(gè),其中,序列最短的氨基酸是HtWRKY75-3,序列最長(zhǎng)的是HtWRKY2-3,分子量為18 882.98-74 247.19,平均為40 639.5,等電點(diǎn)為5.13-10.19,最低的是HtWRKY40-2,最高的是HtWRKY51-3,親水性分析顯示,HtWRKY65-3 具有較強(qiáng)的親水性,HtWRKY7-2 具有明顯的疏水性。

    2.2 HtWRKY基因的保守基序分析

    利用MEME 在線軟件對(duì)菊芋74 個(gè)WRKY 基因的保守序列進(jìn)行分析,結(jié)果(圖1)顯示,HtWRKY基因含有保守的Motif 基序的長(zhǎng)度為25-50 個(gè)堿基。

    圖1 HtWRKY 基因的保守基序標(biāo)識(shí)Fig. 1 Conversed motif logo of HtWRKY genes

    2.3 HtWRKY基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

    利用MEGA X 軟件的最大似然法構(gòu)建74 個(gè)HtWRKY基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2),被分為四大類。

    圖2 HtWRKY 基因的聚類分析圖及基序位置Fig. 2 Phylogenetic relationship and motif locations of HtWRKY genes

    在這四大類中,第一類包含23 個(gè)基因,檢測(cè)到的保守Motif 數(shù)量為2-11 個(gè)不等,平均含有5.8個(gè)Motif,主要含有的保守基序?yàn)镸otif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4、Motif 8 和Motif 9;第二類包含19個(gè)基因,檢測(cè)到的保守Motif 數(shù)量為2-9 個(gè),平均含有6 個(gè)Motif,主要含有的保守基序?yàn)镸otif 1、Motif 2、Motif 3 和Motif 6;第三類僅包含3 個(gè)基因,檢測(cè)到的保守Motif 數(shù)量分別是2、4 和6 個(gè),平均含有4 個(gè)Motif;第四類包含29 個(gè)基因,檢測(cè)到的保守Motif 數(shù)量為2-11 個(gè),平均含有7 個(gè)Motif,主要含有的保守基序?yàn)镸otif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4、Motif 8、Motif 9、Motif 14 和Motif 15。

    2.4 WRKY家族基因的進(jìn)化分析

    為了進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)錄因子HtWRKY 與其他物種WRKY 基因之間的親緣關(guān)系,選取與菊芋(Helianthus tuberosusL.)親緣關(guān)系較近的向日葵(Helianthus annuus)和萵苣(Lactuca sativa),以及模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)進(jìn)行家族進(jìn)化分析,利用MEGA X 軟件對(duì)74 個(gè)菊芋WRKY 家族基因、30個(gè)向日葵WRKY 家族基因、40 個(gè)萵苣WRKY 家族基因以及30 個(gè)擬南芥WRKY 家族基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果(圖3)顯示,這些WRKY 基因分為了六大類,第一類33 個(gè)基因,其中菊芋WRKY 占27 個(gè),其他分別是4 個(gè)萵苣和2 個(gè)擬南芥WRKY 基因;第二類40 個(gè)基因,分別包括菊芋、向日葵、萵苣和擬南芥的WRKY 基因15、8、11 和6 個(gè),大部分HtWRKY 與這3 個(gè)物種的WRKY 聚為一小類;第三類2 個(gè)基因,分別是萵苣WRKY51 和擬南芥WRKY22;第四類23 個(gè)基因,分別包括菊芋、向日葵、萵苣和擬南芥WRKY 基因8、8、5 和2 個(gè);第五類10 個(gè)基因,包含2 個(gè)HtWRKY、3 個(gè)HaWRKY、1 個(gè)LsWRKY 和4 個(gè)AtWRKY;第 六 類65 個(gè) 基因, 包 含21 個(gè)HtWRKY、11 個(gè)HaWRKY、18 個(gè)LsWRKY 和15 個(gè)AtWRKY,大部分HtWRKY 與這3 個(gè)物種中的WRKY 聚為一小類。

    圖3 4 個(gè)物種WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 3 Phylogenetic tree of WRKY transcription factors in four species

    2.5 HtWRKY家族基因的組織特異性表達(dá)分析

    為進(jìn)一步明晰HtWRKYs在不同組織的表達(dá)特性,選取菊芋的種子、根、莖、葉、花瓣及塊莖為材料,以花為參考,運(yùn)用RT-qPCR 分析HtWRKY的表達(dá)特性,結(jié)果(圖4)顯示,種子中,HtWRKY6-1、HtWRKY7-4、HtWRKY65-5、HtWRKY33-1、HtWRKY6-6、HtWRKY40-4、HtWRKY17-3、HtWRKY13、HtWRKY9-1、HtWRKY22、HtWRKY33-2和HtWRKY44表達(dá)量較高;根中,HtWRKY33-1、HtWRKY32-2、HtWRKY51-4、HtWRKY40-4、HtWRKY21、HtWRKY13和HtWRKY33-2表 達(dá) 量 較高;莖中,HtWRKY6-6、HtWRKY24、HtWRKY17-3、HtWRKY13、HtWRKY22、HtWRKY33-2表達(dá)量較高;葉 片 中,HtWRKY32-2、HtWRKY51-4、HtWRKY6-6、HtWRKY21、HtWRKY22和HtWRKY33-2表達(dá)量較高;花 瓣 中,HtWRKY41、HtWRKY26-3、HtWRKY51-4、H t W R K Y 6-6、H t W R K Y 4 0-4、H t W R K Y 2 4、HtWRKY17-3、HtWRKY13、HtWRKY9-1、HtWRKY22和HtWRKY33-2表達(dá)量較高,且花瓣中的表達(dá)量普遍高于種子、根、葉片和莖中的表達(dá)量;塊莖中,HtWRKY51-4、HtWRKY17-3和HtWRKY13表達(dá)量較高,說(shuō)明菊芋WRKY家族基因的表達(dá)具有明顯的組織特異性。

    圖4 HtWRKY 基因在PEG-6000 模擬干旱脅迫下的組織特異性表達(dá)水平熱圖Fig. 4 Tissue-specificity expression heatmap of HtWRKY genes under PEG-6000 -simulated drought stresses

    2.6 HtWRKY家族基因在干旱脅迫后的誘導(dǎo)表達(dá)

    參考前期菊芋葉片在干旱脅迫后的轉(zhuǎn)錄組信息,分析所鑒定出的74 個(gè)WRKY 基因在干旱脅迫后的表達(dá)水平變化,結(jié)果(圖5)顯示,有11 個(gè)基因明顯受到干旱脅迫的誘導(dǎo)表達(dá),在PEG-6000 模擬干旱脅迫18 h 時(shí)表達(dá)量呈現(xiàn)顯著上升的變化,分別為HtWRKY70、HtWRKY50、HtWRKY17-2、HtWRKY2-4、HtWRKY6-2、HtWRKY40-1、HtWRKY75-2、H t W R K Y 7-5、H t W R K Y 5 5、H t W R K Y 3 3-2和HtWRKY9-2;有7 個(gè)基因在PEG-6000 模擬干旱脅迫24 h 表達(dá)量呈現(xiàn)顯著上升變化的趨勢(shì),分別 為HtWRKY51-1、HtWRKY6-1、HtWRKY27、HtWRKY26-1、HtWRKY40-2、HtWRKY51-3 和HtWRKY75-3;有2 個(gè)基因在PEG-6000 模擬干旱脅迫24-36 h 表達(dá)量呈現(xiàn)顯著上升變化的趨勢(shì),分別為HtWRKY6-5和HtWRKY40-4。

    圖5 74 個(gè)HtWRKY 基因在PEG-6000 模擬干旱脅迫下的菊芋葉片中的表達(dá)水平熱圖Fig. 5 Expression heatmap of 74 HtWRKY genes under PEG-6000-simulated drought stress in H. tuberosus leaves

    在根中,對(duì)干旱脅迫條件下74 個(gè)菊芋WRKY基因的表達(dá)進(jìn)行RT-qPCR 檢測(cè),鑒定出19 個(gè)HtWRKY基因在PEG-6000 模擬干旱脅迫的菊芋根中有表達(dá),結(jié)果(圖6)顯示,與CK 相比,除了HtWRKY55在3 個(gè)處理時(shí)間下的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)先升高之后逐漸降低的趨勢(shì),其他18 個(gè)HtWRKYs均呈現(xiàn)“升高-降低-升高”的變化趨勢(shì)。其中,HtWRKY20-1、HtWRKY32-1和HtWRKY75-3在干旱脅迫18 h 的相對(duì)表達(dá)量較高;HtWRKY51-1、HtWRKY2-1、HtWRKY65-5、HtWRKY58-2和HtWRKY75-3在干旱脅迫36 h 的相對(duì)表達(dá)量較高。

    圖6 19 個(gè)HtWRKY 基因在干旱脅迫下菊芋根中的表達(dá)情況Fig. 6 Expressions of 19 HtWRKY genes in the Jerusalem artichoke roots under drought stress H. tuberosus

    總之,發(fā)現(xiàn)HtWRKY51-1和HtWRKY75-3在菊芋葉片和根中均呈現(xiàn)高表達(dá)特性。

    3 討論

    WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族在生物和非生物脅迫響應(yīng)中起著重要作用[22],這與高等植物的多種生物過(guò)程有關(guān)。WRKY 蛋白可以通過(guò)在其啟動(dòng)子位點(diǎn)與W-box 特異性結(jié)合來(lái)誘導(dǎo)或抑制其下游基因的表達(dá),并最終激活其應(yīng)激反應(yīng)[23],據(jù)報(bào)道,多數(shù)WRKY基因在干旱脅迫下呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的特性。Chu 等[24]研究發(fā)現(xiàn),棉花GhWRKY41正向調(diào)控轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽脅迫和耐旱性。Chen 等[25]報(bào)道了擬南芥中WRKY46、WRKY54 和WRKY70 轉(zhuǎn)錄因子參與了干旱反應(yīng)。Zhang 等[26]認(rèn)為WRKYs 參與了地梢 瓜(Cynanchum thesioides(Freyn)K. Schum.)抵御干旱脅迫的反應(yīng)。EI-Esawi 等[27]研究發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)AtWRKY30 轉(zhuǎn)錄因子可以提高小麥(Triticum aestivumL.)的耐熱性和耐旱性。Ghodke 等[28]分析了不同洋蔥(Allium cepaL.)基因型對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)發(fā)現(xiàn),在抗逆品種中WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)表現(xiàn)出高度上調(diào),然而,目前對(duì)菊芋中WRKY基因的分布和功能少見(jiàn)報(bào)道。

    本研究通過(guò)對(duì)干旱脅迫下的菊芋葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,篩選出了響應(yīng)干旱脅迫的117 個(gè)WRKY 基因,通過(guò)與NCBI 的比對(duì)分析,去除比對(duì)重復(fù)的序列后,共鑒定出74 個(gè)WRKY 基因,分析其保守序列,發(fā)現(xiàn)含有保守Motif 基序的長(zhǎng)度為25-50 個(gè)堿基不等。利用MEGA X 軟件的最大似然方法構(gòu)建74 個(gè)HtWRKY基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),結(jié)果顯示,這些基因能夠被分為4 大類,第一類包含23 個(gè)基因,第二類包含19 個(gè)基因,第三類僅包含3 個(gè)基因,第四類包含29 個(gè)基因。進(jìn)化分析結(jié)果顯示,這些WRKY 基因分為了六大類,第一類包含33 個(gè)基因,第二類包含40 個(gè)基因,第三類僅包含2 個(gè)基因,第四類包含23 個(gè)基因,第五類共包含10 個(gè)基因,第六類包含65 個(gè)基因。目前,關(guān)于HtWRKYs在干旱脅迫下不同組織中的表達(dá)模式尚未見(jiàn)報(bào)道,本研究通過(guò)PEG-6000 模擬干旱脅迫,對(duì)不同菊芋部位的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了RT-qPCR 測(cè)定,結(jié)果發(fā)現(xiàn),HtWRKY75-3在干旱脅迫36 h 時(shí)的表達(dá)量最高,達(dá)到188.71,后續(xù)可對(duì)該基因進(jìn)行克隆驗(yàn)證等工作。

    植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子家族基因在植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫中起著至關(guān)重要的作用,轉(zhuǎn)錄因子主要根據(jù)其保守的DBDs[29]的特征氨基酸序列被分為幾個(gè)家族組。其中,DREB/CBF、NAC、MYB、WRKY 和bZIP 家族是在干旱過(guò)程中起作用的主要轉(zhuǎn)錄因子。

    WRKY 蛋白屬于鋅指轉(zhuǎn)錄因子中WRKY-GCM1的超大家族[30],存在于大多數(shù)植物中,并有助于提高植物抵御生物和非生物脅迫的能力[31-32]。研究發(fā)現(xiàn)OsWRKY11參與植物的干旱和熱響應(yīng)[33]。OsWRKY45被認(rèn)為對(duì)ABA 有響應(yīng),并在氣孔關(guān)閉中發(fā)揮作用,以提高植物應(yīng)對(duì)干旱脅迫的能力[34]。HvWRKY38在大麥抵御干旱和寒冷時(shí)發(fā)揮著積極作用[35]。TaWRKY44的擬南芥超表達(dá)株系對(duì)ABA、干旱和鹽等脅迫處理的敏感性高于野生型,這與本研究中克隆獲得的菊芋WRKY 基因的功能相同[36]。

    本研究結(jié)果還表明,HtWRKY參與了抵御干旱脅迫的作用,并揭示了HtWRKY基因與其他作物中已鑒定的WRKYs 的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。綜上所述,這些結(jié)果為今后深入了解菊芋WRKY 基因家族的進(jìn)化,及其在非生物脅迫響應(yīng)中的關(guān)鍵作用提供了依據(jù),在后續(xù)研究中可以通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化、染色質(zhì)免疫沉淀、酵母雙雜交和酵母單雜交等手段,進(jìn)一步研究HtWRKYs基因的功能和機(jī)制。

    4 結(jié)論

    在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定出74 個(gè)WRKY 基因,其長(zhǎng)度為510-2 040 bp,Motif 基序?yàn)?5-50 個(gè)堿基,大部分HtWRKY基因與其他WRKY 基因聚合為一類。HtWRKY基因在花瓣和塊莖中相對(duì)表達(dá)量較高,分別有20 個(gè)和19 個(gè)HtWRKY基因在菊芋干旱誘導(dǎo)表達(dá)分析的葉片和根中呈現(xiàn)誘導(dǎo)后表達(dá)量上升的趨勢(shì),HtWRKY參與了抵御干旱脅迫的過(guò)程。

    文章所有附表數(shù)據(jù)請(qǐng)到本刊官網(wǎng)下載(http://biotech.aiijournal.com/CN/1002-5464/home.shtml)。

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