全自動蒸餾-流動分析儀聯(lián)用測定木薯粉中氰化物

王綠波，劉金鳳，王昊，房彥軍，孫景然，趙慷，趙友全*

（1.天津大學(xué)精密儀器與光電子工程學(xué)院，天津 300072；2.天津市生物醫(yī)學(xué)工程與檢測技術(shù)重點實驗室，天津 300072；3.軍事醫(yī)學(xué)研究院作業(yè)醫(yī)學(xué)與環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，天津 300054；4.北京海光儀器有限公司，北京 100193）

氰化物的毒性來源于氰苷的水解。氰苷在自然界中廣泛存在于眾多高等植物的根、莖、葉中[1-3]，氰苷自身無毒，只有植物自身受到破壞時，會生成醇腈，并在酶的作用下裂解，產(chǎn)生毒性[4]。接觸氰化物存在嚴(yán)重的健康風(fēng)險[5]，不僅會影響人體發(fā)育，嚴(yán)重者會導(dǎo)致神經(jīng)病變、精神錯亂和急性死亡[6]。木薯作為目前世界上第六大最重要的糧食作物[7]，有“淀粉之王”之稱，淀粉含量高于玉米和馬鈴薯，且價格更低，所以從生產(chǎn)成本出發(fā)，木薯具有更高的經(jīng)濟和效用價值[8]。木薯可以加工成不同的產(chǎn)品，如薯片、西米、木薯面包等[9]。木薯淀粉以其產(chǎn)量高、價格低的優(yōu)勢還可作為乙醇的生產(chǎn)來源[10]，可用作工業(yè)酒精和食用酒精的原料。但是當(dāng)木薯通過發(fā)酵和蒸餾生產(chǎn)蒸餾酒時，會釋放出有毒的氰化物[11]危害人體健康。木薯中的氰化物普遍存在于木薯葉、莖以及根中[12-13]，而且木薯中的氰化物含量很高[14-15]，如果食用的木薯產(chǎn)品加工不良，氰化物脫毒不完全，最終會導(dǎo)致急性氰化物中毒[16]。研究表明可食用木薯粉中氰化物的含量應(yīng)低于10 mg/kg[17]，所以對木薯中氰化物的檢測具有非常重要的意義。

目前，食品中測定氰化物含量的方法，主要依賴于GB 5009.36—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氰化物的測定》中的分光光度法、氣相色譜法以及定性法[18]，除此之外，還有原子吸收分光光度法[19]、雙波長疊加（異煙酸-硫代巴比妥酸）分光光度法[20]、滴定法[21]、化學(xué)傳感器技術(shù)[22]、連續(xù)流動注射法[23]等技術(shù)和方法，其中分光光度法是目前檢測機構(gòu)主要的測定方法[24]。Virbickas等[25]提出采用安培法、循環(huán)伏安法和快速傅里葉變換電化學(xué)阻抗譜法來測定水中氰化物濃度，但是這些集成電路的電流輸出有限，所以測量精度不高。La等[26]采用熒光探針的方法對氰化物的含量進行檢測，但是目前的研究表明，熒光探針在氰化物含量測定中存在較多問題，比如沒有生物靶向性、溶解性差、受外界環(huán)境溫度、pH值影響大等，這些問題也導(dǎo)致熒光探針的技術(shù)在氰化物含量測定中不能得到廣泛普及[27]。GB5009.36—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氰化物的測定》中的分光光度法[28]的蒸餾過程采用傳統(tǒng)蒸餾儀，安裝過程繁瑣、耗時長、加熱不安全，需要肉眼觀察蒸餾液是否到達滴定終點。色譜法成本較高、操作繁瑣，而且受硫氰酸鹽的影響。滴定法和連續(xù)流動注射法只適用于地表水、生活用水以及污水的檢測，很難對食品中的氰化物進行檢測。黃一帆等[29]用連續(xù)流動注射分析測定木薯粉中的氰化物時，采用濾紙過濾的方式進行分離的前處理，得到氰化物提取液，這會使氰化物的提取不完全，在提取過程中造成氰化物損失，準(zhǔn)確度降低。

本文提出一種全自動、高效的方法對木薯粉中氰化物含量進行檢測，將自主研發(fā)的全自動快速水蒸氣蒸餾儀與氰化物連續(xù)流動分析儀聯(lián)用，實現(xiàn)對木薯粉中的氰化物進行提取和檢測，解決現(xiàn)有流動分析儀無法直接對固體食品氰化物含量進行檢測的問題，并進一步實現(xiàn)大批量檢測。本文將提出的方法與GB 5009.36—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氰化物的測定》中的分光光度法進行對照，來檢測測量結(jié)果的準(zhǔn)確性。本文提出的方法能夠縮短檢測時間、節(jié)省人力物力、提高檢測效率，以期為食品中氰化物的含量檢測提供一種新方法，為食品檢測提供更加方便、快捷的方法參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

全自動水蒸氣蒸餾儀：天津大學(xué)自主研發(fā)；分光光度計（UV-2450型）：日本島津公司；氰化物連續(xù)分析儀（HGCF系列）、進樣器（ASX-280）：北京海光儀器有限公司；攪拌器（SN-JJ）：上海尚儀有限公司。

1.2 材料與試劑

木薯粉：河南（地區(qū) 1）、泰國（地區(qū) 2）、江蘇（地區(qū)3）。乙酸鋅、氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鉀、1，3-二甲基巴比妥酸、乙醇、酚酞、酒石酸、吡唑啉酮、乙酸、無水磷酸二氫鉀、無水磷酸氫二鈉（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；異煙酸（分析純）：天津市津科精細化工研究所；氯胺T（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；50.0 μg/mL水中氰成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW（E）080115：中國計量科學(xué)研究院。

1.0 μg/mL氰化物標(biāo)準(zhǔn)中間液：吸取2 mL水中氰成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用0.01 mol/L氫氧化鈉溶液定容至100 mL。

工作緩沖溶液：稱取9.2 g氫氧化鈉、82 g鄰苯二甲酸氫鉀溶解于800 mL水中，用水定容至1 L，混勻，調(diào)節(jié)pH值為5.2±0.1，混勻。

異煙酸-巴比妥酸溶液：稱取4.4 g氫氧化鉀、8.4 g異煙酸、6.8 g 1，3-二甲基巴比妥酸溶解于300 mL水中，60℃水浴加熱10 min，直至溶解，冷卻至室溫25℃后用水定容至500 mL，混勻。調(diào)節(jié)pH值為5.2±0.1。

2 g/L氯胺T溶液：稱取1 g氯胺T溶于水中，并稀釋至500 mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

本文的對照組為異煙酸-吡唑啉酮分光光度法，試劑配制按GB 5009.36—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氰化物的測定》第一法中的要求進行。

1.3 氰化物連續(xù)流動分析儀及進樣器工作條件

保溫溫度37℃、取樣時間90 s、清洗時間140 s、空氣流量100 mL/min、下放深度150 mm。

1.4 方法

1.4.1 氰化物含量檢測蒸餾過程

稱取木薯粉樣品5 g，加入50 mL的2 g/L NaOH溶液，攪勻。然后轉(zhuǎn)移到蒸餾反應(yīng)瓶中，向蒸餾反應(yīng)瓶中加入2 g酒石酸和5 mL的100 g/L乙酸鋅溶液，啟動全自動水蒸氣蒸餾儀，吸取10 mL的2 g/L氫氧化鈉溶液放置于燒杯中，用于接收蒸餾液。選擇稱量模式，設(shè)置40 mL為蒸餾終點，并啟動開始蒸餾按鈕。到達蒸餾終點，儀器將自動關(guān)停，將蒸餾液轉(zhuǎn)移至50 mL具塞比色管中，并用0.01 mol/L氫氧化鈉溶液定容至50 mL，備用。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取 0.1、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0 mL 氰化物標(biāo)準(zhǔn)中間液（1.0 μg/mL）置于10 mL具塞比色管中，用0.01 mol/L氫氧化鈉溶液定容至10 mL，得到所配制的氰化物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度分別為10、50、80、100、150、200 μg/L。用氰化物連續(xù)流動分析儀進行測定，以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3 樣品中氰化物含量計算

樣品中氰化物含量計算公式如下。

X=（n×v）/m

式中：X為樣品中氰化物的含量（以CN-計），mg/kg；n為根據(jù)標(biāo)曲得出的氰化物濃度，μg/L；v為蒸餾出的體積，L；m為稱取的樣品質(zhì)量，g。

1.4.4 精密度計算

選擇3種不同地區(qū)的木薯粉作為試驗對象，每種木薯粉樣品設(shè)置平行試驗7次，測定氰化物的含量，計算結(jié)果的精密度，其計算公式如下。

精密度/%=（S/A）×100

式中：S 為標(biāo)準(zhǔn)偏差，mg/kg；A 為平均值，mg/kg。

1.4.5 加標(biāo)回收率計算

加標(biāo)回收率計算公式如下。

加標(biāo)回收率/%=（T-t0）/t

式中：T 為測量值，mg/kg；t0為本底值，mg/kg；t為加標(biāo)量，mg/kg。

1.4.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2010計算平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、精密度、標(biāo)準(zhǔn)曲線和加標(biāo)回收率，用Origin 2019軟件進行繪圖和t檢驗分析測定2種試驗方法結(jié)果的一致性。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法試驗條件的選擇

2.1.1 水浴加熱溫度對顯色試劑的影響

異煙酸和巴比妥酸兩者皆易溶于熱水以及堿性環(huán)境，加熱溫度的選擇對異煙酸-吡唑啉酮顯色試劑影響很大，若溫度較低，試劑難以溶解，出現(xiàn)沉淀，如果溫度過高，會改變其化學(xué)性質(zhì)。所以本文探究不同溫度條件下標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)來探究最佳的溫度條件。在不同的溫度下，配制質(zhì)量濃度分別為10、50、80、100、150、200 μg/L的氰化物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進行檢測，結(jié)果見表1。

表1 不同溫度對線性相關(guān)系數(shù)的影響Table 1 Effect of different temperatures on linear correlation coefficients

由表1可知，當(dāng)水浴溫度為60℃時，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性最好。所以后續(xù)研究選擇水浴加熱溫度為60℃。

2.1.2 樣品中氰化物提取液的選擇

由于木薯粉中的氰苷非常不穩(wěn)定，所以前處理試驗對木薯粉中氰化物的提取特別重要。采用全自動水蒸氣蒸餾儀進行氰化物蒸餾提取之前，需要在堿性環(huán)境下對樣品中的氰化物進行提取[30]。如果氫氧化鈉濃度過低，導(dǎo)致木薯粉中氰化物固定不完全；如果氫氧化鈉濃度過高，CN-會生成CO2和N2，造成氰化物的損失，影響氰化物測量的準(zhǔn)確性，故本文探究了不同氫氧化鈉濃度對檢測結(jié)果的差異，主要從氰化物加標(biāo)回收試驗進行考察，結(jié)果見表2。

表2 氫氧化鈉濃度對氰化物檢測結(jié)果的影響Table 2 Effect of concentration of sodium hydroxide on cyanide content

由表2可知，氫氧化鈉濃度過高，堿性過強，木薯粉的糊化程度嚴(yán)重，會使檢測結(jié)果降低，加標(biāo)回收率降低；氫氧化鈉濃度過低，會使氰化物提取不完全。所以為了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，以2 g/L的氫氧化鈉作為提取液。

2.1.3 不同攪拌時間對氰化物測量結(jié)果的影響

為了使木薯粉中的氰化物充分溶解于提取液中，需要將木薯粉樣品進行攪拌勻漿。氰化物屬于揮發(fā)性物質(zhì)，為了找到最佳的檢測效果，本文探究了不同攪拌時間對木薯粉樣品氰化物加標(biāo)回收試驗的影響，見圖1。

圖1 不同攪拌時間對加標(biāo)回收試驗的影響Fig.1 Effect of different stirring time on the spike/recovery assay

由圖1可以看出，不同的攪拌時間對木薯粉中氰化物的測量結(jié)果影響不大，誤差小于10%，所以為了整體的檢測效率，提取時的攪拌時間選擇10 min。

2.1.4 酒石酸用量對檢測結(jié)果的影響

目前，對木薯粉中氰化物檢測的基本原理是木薯粉中的氰化物在酸性條件下蒸餾出的氰化物用氫氧化鈉溶液吸收，再與顯色試劑反應(yīng)比色定量。為了更有效地提取出樣品木薯粉中的氫氰酸，所以試驗中選取不同的酒石酸用量，考察酒石酸的不同用量對木薯粉中氰化物加標(biāo)回收率的影響，結(jié)果見表3。

表3 酒石酸用量對加標(biāo)回收試驗的影響Table 3 Effect of tartaric acid dosage on the spike/recovery assay

由表3可知，酒石酸用量過高或過低，均會使加標(biāo)回收率降低。當(dāng)酒石酸用量為2.0 g時，加標(biāo)回收率達到93.44%，檢測結(jié)果最好，所以在前處理蒸餾試驗中，選擇加入2.0 g的酒石酸。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及方法檢出限

設(shè)置對氰化物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度（0～200 μg/L），采用連續(xù)流動分析儀進行測定，以不同的標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度（μg/L）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)（Y），得線性方程y=0.004 53x+0.009 79，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.999 5。并對空白樣品進行11次重復(fù)測定，計算測定值3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差得到該方法的檢出限0.000 251 9 mg/L。當(dāng)樣品為5 g、蒸餾后定容體積為50 mL時，木薯粉樣品中氰化物的檢出限為0.013 mg/kg，定量限為0.043 mg/kg。

2.3 精密度測試

采用自主研發(fā)的全自動水蒸氣蒸餾儀對樣品進行蒸餾提取，再用連續(xù)流動分析儀進行測定，按照1.4.4計算結(jié)果的精密度，結(jié)果見表4。

表4 精密度試驗結(jié)果Table 4 Results of precision assay

由表4可知，使用該方法測定結(jié)果的精密度小于10%，精密度良好，重復(fù)性好。

2.4 方法的加標(biāo)回收率試驗測試

選擇3個濃度水平的氰化物標(biāo)準(zhǔn)溶液進行試驗，對加標(biāo)回收率進行測定，結(jié)果如表5所示。

表5 加標(biāo)回收試驗測量結(jié)果Table 5 Spike/recovery assay results

從表5可以看出，該方法測定結(jié)果的加標(biāo)回收率為93.72%～103.33%，加標(biāo)回收率符合國家標(biāo)要準(zhǔn)求，表明該方法準(zhǔn)確度較高，滿足氰化物檢測要求。

2.5 與異煙酸-吡唑啉酮分光光度法的對比試驗

異煙酸-吡唑啉酮分光光度法采用GB 5009.36—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氰化物的測定》中的食品中氰化物的測定第一法進行，取6個樣品，將所得的結(jié)果與本方法進行對照，結(jié)果見表6。

表6 方法的對照試驗Table 6 Control trials of methods

由表6可知，對比數(shù)據(jù)的差異采用配對樣本t檢驗，檢測結(jié)果為 t=2.233 27，p=0.075 85（p＞0.05），在0.05水平下，兩組數(shù)據(jù)沒有顯著差異，結(jié)果表現(xiàn)出較好的一致性。

3 討論與結(jié)論

本文建立了全自動快速水蒸氣蒸餾儀與氰化物連續(xù)流動分析儀聯(lián)用方法，實現(xiàn)了對木薯粉中氰化物的提取與檢測。全自動水蒸氣蒸餾儀可自動加熱，到達蒸餾終點自動關(guān)停。有效縮短蒸餾時間、提高檢測效率。連續(xù)流動分析儀通過智能控制節(jié)約人力。檢測結(jié)果表明，本方法精密度良好，加標(biāo)回收率滿足檢測要求，而且提高了對木薯粉中氰化物的檢測效率，并且該方法與GB 5009.36—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氰化物的測定》中的分光光度法檢測結(jié)果相一致，因此，可以滿足木薯粉的檢測需求。本方法實現(xiàn)了固體食品樣品中氰化物含量檢測，整個過程全自動化操作，簡化了繁瑣的操作過程，保證了方法的穩(wěn)定性和檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。可以用于樣品的大批量檢測，為以后對于氰化物檢測的一體化、集成化提供了研究依據(jù)。