錯配修復(fù)基因蛋白在結(jié)直腸癌診治中的臨床應(yīng)用*

邱春華 張志宏 董丹丹 李良平

結(jié)直腸癌是中國常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率分別位居第3位和第5位［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)，DNA錯配修復(fù)基因（mismatch repair gene，MMR）的突變或甲基化，導(dǎo)致微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instabili?ty，MSI），是結(jié)直腸癌發(fā)生的重要機(jī)制之一［3］。占結(jié)直腸癌3%～5%的Lynch綜合征是由于MMR發(fā)生胚系突變所致的常染色體顯性遺傳性疾病。而在15%散發(fā)性結(jié)直腸癌中，錯配修復(fù)基因MLH1啟動子甲基化失活是其主要的發(fā)生機(jī)制，臨床特征與Lynch綜合征相似。2014年美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）推薦初診結(jié)直腸癌患者應(yīng)篩查Lynch綜合征［3］。

本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)直腸癌患者手術(shù)標(biāo)本中MMR的表達(dá)情況，及其與臨床病理學(xué)的關(guān)系，并評價其在Lynch綜合征和散發(fā)性結(jié)直腸癌篩查中的價值，以期為臨床篩查Lynch綜合征提供簡便、快速、經(jīng)濟(jì)的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例資料 選取四川省人民醫(yī)院2015年1月至2016年9月收治的結(jié)直腸癌患者607例，均經(jīng)術(shù)后病理確診，其中男性376例（61.94%），女性231例（38.06%）；年齡26～90歲，平均年齡63歲；排除術(shù)前接受過放化療的患者。采用免疫組織化學(xué)LDP法檢測切除的腫瘤組織標(biāo)本中MMR蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2的表達(dá)和P53、VEGF、Ki-67、CD34、D2-40的表達(dá)情況，及與臨床病理的關(guān)系。本研究獲得四川省人民醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)［倫審（研）2018年第149號］。

1.1.2 主要試劑 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2，P53、VEGF、Ki-67、CD34、D2-40購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗方法 采用免疫組織化學(xué)LDP法。將患者手術(shù)切除的腫瘤標(biāo)本，10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片。按產(chǎn)品說明書操作，第一抗體分別為MLH1（鼠單抗，1:10）、MSH2（兔單抗，1:100）、MSH6（兔單抗，1:100）、PMS2（兔單抗，1:20）、P53（鼠單抗，1:100）、VEGF（兔多抗）、Ki-67（鼠單抗，1:100）、CD34（鼠單抗，1:100）、D2-40（鼠單抗，1:25），采用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，MLH1、MSH2以正常結(jié)腸黏膜上皮表達(dá)情況作為陽性對照。MSH6、PMS2以結(jié)腸癌表達(dá)情況作為陽性對照。P53以乳腺癌表達(dá)情況作為陽性對照。VEGF以肝癌表達(dá)情況作為陽性對照。Ki-67、D2-40以扁桃體表達(dá)情況作為陽性對照。CD34以血管內(nèi)皮表達(dá)情況作為陽性對照。

1.2.2 結(jié)果判定 結(jié)合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行判斷［4］，由兩位病理科醫(yī)生獨立完成結(jié)果判定。

MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、P53、Ki-67蛋白均位于細(xì)胞核，VEGF蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞膜，CD34定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)。D2-40蛋白定位于淋巴管細(xì)胞質(zhì)，呈黃色或棕黃色染色為表達(dá)（+），不著色為缺失（-）。MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白中任意一種不表達(dá)判定為MMR表達(dá)缺失，而MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白均表達(dá)則判定為MMR完整。

1.2.3 隨訪 每3個月隨訪1次，門診隨訪和電話隨訪相結(jié)合，根據(jù)患者的檢查結(jié)果、治療方案，觀察總體生存和無瘤生存情況。隨訪時間為20～40個月，截至2018年4月。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMR在結(jié)直腸癌中的表達(dá)

607例標(biāo)本中，共 216例 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白表達(dá)缺失，MMR表達(dá)缺失率為35.58%。其中男性136例，女性80例，年齡≤50歲41例。將216例MMR蛋白表達(dá)缺失患者設(shè)為陰性組，391例表達(dá)正?；颊咴O(shè)為陽性組，兩組在腫瘤位置比較（左半結(jié)腸vs.右半結(jié)腸，直腸vs.右半結(jié)腸）差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，表1），MMR蛋白陰性組右半結(jié)腸癌高發(fā)，陽性組左半結(jié)腸癌和直腸癌高發(fā)。兩組年齡、性別比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 MMR蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)

2.1.1 MMR一項表達(dá)缺失結(jié)果 MMR一項表達(dá)缺失，分別以MLH1、PMS2蛋白表達(dá)缺失為主。MLH1蛋白表達(dá)缺失率為3.95%，表達(dá)缺失組右半結(jié)腸8例，左半結(jié)腸+直腸16例；表達(dá)陽性組右半結(jié)腸60例，左半結(jié)腸+直腸331例。兩組在腫瘤位置的比較（左半結(jié)腸/直腸vs.右半結(jié)腸），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。PMS2蛋白表達(dá)缺失率為11.04%，表達(dá)缺失組右半結(jié)腸17例，左半結(jié)腸+直腸50例；表達(dá)陽性組右半結(jié)腸60例，左半結(jié)腸+直腸331例。兩組在腫瘤位置的比較（左半結(jié)腸/直腸vs.右半結(jié)腸），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。MLH1蛋白、PMS2蛋白陰性組右半結(jié)腸癌高發(fā)，陽性組左半結(jié)腸癌和直腸癌高發(fā)。

2.1.2 MMR多項表達(dá)缺失結(jié)果 MMR聯(lián)合兩項表達(dá)缺失，以MLH1/PMS2聯(lián)合表達(dá)缺失為主。MLH1/PMS2蛋白表達(dá)缺失率為14.50%，表達(dá)缺失組右半結(jié)腸49例，左半結(jié)腸+直腸39例；表達(dá)陽性組右半結(jié)腸60例，左半結(jié)腸+直腸331例。右半結(jié)腸癌MLH1/PMS2蛋白表達(dá)缺失率明顯高于左半結(jié)腸癌和直腸癌（P＜0.01）。MMR三項聯(lián)合表達(dá)缺失 6例，MLH1、MSH2、PMS2、MSH6同時表達(dá)缺失4例。

2.2 MMR蛋白表達(dá)與臨床病理學(xué)關(guān)系

MMR蛋白表達(dá)缺失的陰性組，高/中分化146例，低分化70例；表達(dá)正常的陽性組，高/中分化313例，低分化78例。兩組在腫瘤分化程度（高/中分化vs.低分化）的比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，表2）。MMR蛋白表達(dá)缺失的陰性組，Ⅰ/Ⅱ期87例，Ⅲ期129例；表達(dá)正常的陽性組，Ⅰ/Ⅱ期190例，Ⅲ期201例。兩組TNM分期（Ⅰ/Ⅱvs.Ⅲ）比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表2）。MMR蛋白表達(dá)缺失的陰性組，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移67例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移149例；表達(dá)正常的陽性組，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移199例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移192例。兩組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，表2）。兩組腫瘤大小比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。兩組腫瘤病理類型的比較顯示，與黏液/印戒分化無關(guān)，與淋巴細(xì)胞浸潤無關(guān)，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 MMR蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與病理學(xué)關(guān)系

2.3 P53、VEGF、Ki-67、CD34、D2-40在結(jié)直腸癌中的表達(dá)

MMR蛋白表達(dá)缺失的陰性組，VEGF陽性152例，陰性64例；表達(dá)正常的陽性組，VEGF陽性334例，陰性57例，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，表3）。MMR蛋白表達(dá)缺失的陰性組，Ki-67在1%～50%有97例，51%～100%有119例；表達(dá)正常的陽性組，Ki-67在1%～50%有132例，51%～100%有259例，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，表3）。左半結(jié)腸癌和直腸癌的VEGF、Ki-67表達(dá)水平高于右半結(jié)腸癌。MMR蛋白表達(dá)缺失的陰性組和表達(dá)正常的陽性組P53、CD34、D2-40的比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 VEGF、Ki-67在結(jié)直腸癌中的表達(dá)

3 討論

2017年中國癌癥數(shù)據(jù)報告顯示結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢，分別位居男性腫瘤發(fā)病率的第4位，女性的第3位，城市年發(fā)病率高達(dá)33.17/10萬人［1-2，5］。有研究發(fā)現(xiàn)，MMR突變或甲基化導(dǎo)致的MSI，是結(jié)直腸癌發(fā)生的重要機(jī)制之一［3］。本研究在MMR蛋白表達(dá)缺失中分別以MLH1、PMS2、MLH1/PMS2蛋白表達(dá)缺失為主，提示MMR蛋白表達(dá)陰性組右半結(jié)腸癌高發(fā)，陽性組左半結(jié)腸癌和直腸癌高發(fā)。右半結(jié)腸癌和左半結(jié)腸癌在胚胎來源、分子特征、致癌機(jī)制等方面存在差異。右半結(jié)腸癌與MMR缺失、MSI陽性表達(dá)、MLH1基因甲基化、BRAF基因突變等相關(guān)，左半結(jié)腸癌與抑癌基因APC、P53等的失活、KRAS基因突變相關(guān)［6］。

發(fā)病部位為MLH1/PMS2蛋白表達(dá)的獨立影響因素。若MLH1/PMS2蛋白缺失，可進(jìn)一步安排BRAF V600E突變和MLH1啟動子區(qū)甲基化的檢測，如結(jié)果為陰性應(yīng)進(jìn)行MLH1/PMS2基因種系突變檢測，根據(jù)結(jié)果確定是否為Lynch綜合征［7-8］。本研究兩組患者在腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。術(shù)后定期隨訪發(fā)現(xiàn)，MMR蛋白表達(dá)缺失的陰性組，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移8例，死亡2例；MMR蛋白表達(dá)正常的陽性組，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移21例，死亡7例。有研究提示發(fā)病部位、TNM分期是MMR蛋白表達(dá)的獨立影響因素［9］。MMR蛋白表達(dá)缺失的結(jié)直腸癌有其獨特的生物學(xué)行為特征，中國多項研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤多位于右半結(jié)腸，腸外惡性腫瘤發(fā)病率較高，低分化腺癌常見，腫瘤預(yù)后好于散發(fā)性大腸癌［7，10］。家族史、低齡、右半結(jié)腸腫瘤、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、腫瘤侵入固有肌層為中國可疑Lynch綜合征患者的高危臨床病理學(xué)因素［11］。

本研究兩組患者VEGF、Ki-67的比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，遠(yuǎn)端結(jié)腸和直腸癌的VEGF表達(dá)水平高于近端結(jié)腸癌。腫瘤原發(fā)部位基因表達(dá)和突變的差異，影響化療和分子靶向藥物的效果，導(dǎo)致左、右半結(jié)腸癌患者的預(yù)后不同［12］?？寡苌梢种苿┴惙ブ閱慰拱邢蛑委煹寞熜Ш筒课淮嬖诿黠@關(guān)系，根據(jù)原發(fā)瘤部位選擇結(jié)直腸癌靶向治療，對現(xiàn)有治療方案選擇產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響［5］。Bendardaf等［13］研究顯示，在CAPEOX+貝伐珠單抗治療的患者中，與盲腸和升結(jié)腸癌比較，乙狀結(jié)腸和直腸癌的中位無進(jìn)展生存時間和生存時間顯著延長。有研究發(fā)現(xiàn)，P53參與腺瘤-癌變途徑，可能僅對左半結(jié)腸癌有預(yù)后價值［14］。

Lynch綜合征占結(jié)直腸癌的3%～5%，是MMR發(fā)生胚系突變所致的常染色體顯性遺傳性疾病，具有患癌風(fēng)險明顯增加、加速的癌變進(jìn)程、發(fā)病年輕化等特點，需要與散發(fā)性結(jié)直腸癌鑒別［10］。對結(jié)直腸癌患者手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行MMR的檢測，可以篩查Lynch綜合征患者和家族成員，避免漏診。近期國內(nèi)外指南和共識推薦結(jié)直腸癌患者進(jìn)行MMR免疫組織化學(xué)或MSI的檢測，篩查Lynch綜合征［3，7］。MMR的檢測對外科決策較為重要，對于年輕的Lynch綜合征相關(guān)結(jié)直腸癌患者，推薦擴(kuò)大結(jié)腸切除范圍［15］。在15%散發(fā)性結(jié)直腸癌中，MLH1啟動子甲基化失活是其主要的發(fā)生機(jī)制，臨床特征與Lynch綜合征相似，腫瘤多位于右半結(jié)腸，病理分期以Dukes B期為主，病理形態(tài)以隆起型多見，MLH1表達(dá)缺失率高于MSH2等，需要與Lynch綜合征鑒別［3，7］。

MMR在Ⅱ/Ⅲ期結(jié)直腸癌患者中可作為預(yù)后較好的生物學(xué)標(biāo)志物［16］。某一MMR基因突變所導(dǎo)致的微衛(wèi)星不穩(wěn)定增高（MSI-H），預(yù)示對氟尿嘧啶化療缺乏敏感性，不能從中受益［17］。結(jié)直腸癌的免疫治療中，dMMR/MSI-H是預(yù)測抗PD-1單抗療效的標(biāo)志物。2017版NCCN指南中首次將免疫檢查點抑制劑PD-1單抗pembroli?zumab和nivolumab推薦用于具有dMMR/MSI-H分子表型的結(jié)直腸癌的末線治療［18］。MMR基因突變檢測為Lynch綜合征診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但因費用較貴限制了其臨床應(yīng)用。患者的手術(shù)標(biāo)本先進(jìn)行MMR免疫組織化學(xué)法檢測，根據(jù)結(jié)果再確定是否進(jìn)行基因種系突變的檢測［19］。一項回顧性研究顯示，免疫組織化學(xué)聯(lián)合檢測MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白缺失的敏感度為77%～100%，特異性為98%～100%，與MSI檢測相當(dāng)［20］。另一項系統(tǒng)回顧研究表明，在結(jié)直腸癌患者中篩查Lynch綜合征，MSI檢測的敏感度為66.7%～100.0%，特異性為61.1%～92.5%。免疫組織化學(xué)法檢測的敏感度為80.8%～100.0%，特異性為80.5%～91.9%。兩種檢測方法均可較好地用于Lynch綜合征的篩查［19］。因此，免疫組織化學(xué)法檢測可作為MMR缺失分析的首選篩選方法，達(dá)到初步篩選Lynch綜合征患者的目的［20］。

綜上所述，MMR蛋白檢測的應(yīng)用，為結(jié)直腸癌患者及時篩查發(fā)現(xiàn)、治療及隨訪Lynch綜合征相關(guān)惡性腫瘤提供了簡便有效的方法，由此可降低患癌的風(fēng)險，不斷提高人類健康水平。