基于泡騰輔助脂肪酸形態(tài)轉(zhuǎn)化的懸浮固化-分散液液微萃取測定水樣中環(huán)境雌激素

陳 瑾 劉媚媚 曲晉剛

（1.浙江同濟(jì)科技職業(yè)學(xué)院，杭州，311231；2.浙江鴻博環(huán)境檢測有限公司，杭州，311100；3.輝侑（杭州）醫(yī)藥技術(shù)服務(wù)有限公司，杭州，310020）

環(huán)境雌激素（environmental estrogens，EEs）是廣泛分布在環(huán)境中的一類具有雌激素活性的化學(xué)物質(zhì)，根據(jù)來源可分為天然雌激素，如雌酮（E1）、17β-雌二醇（E2）和雌三醇（E3）；與人工合成雌激素，如雙酚S（BPS）、己烯雌酚（DES）和己烷雌酚（HS）等兩大類[1].隨著2013 年歐盟將E2 列入新型污染物名單（Directive 2013/39/EU），EEs 對(duì)水生動(dòng)物的毒性效應(yīng)已經(jīng)引起廣泛關(guān)注.EEs 可以通過人及動(dòng)物排泄物以及工業(yè)廢水進(jìn)入水體環(huán)境中，具有毒性高，難降解的特點(diǎn)，并干擾生殖及代謝系統(tǒng)的正常功能.但是EEs 在水體環(huán)境中濃度極低，檢測之前需對(duì)樣品進(jìn)行富集、濃縮與凈化以降低基質(zhì)影響，提高檢測靈敏度與回收率[2].

目前報(bào)道的環(huán)境水體中EEs 樣品前處理方法有固相萃?。⊿PE）[3]、固相微萃?。⊿PME）[4]、分散液液微萃?。―LLME）、漂浮液滴固化分散液液微萃取技術(shù)（DLLME-SFO）[5]等.固相萃取法（SPE）操作繁瑣，且有機(jī)溶劑消耗量大；固相微萃取法（SPME）所需溶劑極少，但萃取時(shí)間較長，纖維耗材價(jià)格高、易碎、容易超載，成本較高；分散液液微萃取法（DLLME）是一種目前新型的微萃取技術(shù)，集萃取與濃縮于一體，被廣泛應(yīng)用于樣品前處理中，但其萃取溶劑一般為毒性較大的含氯有機(jī)試劑.漂浮液滴固化分散液液微萃取技術(shù)（DLLME-SFO）是對(duì)DLLME 的改進(jìn)，保留了DLLME 簡單、快速、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)使用低毒的長鏈脂肪烴、脂肪醇等作為萃取劑，萃取水相中的目標(biāo)化合物；利用萃取劑低溫固化的特點(diǎn)進(jìn)行回收，因此更加環(huán)境友好，常用于檢測水體中的污染物[6].

本文利用脂肪酸可在親水-疏水形態(tài)間轉(zhuǎn)換的特點(diǎn)，擬建立一種新型泡騰輔助溶劑轉(zhuǎn)換液相微萃取技術(shù)，對(duì)室溫下為液態(tài)的5 種中鏈脂肪酸進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)辛酸除具有優(yōu)秀的萃取回收率外，其低熔點(diǎn)、低密度可以作為萃取劑應(yīng)用于漂浮液滴固化微萃取[7]，結(jié)合HPLC 測定湖水和河水中環(huán)境雌激素的含量.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

GL224i-1SCN 分析天平（賽多利斯，德國）；KH19A 高速離心機(jī)（凱達(dá)，湖南）；KQ-500DE 超聲波清洗儀（舒美，昆山）；LC-20AT 高效液相色譜儀（島津，日本）；C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）（島津，日本）.色譜條件：甲醇:超純水（60:40）；流速1 mL·min-1；檢測波長230 nm；進(jìn)樣體積50 μL；柱溫30 ℃.

雌酮、己烯雌酚和己烷雌酚標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%）購于上海百靈威試劑；色譜級(jí)丙酮、甲醇、乙醇、乙腈、碳酸鈉和濃硫酸購于上海安普試劑公司.

1.2 樣品采集與處理

實(shí)際水樣采集根據(jù)中華人民共和國生態(tài)環(huán)境部頒布的“水質(zhì)-取樣技術(shù)指南”（HJ494-2009）.河流樣本取自杭州市蕭山區(qū)浦陽江.湖泊水樣本取自蕭山區(qū)湘湖.所有水樣經(jīng)0.45 μm 水膜過濾去除懸浮顆粒物，于4oC 保存?zhèn)溆?

1.3 微萃取步驟

準(zhǔn)確量取10 mL 水樣至15 mL 離心管中，加入脂肪酸（144 μL）與飽和碳酸鈉溶液（413 μL），將溶液體系變?yōu)閴A性，脂肪酸轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水形態(tài).加入濃硫酸（238 μL）產(chǎn)生CO2，渦旋（3.3 min），以4000 r·min-1離心5 min，冰浴10 min，此時(shí)萃取劑脂肪酸由于溫度低于凝固點(diǎn)變成固態(tài)，待其融化后取50 μL 用甲醇稀釋至100 μL，吸取50 μL 注入HPLC 進(jìn)行分析檢測.

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步優(yōu)化了H2SO4體積（A），Na2CO3體積（B），脂肪酸體積（C）和渦旋時(shí)間（D）四個(gè)主要影響萃取回收率的因素.通過Design-Expert 8.0.5（Minneapolis,USA）建立4 因素5 水平（-α,-1,0,+1,+α）共22 組的中心實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（CCD）（表1），并以萃取回收率（extraction recovery，ER）[7]評(píng)價(jià)指標(biāo)，共分為2 個(gè)區(qū)組；22 組含8 個(gè)半分點(diǎn)（Nf=2f-1），8 個(gè)星點(diǎn)（Nα=2f）和6 個(gè)中心點(diǎn).

表1 CCD 設(shè)計(jì)的因素和水平Table 1 Factors,symbols and levels for the CCD

1.5 計(jì)算結(jié)果

通過決定系數(shù)、線性范圍、檢出限、精密度和萃取回收率（ER）對(duì)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，回收率計(jì)算公式如下：

式中，Cfound為實(shí)際樣品中目標(biāo)物濃度；Creal為空白對(duì)照中目標(biāo)物濃度；Cadded為實(shí)際樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)品后目標(biāo)物濃度.

2 結(jié)果與討論

2.1 5 種脂肪酸以及pH 調(diào)節(jié)劑對(duì)目標(biāo)環(huán)境雌激素的萃取

低毒、難溶于水、易溶于分散劑、密度比水輕且熔點(diǎn)低于室溫是DLLME-SFO 萃取溶劑選擇的標(biāo)準(zhǔn)，基于此，本文選擇戊酸（-20 ℃）、己酸（-4 ℃）、庚酸（-10.5 ℃）、辛酸（16 ℃）、壬酸（12.4 ℃）這5 種中鏈脂肪酸作為萃取溶劑.5 種中鏈脂肪酸在堿性體系溶液中，可轉(zhuǎn)化為親水形態(tài)，提高萃取效率，利用其低溫固化的特點(diǎn)可實(shí)現(xiàn)懸浮固化微萃取.5 種中鏈脂肪酸對(duì)3 種目標(biāo)環(huán)境雌激素的萃取回收率結(jié)果表明,戊酸、己酸和庚酸回收率較低；壬酸僅對(duì)E1 的回收率較高（～100%），對(duì)其他2 種EEs 回收率都較低；辛酸對(duì)3 種目標(biāo)EEs 回收率都較高（～90%）.戊酸、己酸和庚酸熔點(diǎn)均低于0℃，在水相中低溫固化不完全，影響萃取效率；由于DES 和HS 的極性大于E1，壬酸對(duì)E1 的萃取效率要高于DES 和HS，辛酸極性大于壬酸，根據(jù)相似相溶原理，辛酸對(duì)DES 和HS 的萃取效率要高于壬酸，所以辛酸對(duì)3 種目標(biāo)EEs 回收率都較高.

以碳酸鈉和碳酸氫鈉為堿性調(diào)節(jié)劑，硫酸與鹽酸為酸性調(diào)節(jié)劑進(jìn)行篩選.本實(shí)驗(yàn)選擇碳酸鈉和硫酸作為pH 調(diào)節(jié)劑（回收率91.1%）.是因?yàn)槌叵绿妓徕c在水中溶解度約為碳酸氫鈉3 倍，相同體積的飽和溶液中碳酸鈉物質(zhì)的含量更高，pH 調(diào)節(jié)能力更強(qiáng)，其與酸產(chǎn)生的CO2更多，使萃取劑與樣品接觸更加充分，更好的提高萃取回收率.

2.2 實(shí)驗(yàn)條件篩選

3D 曲面圖和等高線（圖1）顯示了H2SO4體積、Na2CO3體積、脂肪酸體積和渦旋時(shí)間與回收率之間相互關(guān)系.最終確定的最優(yōu)萃取條件為：H2SO4體積238 μL、Na2CO3體積413 μL、脂肪酸體積144 μL 和渦旋時(shí)間3.3 min.

圖1 CCD 設(shè)計(jì)響應(yīng)結(jié)果Fig.1 3D response surface and contour plots of CCD

2.3 方法評(píng)價(jià)

在最優(yōu)萃取條件下，各物質(zhì)的性能分析見表2.穩(wěn)定性評(píng)價(jià)結(jié)果表明，3 種目標(biāo)環(huán)境雌激素的日內(nèi)RSD 范圍為1.2%—6.2%；日間RSD 范圍為2.5%—6.6%.

表2 前處理方法的分析性能Table 2 The analytical performance of pre-treatment method

2.4 實(shí)際樣品分析

采用本文的一種新型泡騰輔助溶劑轉(zhuǎn)換液相微萃取技術(shù)對(duì)實(shí)際水體樣品進(jìn)行檢測.在實(shí)際樣品檢測分析中，加標(biāo)濃度為50 μg·L-1，3 種目標(biāo)物質(zhì)峰型優(yōu)異，分離度好，無雜質(zhì)峰干擾，可以準(zhǔn)確地進(jìn)行定性及定量分析.表3 結(jié)果顯示，3 種目標(biāo)雌激素在湖水和河水中的相對(duì)回收率范圍分別是91.0%—101.5%,89.0%—101.0%；在湖水和河水空白樣品中分別測得E1 的濃度為0.5 μg·L-1和1.2 μg·L-1.

表3 微萃取前處理技術(shù)的性能分析（n=6）Table 3 Analytical performance for the proposed microextraction method（mean ± SD,n=6）

3 結(jié)論

本研究利用辛酸可以在親水-疏水形態(tài)間轉(zhuǎn)化及低溫下固化的特點(diǎn)，建立了脂肪酸形態(tài)轉(zhuǎn)化液液微萃取技術(shù)來測定湖水和河水中環(huán)境雌激素.通過中心實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到最優(yōu)萃取條件：H2SO4體積238 μL、Na2CO3體積413 μL、脂肪酸體積144 μL 和渦旋時(shí)間3.3 min.以此最佳萃取條件對(duì)湖水和河水樣品中3 種EEs 含量進(jìn)行測定，取得了良好的線性范圍、決定系數(shù)、檢測限、定量限，以及日內(nèi)和日間精密度，在環(huán)境水樣微量EEs 的分析中具有良好的前景.