土一枝蒿藥材指紋圖譜和含量測(cè)定研究*

金倩倩，劉理燕，汪 洋，蔣良?jí)?，孫 佳，鄭 林，王永林，△

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)民族藥與中藥開(kāi)發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心·省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004）

土一枝蒿為菊科植物云南蓍Achillea wilsonianaHeimerl ex Hand.-Mazz.新鮮或干燥的地上部分，又名飛天蜈蚣、野一枝蒿等，主要產(chǎn)于云南、四川、貴州等地，具有解毒利濕、活血止痛等功效，可用于頭風(fēng)痛、牙痛、風(fēng)濕痹痛、血瘀經(jīng)閉、腹部痞塊、跌撲損傷、蛇蟲(chóng)咬傷、癰腫瘡毒等的治療[1-3］。土一枝蒿是貴州省少數(shù)民族用藥，收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003年版），其中僅對(duì)其性狀及顯微特征進(jìn)行了規(guī)定[4］，相關(guān)文獻(xiàn)也較缺乏。因此，本研究中參照2020年版《中國(guó)藥典（四部）》對(duì)土一枝蒿藥材水分、總灰分、水溶性浸出物進(jìn)行含量測(cè)定，并通過(guò)高效液相色譜（HPLC）法對(duì)不同產(chǎn)地和批次的土一枝蒿藥材進(jìn)行指紋圖譜研究及3種主要成分的含量測(cè)定，以期為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ultimate3000型高效液相色譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），包括Chromeleon色譜數(shù)據(jù)工作站、系統(tǒng)控制器、柱溫箱、低壓梯度組件、輸液泵、脫氣組件、樣品室、自動(dòng)進(jìn)樣器、UV-DAD檢測(cè)器；AE240型十萬(wàn)分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

異葒草素對(duì)照品、異牡荊苷對(duì)照品、槲皮素-4'-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品（均為從土一枝蒿藥材中提取分離制備所得，含量均大于98.0%）；乙腈為色譜純；其余試劑為分析純；水為超純水。土一枝蒿藥材12批（來(lái)源及批號(hào)見(jiàn)表1），經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥實(shí)驗(yàn)室孫慶文教授鑒定為菊科蓍屬植物土一枝蒿的干燥全草。

表1 藥材樣品來(lái)源Tab.1 Source information of Achillea wilsoniana samples

2 方法與結(jié)果

2.1 水分、灰分、浸出物含量測(cè)定

參照2020年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0832水分測(cè)定法中的第二法（烘干法）、通則2302灰分測(cè)定法和通則2201項(xiàng)下水溶性浸出物測(cè)定法進(jìn)行相應(yīng)含量測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 藥材樣品水分、總灰分、水溶性浸出物含量測(cè)定結(jié)果（%，n=2）Tab.2 Results of content determination of moisture，total ash and water-soluble extract of Achillea wilsoniana samples（%，n=2）

2.2 HPLC指紋圖譜的建立與分析

2.2.1 色譜條件

色譜柱：CAPCELLPAKC18MGⅡ（S-5）柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～45 min時(shí)13%A，45～46 min時(shí)13%A→14%A，46～76 min時(shí)14%A，76～77 min時(shí)14%A→15%A，77～107min時(shí)15%A→20%A，107～113min時(shí)20%A→65%A）；流速：0.7 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：365 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2.2 溶液制備

取異葒草素、異牡荊苷、槲皮素-4'-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品各適量，精密稱定，用甲醇溶解制成質(zhì)量濃度分別為1.101，1.580，1.346 mg/mL的單一對(duì)照品貯備液；分別精密量取12.5，5，5 mL，置同一25 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為0.550 5，0.316 0，0.269 2 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。取藥材樣品粉末1.0 g，過(guò)3號(hào)篩，精密稱定，置50 mL具塞三角瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率200 W，頻率40 kHz）處理15 min，放冷至室溫，再次稱定質(zhì)量，加70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上層液，12 000 r/min離心10 min，取上清液，即得供試品溶液。以甲醇為空白對(duì)照溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取藥材樣品（編號(hào)S1）適量，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以異紅草素峰（5號(hào)峰）為參照峰，計(jì)算14個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果的RSD分別小于0.50%，3.00%（n=6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2.2項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S1），分別于室溫下放置0，4，8，18，20，24 h時(shí)按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以異紅草素峰（5號(hào)峰）為參照峰，計(jì)算14個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果的RSD分別小于0.50%，3.00%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取藥材樣品（編號(hào)S1）適量，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6份，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以異紅草素峰（5號(hào)峰）為參照峰，計(jì)算14個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果的RSD分別小于1.00%，2.00%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.4 指紋圖譜建立與相似度評(píng)價(jià)

指紋圖譜建立：取10批藥材樣品各適量，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，將10批藥材樣品的HPLC數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012年130723版），利用中位數(shù)法進(jìn)行多點(diǎn)校正，生成10批藥材樣品的HPLC疊加指紋圖譜（圖1）及共有模式的對(duì)照指紋圖譜（圖2），共確定了14個(gè)共有峰。通過(guò)與混合對(duì)照品溶液圖譜（圖3）比對(duì)，確認(rèn)5號(hào)峰為異葒草素，10號(hào)峰為異牡荊苷，12號(hào)峰為槲皮素-4'-O-β-D-葡萄糖苷。

圖1 10批藥材樣品高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.1 Superimposed HPLC fingerprints of 10 batches of Achillea wilsoniana samples

圖2 高效液相色譜對(duì)照指紋圖譜Fig.2 HPLC reference fingerprint

圖3 混合對(duì)照品溶液高效液相色譜圖5.Isoorientin 10.Isovitexin 12.Quercetin-4'-O-β-D-glucosideFig.3 HPLC chromatogram of mixed reference solution

相似度評(píng)價(jià)：以共有模式為對(duì)照?qǐng)D譜，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012年130723版）計(jì)算10批樣品的相似度。結(jié)果S1～S10藥材樣品相似度依次為0.987，0.997，0.957，0.986，0.941，0.995，0.987，0.995，0.993，0.988，表明不同產(chǎn)地、不同批次樣品的相似度較好。

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取2.2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白對(duì)照溶液適量，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液中異葒草素、異牡荊苷、槲皮素-4'-O-β-D-葡萄糖苷色譜峰保留時(shí)間與對(duì)照品色譜峰一致，各成分分離度均大于1.5，理論板數(shù)均大于15 000，且空白對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖4。

圖4 高效液相色譜圖1.Isoorientin 2.Isovitexin 3.Quercetin-4'-O-β-D-glucoside A.Mixed reference solution B.Test solution C.Blank control solutionFig.4 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密量取2.2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，逐級(jí)稀釋成不同質(zhì)量濃度的系列混合對(duì)照品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，異葒草素為Y1=402.56X1+0.230 5（r=0.999 9）、異牡荊苷為Y2=303.68X2+1.314 5（r=0.999 5）、槲皮素-4'-O-β-D-葡萄糖苷為Y3=309.48X3+0.102 0（r=0.999 8）。結(jié)果表明，異葒草素、異牡荊苷、槲皮素-4'-O-β-D-葡萄糖苷質(zhì)量濃度分別在12.55～200.82μg/mL、7.20～115.28μg/mL、6.14～98.20μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)S1）適量，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果異葒草素、異牡荊苷、槲皮素-4'-O-β-D-葡萄糖苷峰面積的RSD分別為0.82%，0.81%，2.12%（n=6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2.2項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S1），分別于室溫下放置0，4，8，18，20，24 h時(shí)按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果異葒草素、異牡荊苷、槲皮素-4'-O-β-D-葡萄糖苷峰面積的RSD分別為0.54%，0.67%，2.05%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取藥材樣品（編號(hào)S1）適量，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6份，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果異葒草素、異牡荊苷、槲皮素-4'-O-β-D-葡萄糖苷峰面積的RSD分別為1.78%，1.95%，2.24%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量藥材樣品粉末（編號(hào)S1）約0.5 g，精密稱定，各6份，分別加入異葒草素、異牡荊苷、槲皮素-4'-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品0.741 5，0.254 3，0.182 5 mg，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of the recovery test（n=6）

2.3.2 藥材樣品含量測(cè)定

取各批藥材樣品粉末約1.0g，精密稱定，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中3種待測(cè)成分含量。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 藥材樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=2）Tab.4 Results of the content determination of three components in 10 batches of Achillea wilsoniana samples（mg/g，n=2）

3 討論

3.1 樣品提取方法選擇

預(yù)試驗(yàn)中分別考察了提取溶劑（30%甲醇、70%甲醇、甲醇、30%乙醇、70%乙醇、乙醇、水）、提取時(shí)間（15，30，45 min）、提取方式（超聲、回流）對(duì)提取效果的影響，在考慮供試品制備方法的高效、簡(jiǎn)單、方便操作等因素前提下最終確定，提取溶劑為70%甲醇、超聲處理15 min為最佳提取方法。

3.2 色譜條件優(yōu)化

預(yù)試驗(yàn)中對(duì)不同檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)各待測(cè)成分在330，350，365 nm波長(zhǎng)處有較大吸收，但在330，350 nm波長(zhǎng)處有雜質(zhì)峰干擾，且基線分離效果不如365 nm，故最終選擇365 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)；比較了不同色譜柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)MGⅡC18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）具有較高柱效，能較好地分離待測(cè)成分與雜質(zhì)峰；流動(dòng)相考察了乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-水、乙腈-水，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，各色譜峰的峰形及分離度較好；還考察了不同柱溫（30℃、35℃、40℃）及流速（0.7，0.8，1.0 mL/min），發(fā)現(xiàn)30℃為分析檢測(cè)的最佳柱溫，流速為0.7 mL/min時(shí)色譜峰分離效果優(yōu)于0.8 mL/min及1.0 mL/min，故可確定最佳色譜條件。

3.3 結(jié)果分析

有文獻(xiàn)報(bào)道，土一枝蒿藥材中主要含有萜烯類，生物堿類等化學(xué)成分，具有抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、抗菌、血管保護(hù)等藥用價(jià)值[5-13］。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)尚未見(jiàn)其質(zhì)量控制相關(guān)研究報(bào)道，在《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003年版）中僅以土一枝蒿藥材的性狀及顯微鑒別作為質(zhì)量控制指標(biāo)，不能全面控制藥材的質(zhì)量。因此，本試驗(yàn)中對(duì)土一枝蒿藥材進(jìn)行了指紋圖譜及含量測(cè)定的研究，結(jié)果表明，10批不同產(chǎn)地和不同批次土一枝蒿藥材相似度均大于0.940，說(shuō)明貴州省內(nèi)各產(chǎn)地的藥材質(zhì)量均一性較高。水分與浸出物含量相對(duì)總灰分含量而言差異較小，范圍較寬，說(shuō)明貴州省不同產(chǎn)地的土一枝蒿藥材中無(wú)機(jī)成分、雜質(zhì)、泥沙含量差異較大。不同產(chǎn)地的樣品含量存在差異，其中S4樣品中異葒草素、異牡荊苷、槲皮素-4'-O-β-D-葡萄糖苷含量較低，S5樣品含量較高，除這兩批藥材外，其余8批土一枝蒿藥材中3種成分含量較均衡。由以上結(jié)果可知，藥材成分含量差異與產(chǎn)地的差異有一定相關(guān)性。

綜上所述，本研究中建立的HPLC指紋圖譜及含量測(cè)定的方法簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確可靠，樣品的收集具有一定代表性，可為土一枝蒿藥材的質(zhì)量控制提供參考。